分子生物学

第一章 中心法则导论

科学预见→分子生物学诞生 一、中心法则的提出和修正

遗传物质：⑴能的自我复制，⑵对细胞的特异性有高度影响。 1958年 Crick提出： 要点：⑴遗传信息；⑵信息的流动是单程的；⑶序列假说。

1970 Temin：Nature《Central Dogma Reverse》 二、挑战

㈠蛋白质的遗传信息不一定来自核酸

⑴以蛋白质为模板的肽链合成 ⑵遗传信息的翻译后加工

① 切割，糖基化；② 两段C端均切去一段小肽；③ 原来的N端和C端连接。 非DNA信息的加工过程 ⑶朊病毒(Prion)

Kuru. CJD Scrapie mad cow disease 引起动物神经系统软化，共济失调 蛋白质性质 PrP 两种形式：

PrPc 正常 PrPsc 异常 被蛋白酶降解 抗蛋白酶

可溶 不溶 α螺旋40% α螺旋 20%，β螺旋50%

相互关系：PrPc↓→PrPsc↑（转化）

种间障碍：

正常内源性PrPc是病毒作用的靶位点，体外PrPsc不能将PrPc完全转化为PrPsc 同一宿主能被多种菌株感染

㈡RNA的信息不完全来自DNA――模糊基因

Eg：锥虫的coxⅢ中167个位点上398个U插入,9个删除. 探针．60%RNA编辑．gRNA． 三、中心法则在生命系统中的地位 细胞模板：细胞膜

DNA参与一切，但不是决定一切 Eg：朊病毒：成核依赖的蛋白质多聚化模型

开放式中心法则：如下页图所示。

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第二章 遗传的物质基础

第一节 什么是遗传物质

一、DNA是遗传信息的携带者

转化实验： 捣碎实验：

基因：编码一条有功能的多肽链或RNA所需的DNA序列 DNA作为遗传信息的原因：⑴信息量大,分子量大；⑵双螺旋结构,能自我复制；⑶2’脱氧,稳定性好；⑷易突变；⑸有T,无U。（如右图所示）

第二节 DNA结构

一、. DNA的一级结构

定义：核苷酸排列顺序，或称碱基排列顺序。

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5’-ATCGGCTAAGGCTCCGACGA--3’ 3’-TAGCCGATTCCGA GGCTGCT--5’

人类基因组计划――20世纪生物学最宏伟计划：人类基因组的作图与测序。 人类基因组计划（1990-2005）；计划耗资30亿美元。人类基因组有30亿碱基对的测序。 二、DNA的二级结构

DNA的二级结构就是双螺旋结构。

受环境因素, 如平衡离子类型、离子强度、特异结合蛋白、水合状态等的影响, 以及DNA分子碱基的组成都可促使DNA分子取不同的构象。 DNA分子存在多种构象――二级结构的动态结构

㈠B型结构（右手双螺旋）

B-型结构也称右手双螺旋结构。1953年由Watson 和Crick首先提出。 这是水溶液（或相对湿度92%以上）中的主要构象。 提出双螺旋构象的根据：

B-型DNA构象的主要内容：⑴右手双螺旋；⑵两条链反平行；⑶磷酸,核糖在外侧,碱基在内侧；⑷一周螺旋,10个碱基,螺距3.4nm；⑸遵守AT,CG配对规律；⑹双螺旋分子存在大沟,小沟。

㈡A型结构

相对湿度<75%，矮胖型，直径大。

㈢Z型结构

Wang 等人在研究人工合成的d(CGCGCG)单晶的X-射线衍射

图谱发现主链呈锯齿排列。 Z型结构实验依据：

Z-型构象的主要特征：⑴糖-磷酸主链的走向呈之字形, 分子呈左手螺旋构象每一螺圈含12对碱基, 距离为4.46nm。⑵糖环折叠不同于A或B型DNA, 鸟嘌呤碱基绕糖苷键旋转呈顺式构型,而嘧啶碱基仍是反式构型, 前者的糖环折叠是C3-endo，后者是C2-endo。 Z-DNA仅有一条小沟, 且较深, 含有较高的负电荷密度。

