MM_FS_CNJ_0139 出口肉及肉制品中丙硫咪唑残留量检验方法

MM_FS_CNJ_0139出口肉 肉制品 丙硫咪唑 残留量 高压液相色谱法

MM_FS_CNJ_0139

     出口肉及肉制品中丙硫咪唑残留量检验方法

1.适用范围

    本方法适用于出口猪肉中丙硫咪唑残留量的检验。

2.原理概要

    2.5g均匀试样于6NHCl中水解，用碳酸钠调节pH≥8.0，用乙酸乙酯提取。将丙硫咪唑代谢物和内标反提取到1NHCl内。于Sep-Pak柱中净化后，浓缩至干，残渣重新溶解于流动相中，用具荧光检测器的HPLC进行定量。

3.主要试剂和仪器

3.1.主要试剂

    5-(丙硫酰)-1H苯并咪唑-2-胺：标准品，纯度＞99%；

    5-(丁硫酰)-1H苯并咪唑-2-胺：内标，纯度＞99%；

    浓盐酸：分析纯；

    二甲亚砜(DMSO)：经玻璃仪器蒸馏；

    乙酸乙酯：经玻璃仪器蒸馏；

    甲醇：经玻璃仪器蒸馏；

    甲苯：经玻璃仪器蒸馏；

    乙腈：经玻璃仪器蒸馏；

    二乙醇胺；

    无水碳酸钠：粉末状，分析纯；

    磷酸二氢钾：分析纯；

    无水磷酸氢二钾：分析纯；

    水：去离子水；

    氮气：纯度≥99.99%；

    标准储备溶液

    称取10.0mg 5-(丙硫酰)-1h苯并咪唑-2-胺于100mL容量瓶内，用DMSO溶解并稀释至刻度(100μg/mL)；

    称取10.0mg 5-(丁硫酰)-1h苯并咪唑-2-胺于100mL容量瓶内，用DMSO溶解并稀释至刻度(100μg/mL)；

    标准工作溶液

    移取2.0mL储备溶液及8.0mL DMSO入一15mL具玻塞离心管内，以涡式混匀器混匀，制得20μg/mL溶液(2.5g试样中加入50μL此溶液，含量相当于400μg/kg)；

    移取5.0mL工作溶液及5.0mL DMSO入一15mL具玻塞离心管内，以涡式混匀器混匀，制得10 μg/mL溶液2.5g试样中加入50μL此溶液，含量相当于200μg/kg)；

    移取5.0mL工作溶液及5.0mL DMSO入一15mL具玻塞离心管内，以涡式混匀器混匀，制得5μg/mL溶液 (2.5g试样中加入50μL此溶液，含量相当于100μg/kg)；

    移取1.0mL储备溶液及9.0mL DMSO入一15mL具玻塞离心管内，以涡式混匀器混匀，制得10μg/mL溶液 (2.5g试样中加入50μL此溶液，含量相当于200μg/kg)；

    所有标准溶液均应保存于冰箱内，标准在DMSO溶液中至少可以稳定6个月。因为在此条件下DMSO会发生凝结，所以使用前需要将离心管放于装有温水的烧杯内，使标准溶液重新液化，以涡式混匀器混匀。

