MM_FS_CNJ_0138出口肉 肉制品 柱晶白霉素 残留量 杯碟法
MM_FS_CNJ_0138
出口肉及肉制品中柱晶白霉素残留量检验方法
1.适用范围
本方法适用于出口猪肉中柱晶白霉素残留量的检验。
2.原理概要
用磷酸盐缓冲液(pH8.0±0.1)提取试样中柱晶白霉素残留,离心分层,取上清液,使与藤黄八叠球菌作用,进行杯碟法检测,用标准曲线法定量。
3.主要试剂和仪器
3.1.主要试剂
磷酸盐缓冲液(pH8.0±0.1):精确称取13.3g无水磷酸二氢钾,溶解于900mL水中。另取6.2g氢氧化钾,溶解于100mL水中。将二者混合均匀,121℃高压灭菌15min;
生理盐水:称取8.5g氯化钠,溶解于1000mL水中,121℃高压灭菌15min;
柱晶白霉素标准品:1562IU/mg,由中国兽药监察所提供,密封避光,防潮保存在4℃冰箱中;
试验菌种:藤黄八叠球菌(Sarcinalutea),由卫生部药品生物制品检定所提供,菌号28001;
营养肉汤:见附录A中A1;
保存用培养基:见附录A中A2;
基层及菌种层用培养基:见附录A中A3;
柱晶白霉素标准储备液:称取柱晶白霉素标准品mg(精确至0.1mg),用水溶解并定容至100mL,配制成1000 IU/mL的标准储备液,于4℃冰箱保存,可使用4天;
柱晶白霉素标准工作液:取一定量柱晶白霉素标准储备液,用磷酸盐缓冲液(pH8.0±0.1)配制成0.100,0.312,0.625,1.250,2.500,5.000IU/mL的溶液,作为制备标准曲线的标准工作液,其中1.250IU/mL的溶液作为参考浓度溶液。以上标准工作液均须当日配制。
3.2.仪器
培养皿:玻璃或塑料皿,内径为90mm,底部平整光滑,具陶瓦盖;
牛津杯:不锈钢管,内径(6±0.1)mm,外径(8±0.1)mm,高度(10±0.1)mm;
游标卡尺:测量范围0~200mm,精度0.02mm;
绞肉机;
均质器:转速不低于10000r/min;
离心机:转速不低于4000r/min;
恒温箱:(36±1)℃,搁板必须保持水平;
高压灭菌器;
电热烤箱:(170±1)℃;
恒温水浴锅;
其他:玻璃板、移液管、滴管、离心管等。
4.抽样和制样
4.1.检验批
以不超过2500件为一检验批。
同一检验批的商品应具有相同特征,如包装、标记、产地、规格和等级等。
4.2.抽样数量
批量,件 | 最低抽样数,件 |
1~25 | 1 |
26~100 | 5 |
101~250 | 10 |
251~500 | 15 |
501~1000 | 17 |
1001~2500 | 20 |
4.3.抽样方法
按规定的抽样件数随机抽取,逐件开启。每件至少取一袋作为原始样品,如无小包装或小包装大于2kg,则用灭菌刀具从取出的包装中,每件割取不少于100g作为原始样品。原始样品总量不少于2kg,混合后放入清洁容器内,加封,标明标记,及时送交实验室。
4.4.试样制备
从原始样品中取出部分代表性样品,将可食部分放入绞碎机中绞碎,充分混匀,用四分法缩分至不少于500g作为试样。装入清洁容器内,加封后,标明标记。
4.5.试样保存
将试样于-18℃以下冷冻保存。
注:在抽样及制样的操作过程中,必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
5.过程简述
5.1.样液制备
称取10g(精确至0.1g)试样于均质器内,加入磷酸盐缓冲液(pH8.0±0.1)10.0mL,搅匀,放置60min,以9000~10000r/min均质2min后,移入离心管中离心30min(4000r/min),取上清液作为样液。
5.2.菌悬液的制备
将试验菌种用营养肉汤于32~35℃培养18~24h后,转接至琼脂试管斜面,于32~35℃培养18~24h,然后加入适量灭菌生理盐水,将菌苔洗下,制成菌悬液。在4℃保存,可使用2周。
5.3.菌悬液用量的确定
制作检定平板前应先用0.312IU/mL标准工作液对加有不同量菌悬液的平板进行预测试,经培养后能产生直径≥10mm清晰、完整的抑菌圈的最佳菌悬液用量。
5.4.平板制备
于无菌平皿中加入20mL熔化的培养基,保持水平,待其凝固。然后,将锥形瓶中培养基熔化并冷却至45~50℃,加入适量(从5.3预测得)的菌悬液(5.2),充分混合,取4mL注入上述基层培养基上,均匀覆盖其表面,保持水平,待其凝固。
5.5.标准曲线的制备
按照SN 0179—92中的6.1进行。
5.6.测定
每个试样用三个检定平板。如不需定量测定时,在每个平板上,置4只灭菌的牛津杯,对角2只注满样液,剩余的2只分别注满1.250和0.312 IU/mL柱晶白霉素标准工作液;如需定量时,须置6只灭菌的牛津杯,间隔注满样液和1.250 IU/mL(作为参考浓度溶液)柱晶白霉素标准工作液,于(36±1)℃培养(17±1)h。
注:如测定结果呈阳性,即所显抑菌圈的平均直径≥10mm时,必要时,尚需进行确证试验(可用薄层色谱法),以证明抑菌物确系柱晶白霉素。
6.结果计算
如样液抑菌圈的直径<10mm,即报告为“阴性”。如样液抑菌圈的平均直径≥10mm者,则分别测量及算出三个检定平板上1.250 IU/mL标准工作液和样液的抑菌圈直径的平均值。经校正后,于标准曲线上查出样液中相应的柱晶白霉素浓度值。通过式(1),可得出试样中柱晶白霉素的含量:
X= | c | …………………………(1) |
m |
式中:X——试样中柱晶白霉素含量,IU/g;
c——由标准曲线上查得样液中柱晶白霉素浓度,IU/mL;
m——每毫升最终样液所代表的试样量,g。
注:如试样中柱晶白霉素含量以mg/kg表示时,可将式(1)所计算得的X值乘以1000/t,t为柱晶白霉素标准品以IU/mg计的效价。
7.测定低限、回收率
7.1.测定低限
本方法的测定低限为0.312IU/g。
7.2.回收率
回收率的实验数据:
柱晶白霉素添加浓度在0.312 IU/g时,回收率为87.7%;
柱晶白霉素添加浓度在0.800 IU/g时,回收率为83.7%;
柱晶白霉素添加浓度在1.000 IU/g时,回收率为84.3%。
8.来源:
SN 00—1996
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