Z-DNA较B-DNA细而“舒展”, 螺旋直径为1.8nm。 翻板假说： 影响因素：

DNA构象家族：

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三种构象特征的比较：

㈣沟信息的识别

大沟和小沟的信息区别：氢键O,N,受体a, NH2供体d 大沟(a-d-a) A-T小沟(a-a)

小沟( a-a-d,d-a-a) G-C 小沟(a-d-a)

㈤DNA二级结构的其他构象

⑴十字型――反向重复序列 生物学功能：

⑵DNA的四链结构 特征：①鸟嘌呤四联体；②G-G 首尾相接，异常氢键；③片层堆积，所有的方向一致。

生物体中可能存在G四联体的依据：

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⑶三螺旋DNA

存在条件：一条全嘌呤,另一条全嘧啶。

特征：①两条全嘧啶链和一条全嘌呤链组成三螺旋结构；②氢键为Hoogsten氢键；③第三条链位于正常双螺旋的大沟中。 三、DNA的三级结构—超螺旋结构 形成条件： 类型：

性质的变化： 生物学意义：

拓扑性质：

通常以链环数（Linking number)表示超螺旋的的拓扑性质。

是指一个环状封闭双螺旋DNA分子两条链彼此交叉的次数。 L = W+T（T：代表双螺旋中的罗圈数，数量=总碱基数/每一罗圈的碱基数。W：超螺旋的程度，双螺旋中心轴盘绕的圈数。松弛分子的W值等于零。） 举例： 一个200bp的环状闭合双链DNA

松弛型，没有超螺旋 W=0 L= W+T = 0+ 200bp/10 bp=20

负超螺旋，形成1个超螺旋 W=-1 L=W+T = -1+ 200bp/10 bp=19

正超螺旋，形成1个超螺旋 W=+1 L=W+T = 1+ 200bp/10 bp=21

具有完全相同顺序，而L值不同的

DNA称拓扑异构体(Topological isomers)。

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拓扑异构体的互变由拓扑异构酶催化。发生一条链或两条链的断开和连接。 拓扑异构体：具有完全相同的碱基顺序,但L值不同的超螺旋。分为I, II型 两种拓扑异构酶：Topoisomerase I , II

第三节 DNA双螺旋的呼吸作用

甲醛的变性实验 呼吸作用的定义 碱基对的稳定性 生物学作用

第四节 DNA的变性复性和分子杂交

一、变性(溶解)

在某些物理化学因子的作用下，DNA双链间的氢键断裂，双链解离形成单链。

㈠性质变化

增色效应；黏度降低；沉降速度增加。

㈡因素

⑴温度：温度升高引起的DNA变性称热变性。加热使氢键断裂。

可用热变性曲线描述热变性过程。见下图

融点Tm：50%DNA分子解链时的温度。

融点与DNA分子中的GC有关，随（G+C）%的含量呈线性增加

⑵化学：甲酰胺破坏氢键

二、复性

去除变性条件后，单链DNA在适当条件下重新形成双链，回复到原有的物理和生物学特性。

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华东理工大学 《分子生物学》上课讲义 ㈠复性动力学

复性过程是两条单链DNA碰撞形成双链DNA的过程，是双分子反应。服从二级反应动力学规律。

控制复性反应的两个参数是C0和t Rate of reaction The reaction follows the second order equation

C is the concerntration of DNA that is single-stranded at time t k is a reassociation rate constant. Progress of reaction Integrate the rate equation between the limits; Initial concerntration of DNA=C0 at time t=0;

Concentration remaining single stranded=C after time t Critical parameter is C0t1/2

When the reaction is half complete at the time t=1/2 Therefore C0t1/2=1/k.