3.2.仪器

    液相色谱仪并配备荧光检测器；

    微量注射器：10μL，50μL；

    保护柱：CO：PELL ODS，2mm(内径)×5cm；

    微孔过滤器：0.2μm，0.45μm滤膜；

    玻璃刻度离心管：具磨口塞，15mL；

    离心机；

    捣碎机；

    吸移管；

    pH计；

    涡式混匀器；

    真空抽滤器。

4.试样的抽取与制备

4.1.检验批

    以不超过2500件为一检验批。

    同一检验批的商品应具有相同特征，如包装、标记、产地、规格和等级等。

4.2.抽样数量

4.3.抽样方法

    按规定的抽样件数随机抽取，逐件开启。每件至少取一袋作为原始样品，原始样品总量不少于2kg，放入清洁容器内，加封后，标明标记，及时送实验室。

4.4.试样制备

    从每袋原始样品中取出部分有代表性样品，将可食部分放入高速组织捣碎机中捣碎均匀，充分混匀，用四分法缩分出不少于500g，装入洁净容器内，加封后，标明标记。

4.5.试样保存

    将试样于－18℃冷冻保存。

注：在抽样和制样过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。

5.过程简述

5.1.提取和净化

    取试样代表性部位，以捣碎机进行充分匀化。匀化后的试样在分析前一直冷冻保存。

    将一去皮重的烧杯置于天平上，烧杯中放一50mL玻璃离心管(未加塞)，用粗管尖吸移管取样，称取2.5±0.05g均匀试样，置于离心管底部。如此分别制备四份空白组织试样，及一份对照试样，三份添加标准的试样。在对照试样中加入100μL纯DMSO。在疑有丙硫咪唑残留物的组织试样中加入50μL DMSO。在空白组织试样和疑有丙硫咪唑的组织试样中分别加入50μL工作溶液)。然后，在已加入50μL工作溶液的三个空白组织试样中分别加入50μL工作溶液。

注：应将添加溶液加于50mL管内刚好浸没均匀试样，以便下一步加入HCl时确保有足够的溶液。

    在上步制备的每一试样中加入2.5mL6NHCl，盖好每支管，然后将试样管(用另一试管架固定，以防塞子突然跳出)放到预先调至110±4℃的烘箱内。

    在1h后，把试样从110±4℃的烘箱中取出，将试样管放于干冰或冰上约5min，冷却至室温。

    向每个试样中加入2.0mL水，然后以涡式混匀器混匀试样，用pH计监测pH值。慢慢加入足量(约1.23g)的碳酸钠，加入时间约需4～5min，以免起泡或结块，调节pH至8～9.5(将洁净的pH电极直接放入试样中测定。记录pH值后，在离心管内壁上轻轻接触去掉电极上的液滴。将整个电极从试样管中取出，用水冲洗，擦干后再测定下一个试样)。

注：室温或接近室温的试样，加入碳酸钠时象较冷试样那样不会产生泡沫，因此，加入碳酸钠时可以快些。

    向每个试样内加入15mL乙酸乙酯，盖上塞子，平放于试管架上，振摇5min。然后取下塞子，于约4000r/min将试样离心5min。

    用吸移管将乙酸乙酯提取液转入另一50mL玻璃离心管内，应尽量转移完全。注意不要带走水相。

    重复操作上两步，再次提取每个试样，把相应的提取液合并于各自的50mL玻璃离心管内。

    向每个合并的乙酸乙酯提取液中加入4.0mL 1NHCl，盖上塞子，平放于试管架上，振摇5min。取下塞子，然后于4000r/min左右离心5min。

    尽量完全吸去乙酸乙酯相，注意不要带走水相。在35±5℃水浴上蒸去水溶液上残留的乙酸乙酯(＜1mL)。(必要时，可在此步骤停止分析操作，而放置过夜。)

    以涡式混匀器将每一试样混匀，同时慢慢加入足量(约0.33g)碳酸钠，加入时间约需1～2min，以免起泡或结块。用pH计监测pH值，每个试样的pH值应为8～9.5。

    向每个试样中加入20mL甲苯，盖上塞子，平放于试管架上，振摇5min，取下塞子，于4000r/min左右将试样离心5min。

    尽量完全吸去甲苯相，注意不要带走水相。在35±5℃的水浴上蒸去水相上残留的甲苯(＜1mL)。(必要时可在此步骤停止分析操作，而放置过夜。)

    对于每一个试样，相对应将一10mL玻璃注射器(圆柱形推液塞要取下)用夹子固定在环形架上。注射器的路氏接头前端连接SEP-PAKc18柱体。

    将每支柱用2mL甲醇预洗，而后用2mL0.2m磷酸钾缓冲溶液(pH8.0)洗涤。加入每种试剂后，经过安装于注射器顶部的橡皮塞缓缓通入氮气，利用氮气压力使试剂穿过柱体。当氮气开始出柱时即停气。氮气流速约1～2mL/min。弃去洗脱液。

