微生物实验报告细菌

题目 年级专业实验者 学号 小组 成员 指导老师

一、实验目的

脓汁和粪便标本中病原菌的检测 2013级临床医学八年制

1.了解细菌生长的基本营养条件，熟悉培养基的类型，学习并掌握培养基的原则与方法。 2.掌握无菌操作技术，掌握病原菌的分离与培养方法。 3.了解并比较细菌在固体、半固体和液体培养基的生长特征。 4.学习并掌握空气及人体细菌检测学方法。

5.掌握细菌涂片标本的制备以及革兰染色法，熟悉不同类型细菌的基本形态。 6.掌握糖发酵实验、抗菌素敏感性实验和血浆凝固酶实验的原理与方法。 7.从脓汁和粪便标本中分离培养和检测出病原体。

二、实验器材

1.培养基的制备：干粉培养基、天平、蒸馏水、称量皿、药勺、锥形瓶、量筒、电炉、试

管、洗耳球、试管筐、移液管、棉塞、牛皮纸、橡皮筋、手套、石棉网 2.空气与人体体表细菌学检查：琼脂培养基、酒精、碘酒

3.细菌的分离培养：脓汁标本、粪便标本、伊红美蓝平板、营养琼脂平板、接种环、酒精灯、打火机

4.细菌的纯培养：接种环、酒精灯、打火机、中性笔、斜面培养基

5.细菌的形态学检测：斜面培养物、营养肉汤、生理盐水、镜油瓶、拭镜纸、吸水纸、载玻片、显微镜、接种环、酒精灯、打火机、中性笔、革兰染色试剂、液体培养基

6.细菌的生化试验：葡萄糖发酵管、乳糖发酵管、接种针、酒精灯、打火机、中性笔、菌液、营养琼脂平板、接种环、药物纸片（青霉素、庆大霉素、头孢曲松）、玻片、兔血浆、生理盐水

7.细菌的血清学试验：玻片、福氏志贺菌诊断血清、生理盐水、接种环、酒精灯

三、实验方法与步骤

1.培养基的制备

称量琼脂粉→蒸馏水→加热溶化→分装→集中放在试管筐里→罩上硫酸纸、牛皮纸→ 用橡皮筋扎好 →放入讲台边的灭菌桶或灭菌筐内→送到高压蒸汽灭菌室（洗刷室）→灭菌

2.空气与人体体表细菌学检查 2.1空气的细菌学检查

每组1个营养琼脂平板，选择实验楼女厕所→将平板盖打开，盖朝下放置在平板旁边→平板暴露于空气中15分钟→平板倒扣盖上→作标记→37℃温箱培养24小时→观察结果。 2.2人体体表细菌学检查

甲丙常规洗手，乙丁标准洗手。甲和乙、丙和丁分别共用1个平板按下图在普通平板上接种手指上的细菌。第1格为洗手前，第2格为洗手后，第3格为消毒后，第4格空白对照。

3.细菌的分离培养 3.1 实验方法

平板划线法：借助于划线，将混杂的多种细菌，在平板表面分散成单个细菌，并固定在某一点上。培养以后细菌各自分裂繁殖，形成肉眼可见的细菌集团（单菌落）。 3.2实验步骤

接种环烧灼灭菌→分别取脓汁标本与粪便标本点在普通平板和依红美蓝平板上，各做两份，→烧掉接种环上多余的标本→冷却后，应用分区划线分离法，将脓汁标本接种于营养琼脂平板（2份），粪便标本接种于伊红美蓝平板（2份）→接种环烧灼灭菌→将平板倒置37℃培养18～24h→观察结果 。 4.细菌的纯培养

甲→普通平板→金黄色菌落(auratus，golden yellow)→1支斜面 乙→普通平板→白色菌落(albus，white)→1支斜面 丙→ EMB平板→紫黑色菌落(atropurpureus)→1支斜面 丁→ EMB平板→粉红色菌落(pink) →1支斜面

斜面正面上2/3作标记：组号 + 金黄、白色、紫黑、粉红。 5.细菌的形态学检测 5.1革兰试剂染色

5.2显微镜油镜使用步骤

10×物镜→看清标本→滴加香柏油→100×油镜→浸泡油中→模糊物象→细调节调焦，观察物像→记录结果→关闭电源→ 擦镜纸拭去香柏油 →擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（7:3）