复性反应进行到50%时的C0 .t为C0 t1/2

C0t曲线：用已经复性的DNA浓度，即1－C/C0对C0t的对数作图。如右图所示.

C0t值的意义：C0 t1/2值可以用来表示反应体系中DNA的总长度（单拷贝）。这种总长度称为DNA的复杂性。通过测定复性动力学可以预测基因组的大小。

真核基因组DNA的复性动力学：

第1是快复性动力学组分，高度重复序列。 第2是中复性动力学组分，中度重复序列。 第3是慢复性动力学组分，单拷贝序列。 X：DNA的复杂性

C0t曲线特征：⑴原核生物每种图形的现状大致相同；⑵重复序列多,复性快。 曲线意义：求DNA的复杂度。

三、分子杂交

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原理：基于DNA的变性与复性的特性。双链DNA加热以后，变成单链，在去除变性条件后，在一定的条件下，具有互补顺序的DNA能再形成双链。

探针：一种标记的一段DNA或RNA，与待测基因序列的DNA或RNA互补

分子杂交技术的种类：⑴固相杂交（待测核酸固相化）；⑵Southern blot，待测核酸为DNA；⑶Northern blot，待测核酸为RNA。 液相原位杂交示意图：⑴Dots hybridization，点状杂交，待测核酸为DNA 或RNA；⑵Colony or plaque hybridization，菌落或噬菌班杂交，待测核酸为DNA。⑶Tissue hybridization，组织原位杂交，检测mRNA表达和定位。 研究基因的定位，拷贝数，测序。 菌落原位杂交：

基因文库：染色体DNA文库，cDNA文库。

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第三章 基因和基因组

一、原核生物基因组

⒈特征

⑴只有一个染色体； ⑵通常含有质粒； ⑶操纵子结构； ⑷顺反子；

⑸有SD序列；

⑹基因重叠；

⑺一般没有内含子；

⑻只有一个复制起始位点； ⑼以RNA为产物的基因往往是多拷贝的，蛋白质基因单拷贝。

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⒉⑴фX174；⑵λ噬菌体

二、真核生物基因组

1．染色体、核小体结构

⑴染色体功能实现三要素：①着丝点；②端粒；③复制起始点。 ⑵基因组大小和C值矛盾

C值：单倍体基因的全部DNA含量。

C值矛盾：①与预期相比，C值明显过大；②同一物种，C值相差很大。 ⑶基因组的基因数目（下表：不同生物的基因数目）。 种类

基因组大小（bp）

6567

基因数目

支原体 1.0×10 750 噬菌体T4 1.6×10 200 大肠杆菌 4.2×10 2350 酵母 1.3×10 6100 果蝇 1.4×10 8750 人 3.3×10 65000-80000⑷真核生物基因组序列特征：

具有多个复制起始位点；编码序列仅占一小部分(3%)，大部分为非编码序列。 单拷贝序列；轻度重复序列； 中度重复序列；高度重复序列。

不同物种中,重复序列/非重复序列的比例相差很大，原核基本不重复。 ⑸真核生物的重复序列

①基因家族：Ⅰ.珠蛋白；Ⅱ.rDNA；Ⅲ.tDNA；Ⅳ.组蛋白基因。 rRNA基因:酵母：140次；果蝇：130～250次；人类：300次。

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tRNA基因:每种tRNA基因约有200个拷贝串联排列。

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组蛋白基因家族：

左图1为组蛋白基因家族，箭头←→表示转录方向，右侧数字表示基因组重复次数。

左图2为真核生物基因组中不同的多基因家族。

②Alu的重复序列：Ⅰ.AG↓CT；Ⅱ.散布；Ⅲ.Alu序列；Ⅳ.约90%相同。

③卫星DNA

Ⅰ.隐蔽卫星DNA Ⅱ.小卫星DNA Ⅲ.微卫星DNA A.单拷贝序列特征 a.含有内含子 内含子(intron) 外显子(exon) 内含子检测:

性内切酶图谱 DNA的杂交

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内含子GT/AG规则:

内含子与外显子连接处的序列特异: 内含子5’端为GT,3’端为AG, GT/AG规则. --------GT--------AG-------- 外显子 内含子 外显子 B.存在不同的转录单位 a.简单转录单位

转录单位的基本组成: b.复杂转录单位

转录方式不同,拼接方式不同.