    从蒸甲苯步骤中得到的每一试样水相转入预先洗涤好的各注射器柱系统内。用步骤的方法，应用氮气使溶液流经柱体洗提，然后各取每一试样管水洗液1mL(经涡式混匀器混匀)，使用巴氏吸移管采用类似方法将水洗液分别转入各注射器柱系统内，弃去洗脱液。

    再取每个试样管水洗液1mL(经涡式混匀器混匀)，分别转入各注射器柱系统内，按上面方法应用氮气使此水洗液流经柱体洗提，弃去洗脱液。

    向每一注射器柱系统内分别加入2mL甲苯，按上面的方法用氮气使甲苯流经柱体洗提，弃去洗脱液。

    在每一注射器柱系统下面分别放置一15mL离心管，向每个柱系统内加入2mL乙酸乙酯按上面方法用氮气使乙酸乙酯流经柱体进行洗脱。在这部分洗脱液中含有待测化合物。

    向上步中得到的每份洗脱液中分别加入约0.5mL甲醇，以涡式混匀器混匀，以得到均匀的溶液。

    于35±5℃的水浴上在干燥氮气下将上步得到的洗脱液浓缩至干。

    至干后，加入0.5mL水-甲醇溶液(70＋30)，以涡式混匀器混匀，重新溶解残渣。

    30min后，将每个重新溶解的试样加入微量过滤装置内，采用0.2μm再生纤维素滤膜过滤。然后将每个过滤器及试样提取液于4000r/min左右离心5～10min。

    将滤液转入15mL具塞玻璃离心管内，用水-甲醇(70＋30)调节每一滤液体积为0.5mL。使用硅烷化管有助于将提取液浓缩于管的底部。以涡式混匀器混匀后移取0.1mL供HPLC分析。

5.2.测定

5.2.1.液相色谱条件

色谱柱：μBondapakc18柱，30cm×3.9mm内径；

流动相：68% 0.02M KH₂PO₄∶0.01M二乙醇胺(200Ml 0.1 M KH₂PO₄＋1.05g二乙醇胺，加水至1l)；

20%甲醇；

12%乙腈；

该溶液当日新配，使用前用0.45μm滤膜过滤，并用真空系统抽气；

流速：1.8mL/min；

温度：室温。

5.2.2.色谱测定

    先将激发波长和发射波长分别调节在300nm和320nm，狭缝宽度≤10nm。设置合理的基线灵敏度，注入适量试样(20μL)，然后观察标准和内标响应峰的强度。若需更好的灵敏度，则进行如下步骤：

    在观察检测器吸收响应时，在5nm以内调节激发波长，以减小本底零值。如上再次进样，确定欲测化合物的信号响应是否增加。按此程序继续选择最佳激发波长和发射波长，直至得到合适的分析信噪比(s/n≥25/1)。

    在上述条件下，其保留时间：丙硫咪唑代谢物约4.3min，内标约7.0min。

6.结果计算

    若没有积分仪，则可以用峰高值和峰高比来代替下面所讨论的峰面积和峰面积比。

    对于每个试样提取液，HPLC测定所得丙硫咪唑代谢物的峰面积除以内标的峰面积，得到峰面积比。

    在直角坐标上，以峰面积比为纵坐标，以对照试样加入标准的μg/kg值为横坐标作工作曲线。根据曲线得回归方程。由回归方程从未知试样的峰面积比按下式直接计算丙硫咪唑代谢物的μg/kg值：

式中：X——待测试样中丙硫咪唑代谢物的浓度，μg/kg；

Y——待测试样提取液的峰面积比；

b——回归方程的截距；

m——回归方程的斜率。

7.低限和回收率的测定

7.1.测定低限：25μg/kg。

7.2.回收率

    回收率的实验数据：丙硫咪唑代谢物浓度范围0.05～0.20mg/kg时，回收率为86.9%～93.25%。

8.来源：

    SN  0207—93