混合液擦拭→擦镜纸擦拭油镜。 5.3肉汤接种法

接种环烧灼灭菌→分别在斜面培养物中挑取菌苔少许→立即移入肉汤培养基管中→在接近液面的管壁上轻轻研磨→沾取少量肉汤调和→混匀→试管口通过火焰2-3次灭菌→塞好棉塞→35℃培养4~6小时

6.细菌的生化试验 6.1细菌的糖发酵实验

接种针烧灼灭菌→用灭菌接种针分别刮取实验所得到的紫黑色和粉红色菌苔→分别接种在葡萄糖发酵微量管中和乳糖发酵微量管内→接种环烧灼灭菌→将微量管平放在平板内→37℃培养过夜后→观察结果。 6.2药敏实验

接种环烧灼灭菌→分别取之前实验中得到的四种菌液在普通平板密集涂布（如图6）→接种环烧灼灭菌→ 标记:青、头、庆 →镊子火焰消毒→贴青霉素、头孢曲松、庆大霉素纸片→ 按压→镊子消毒→倒置37℃培养 6.3凝固酶实验

取干净玻片一张→在左右两边分别滴加兔血浆1-2滴，生理盐水1滴→接种环烧灼灭菌→冷却→分别用接种环取之前实验所得到的白色和黄色菌苔(2～3个菌落的菌量)与血浆研磨混合→边混匀边观察结果→接种环烧灼灭菌→稍等片刻，观察结果 6.4动力实验

接种针烧灼灭菌→分别用接种针在紫黑色和粉红色的斜面取菌→从半固体培养基中心垂直刺入，可刺达近底管处，但不要到达管底→循原来的路线退出接种针→试管口迅速通过

火焰2-3次灭菌→塞好棉塞→烧灼灭菌接种针→37℃培养24小时→观察结果

7.细菌的血清学试验

取洁净的载玻片一张→将磨面近端设为对照区→滴加生理盐水15ul→远端设为试验区→滴加福氏志贺菌诊断血清15ul→接种环烧灼灭菌→用接种环分别取粉红色菌苔→研磨于盐水或血清内，混合均匀→接种环烧灼灭菌→载玻片来回倾侧→观察结果

四、结果与讨论

1.人体体表细菌学检查

洗手前细菌较多，有黄色和白色两种菌；洗手后细菌总数没有明显减少甚至有增加，以白色菌为主。用碘酒擦拭过的手无明显的细菌菌落，空白对照无菌落。

洗手可能只能洗掉部分暂住菌（黄色），而不能完全去除手上的全部细菌，碘酒具有很好的杀菌功能，可基本杀灭手上的细菌。

2.细菌的分离培养结果

标本 菌落颜色 形态特征

黄色 脓汁

白色 紫黑色 粪便

粉红色 半透明，直径1～2mm

圆形、隆起、表面光滑、边缘整齐、具有金属光泽、大不透明，菌落直径2mm左右

而隆起、不透明，菌落直径2～

3mm

结果分析：

粪便标本在伊红美蓝平板上，形成的紫黑色、淡粉红色两种菌落，菌落色素是水溶性的，不是细菌本身的颜色，颜色的产生是因为大肠埃希菌分解乳糖产酸，酸使伊红与美蓝结合，形成紫黑色，而致病菌不分解乳糖，菌落呈伊红的颜色，淡粉红色。

观察伊红美蓝平板，发现个别菌落中心黑色，边缘粉红色，此种类型的菌落多出现在划线密集，菌落较集中的地方，推测原因是，大肠杆菌利用完乳糖以后，就要利用蛋白质，蛋白质分解大多产生碱性物质，中和了乳糖分解时产生的酸，导致了大肠杆菌菌落颜色的改变。

3.细菌的纯培养

从普通平板上挑选的黄色或白色菌落接种的斜面，观察菌苔的颜色与之前无明显差别；从伊红美蓝平板上挑取的紫黑色和粉红色菌落失去了原来的颜色，都变灰白色，表面光滑湿润，这是因为水溶性色素只有在伊红美蓝中才能显现出紫黑色和粉红色。