三、基因定位

遗传图：基因在染色体上的位置。

经典方法:

⒈遗传交换定位 ⒉接合定位 ⒊染色体爬行法

基因鉴定的方法：外显子特征 ⒈与RNA后cDNA杂交； ⒉Zoo-blot不同物种杂交； ⒊外显子捕捉； ⒋CG岛鉴定； ⒌扣除杂交。

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第四章 DNA复制

第一节 复制概论

⒈半保留复制

⒉复制的方向5’→3’

实验证据：在反应物中加入dNTP。 ⒊具有固定的起始位

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⒋DNA聚合酶 ⒌半不连续复制

一条链连续合成，称主导链Leading Strand；

另一条链分段合成，称随从链（随后链）Lagging Strand。

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第二节 DNA复制的酶学

复制体系的鉴定

DNA基因：与DNA复制有关的基因

条件型突变体、温度突变体研究DNA基因

快停突变体、慢停突变体 1．DNA聚合酶 3种klenow片段 聚合酶I活性

①5’－3’聚合活性 ②3’－5’外切活性 ③5’－3’外切活性 聚合酶Ⅲ：主要的复制酶 聚合酶活性

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功 能

模 板 ｜ 引 物

三种大肠杆菌DNA聚合酶性质的比较

PolⅠPolⅡ PolⅢ5’→3’聚合 + + + 3’→5’外切 + + + 5’→3’外切 + - + 焦磷酸化和PPi交换 + + 完整双链 - - - 有引物的单链 + - - 有断口的双链(多聚dAT) + - - 有缺口的双链或单链长度＜100核苷酸 + + + 5’端突出的单单链长度＞100核苷酸 + - - 链

分子量×1000U 109 120 140 每个菌体中的分子数(估计值) 400 10-20

结构基因 Pol APol B Pol C

2．参与DNA解旋和解链的酶 (1)DNA回旋酶(Gyrase) (Topoisomerase II)

(2) DNA螺旋酶(Helicase) DNA结合蛋白

（DNA Dinding Protein，DBP) 单链DNA结合蛋白（SSB)

⒊连接酶

连接双链上磷酸二酯键,要供能

⒋引发酶 引物合成

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第三节 复制的基本模式

1. θ型 2. 滚环式 3. D型

第四节 复制过程

一、复制的起始 复制起始示意图

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二、延伸过程 M13、G4 phage

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华东理工大学 《分子生物学》上课讲义 φx174

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华东理工大学 《分子生物学》上课讲义 三、回环模型

在oriC和oriλ上起始涉及相同的反应

阶段 oriC oriλ Ori的识别和解链 DnaA O 解旋酶的结合和解链 DnaB DnaB DnaC P RNA Pol RNA Pol

释放复合体 DnaJ？ DnaJ？

四、线形末端的复制

解决方法： 1. 成环 2. 末端冗余 3. 腺病毒

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五、真核DNA复制

1．DNA聚合酶

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DNA聚合酶 α δ ε β γ

位置核 核 核 核 线粒体 功能 引发 延伸 修复，合成 修复 复制 酶活性 Pol I 3‘-5’外切核酸酶3‘-5’外切核酸酶 3‘-5’外切核酸酶2.SV40DNA复制

(1)RNA引发，起始DNA合成 (2)DNAδ延伸

功能 E.coli SV40 起始蛋白 DNA A T 螺旋酶 DNA B T 引发 DNA G Polα 聚合 Pol IIIα Polδ 外切酶活性 Pol IIIε Pol I δ 滑动钳 Pol IIIβ PCNA 单链结合蛋白 SSB RPA 3.端粒酶

端粒 TTGGGG 富含TG结构，

不同生物重复次数不同 端粒酶性质

真核生物复制过程中的核小体结构

亲本八聚体

全保留装配

图示详见武汉大学出版社《分子生物学》第91页。

图7－23 新产生的组蛋白八聚体装配的三种模式

图7－24 亲代组蛋白八聚体和新合成的组蛋白八聚体与DNA结合的可能方式，Ⅱ是正确的。

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第五章 转录

第一节 原核生物的转录

一、转录的一般概念 1．转录是不对称的

模板链/非模板链；有义链/无义链；正链/负链；编码链。 病毒的分类：

(1)RNA病毒:RNA→mRNA(＋链病毒)；RNA→互补RNA→翻译(－链病毒)。 (2)DNA病毒 2．DDRP 3．5’；3’ 4．pppA；pppG 5．RNApol忠实性 6．转录泡

二、RNA聚合酶

holoenzyme:σ起始因子，核心酶

真核生物三种RNA聚合酶的特点

RNA Pol 位置 产物 相对活性 对α-鹅膏蕈的敏感性Pol Ⅰ 核仁 28S，18S，5.8S rRNAs 50％～70％不敏感 Pol Ⅱ 核质 hnRNA，mRNA，某些snRNAs 20％～40％高度敏感 Pol Ⅲ 核质 tRNA，5S rRNA，某些snRNAs～10％ 片段特异,中度敏感

转录的抑制剂

抑制剂 靶酶 抑制作用 利福霉素 细菌全酶 和β亚基结合,抑制起始 链霉溶菌素 细菌核心酶 和β亚基结合,抑制起始 放射线素D 真核 PolⅠ 和DNA结合,阻止延伸 α-鹅膏蕈 真核 PolⅡ 和 RNA PolⅡ 结合

三、转录过程

原核生物基因的转录： 启动子 高度保守

足迹法 突变法 硫酸二甲酯法 (足迹法图见下页起始过程左边图) CAP位点 正调节位点 G敏感性操纵子

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起始过程

1. 模板结合,扫描式SCAN 2. 起始识别 3. 活化

4. 进入起始位点

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华东理工大学 《分子生物学》上课讲义 延伸 终止

P因子依赖型终止子 P因子非依赖型终止子 通读效应

第二节 RNA反转录

年：抑制DNA复制的放线菌素能抑制RNA病毒。 逆转录酶RDDP RDDP RNA病毒编码 活性: cDNA制备 乙肝病毒

☆由逆转录病毒基因组中pol基因编码。是一种多功能酶。

☆有以RNA为模板和以DNA为模板合成DNA的DNA聚合酶活性。

☆需要RNA或DNA做引物；

☆有核糖核酸酶 H的活性（在逆转录酶的C端），能从3’→5’和从5’→3’水解RNA，使RNA与DNA的杂交体分离。

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逆向转录酶的生物学意义：

1.用于合成cDNA。建立cDNA文库(cDNA Library)，获得基因或探针。 2.与PCR连用 RT-PCR。

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第三节 真核生物基因的转录

真核与原核基因转录的区别：课件讲义第25页两张表和下表所示：

一、真核生物的启动子 RNA pol Ⅱ

二、启动子特征和转录因子

1. RNA聚合酶Ⅰ 效率最高

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华东理工大学 《分子生物学》上课讲义 2. RNA聚合酶Ⅱ 3. RNA聚合酶Ⅲ

基因内启动子/基因外启动子 1. RNA pol Ⅱ

核心元件 上游元件 远端区

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2. RNA pol Ⅰ

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3. RNA pol Ⅲ

第四节 转录后产物加工

一、真核的mRNA

帽子结构 poly A 剪接 编辑

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二、基因间隔序列的去除 mRNA；tRNA；rRNA。 实验证据：

三、tRNA

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四、rRNA

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