4.细菌的形态学检测 菌落来源 菌落颜色 油镜特征

金黄色 脓汁

白色 紫黑色 粪便

粉红色 呈紫红色，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌

呈粉红色，紫黑色菌呈长弧状，粉红色呈短杆状，散在排列，从形态上不能鉴

别是什么细菌。

分析讨论

革兰氏染色原理：G＋菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。Gˉ菌：肽聚糖层薄，

交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。

综上所述，金黄、白色两种菌落，显微镜油镜下均为G+球菌，结合镜检特征可知这两株细菌属于葡萄球菌，再结合菌落色素，这两株葡萄球菌分别是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。；紫黑色菌落，粉红色菌落，显微镜下均为G-杆菌。 5.药敏实验

菌落 青霉素 头孢曲松 庆大霉素

黄色 + + +

白色 + + +

紫黑色 - + +

粉红色 - + +

备注：“+”为敏感，“-”为耐药 表 1药敏试验结果 分析讨论

纸片扩散法将含有定量抗菌素的纸片，平贴在已经接种了试验细菌的平板上。纸片中的抗菌素吸收培养基的水分，溶解后不断向周围扩散，形成递减的梯度浓度。敏感细菌在纸片周围的生长受到抑制，而形成没有细菌生长的抑菌圈。G+球菌对青霉素和头孢曲松敏感。 G-杆菌对青霉素耐药，对头孢曲松敏感。G+球菌和G-杆菌对广谱抗菌素庆大霉素都敏感。 6.凝血酶实验

致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白,附着于菌体表面,形成凝块。因此金黄色菌为有致病性的金黄色葡萄球菌，白色为无致病性的白色葡萄球菌。

7.糖发酵实验与动力学实验

菌落 紫黑色 葡萄糖发酵现象 黄色，产酸又产气，分解糖 粉红色

黄色，产酸不产气，

分解糖

分析讨论

具有鞭毛能够真正运动的细菌，在半固体培基中,能冲破低浓度琼脂的阻力，自接种部位向周围移动扩散生长，使培养基呈根须状或云雾状混浊状态。无鞭毛不能运动的细菌，只能沿着穿刺线生长繁殖，穿刺线边缘清晰，周围培养基清澈透明。所以紫黑色菌右鞭毛，粉红色菌无鞭毛。根据实验现象与生化反应鉴别表（图22）可判断出紫黑色菌为大肠埃希菌，粉红色菌为福贺志氏菌。。

8.细菌血清学实验

在载玻片上滴加生理盐水的血液没有发生凝集，而滴加福氏志贺菌的血清发生了明显的凝集。

在适量电解质存在的情况下，颗粒性抗原(细菌)与特异性抗体结合，如果比例合适，则出现肉眼可见的凝集块，称为凝集反应。滴加生理盐水的血没有发生凝集，滴加福氏志贺菌

乳糖发酵现象 黄色，产酸又产气，分解糖 动力试验现象 扩散生长，培养基呈扩散云雾混沌状态 紫黄色，分解少量糖，沿穿刺线生长，穿刺线边缘

不产气

整齐，周围培养基清澈透明

的福氏志贺菌诊断血清发生凝集反应，证明福氏志贺菌具有致病性。

综合实验结果

脓汁和粪便标本细菌检测结果 标本 菌落 形态 血浆 凝固酶 脓汁 白色 G+球 - + + + 黄色 G+球 + 葡 乳 半 福痢血清 + + + 金黄色 葡萄球菌 白色 葡萄球菌 粪便 粉红 紫黑 G－杆 G－杆

脓汁标本中分离得黄色菌落为金黄色葡萄球菌，白色菌落为白色葡萄球菌，致病菌为金黄色葡萄球菌；粪便标本中分离得紫黑色菌落为大肠埃希菌，粉红菌落为福氏志贺菌，致病菌为福氏志贺菌。

五、注意事项

1.平板划线要充分利用平板面积，不能划破琼脂； 2.挑取菌苔时在平皿底部玻璃上，画个大圈选取菌落； 3.药敏试验试验菌用量以对照琼脂平板表面生长的菌落呈密集或半密

+ - - + - + + ⊕ ⊕ + - + + 大肠 埃希菌 福氏 志贺菌 青 链 庆 结论 集为宜； 4.在玻片凝集试验中来回侧倾载玻片，让菌液流动起来，结果更明显； 5.糖发酵实验中培养管不能竖直放置，防止气体跑出； 6.动力学实验接种环要直进直出；7.实验过程始终要在酒精灯无菌操作区进行。