中国组织工程研究第１７誊第６期２０１３—０２—０５出版 ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｉｓｓｕｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１３ ＶｏＬ１７，Ｎｏ．６ ｗｗｗ．ＣＲＴＥＲ，Ｏｒｇ ｄｏｋｌＯ．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．２０９５－４３４４．２０１３，０６．０２０ ｍｔｌｐ：ｆ Ｗｗｗ．ｃｒ【ｅｒ ｏ固１ 肖任辉。韦庆军．赵韵民．薄占东．韦积华，李伟岸．全骨髓站壁法培养兔骨髓闻充质干缀瞻体矫定向或骨诱导分化及鉴定 中国组织Ｉ程磷究．２０１３，１ ７（６）：１０６９－１０７４， 全骨髓贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞体外定向成骨诱导分化及鉴定水★ 肖仕辉，韦庆军，赵劲民，薄占东，韦积华，李伟岸 广西医科大学第一附属医院创伤手外科，广西壮族自治区南宁市５３００２１ 表的现兔骨出髓与成间充骨质细干胞细相墓胞似 罄 ，的在形体态外学经和成生骨物诱学导特剂性的作用下，’ 骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化后生长良好， ：： ：意薹： ： ’ 。 主要从；创 ｉ科的修复 ’ …： 孟 干细胞；干细胞培养与分化：全骨髓贴壁法分离法；骨髓间充质干细胞；细胞培养；成骨分化；组织工 程骨；省级基金；干细胞图片文章 通讯作者：韦庆军，副教 授，副主任医师，广西医 科大学第一附属医院创伤 摘要 手外科，广西壮族自治区 背景：流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法对细胞活性影响较大，密度梯度离心法虽然能够获得纯度高 南宁市５３００２１ 的单核细胞，但由于多次离心可造成细胞的大量流失且对细胞活性有一定的影响使其应用值得商榷。 ｗｅｊｑｉｎｇｊｕｎｇｘｎｎ＠ １６３．ｃｏｍ 目的：采用全骨髓贴壁法分离兔骨髓间充质干细胞进行成骨诱导分化及鉴定。 中图分类号：Ｒ３９４ ２ 方法：采用全骨髓贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞，倒置显微镜下观察细胞形态学特征。在成 文献标识码：Ｂ 骨诱导剂作用下，通过碱性磷酸酶染色试剂盒行碱性磷酸酶染色，Ｉ型胶原免疫细胞化学染色，Ｙｏｎ 文章编号：２０９５－４３４４ Ｋｏｓｓａ法及茜素红进行矿化结节染色以及电镜下检测兔骨髓问充质干细胞成骨诱导后的形态结构。 （２０１３）０６—０１０６９－０６ 结果与结论：经诱导后细胞出现与成骨细胞相似的形态学特征，碱性磷酸酶染色阳性，Ｉ型胶原免疫细胞 收稿日期：２０１２．０５．１９ 化学染色，Ｙｏｎ－Ｋｏｓｓａ法及茜素红矿化结节染色阳性。表明经成骨诱导剂诱导后全骨髓贴壁法体外分离 修回日期：２０１２．０６．１６ 纯化培养的兔骨髓间充质干细胞能向成骨细胞方向分化增殖。 【２０１２０３１９０２３／Ｗ‘Ｃ） ／ｎ ｖｉｔｒｏ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｂｂｉｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｗｈｏｌｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ Ｘｉａｏ Ｓｈｉ—ｈｕｉ，Ｗｅｉ Ｑｉｎｇ－ｊｕｎ．Ｚｈａｏ Ｊｉｎ—ｍｉｎ，Ｂｏ Ｚｈａｎ－ｄｏｎｇ，Ｗｅｉ Ｊｉ－ｈｕａ，Ｌｉ Ｗｅｉ－ａｎ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｒａｕｍａ ａｎｄ Ｈａｎｄ Ｓｕｒｇｅｒｙ，ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｎａｎｎｉｎｇ ５３００２１，Ｇｕａｎｇｘｉ Ｚｈｕａｎｇ Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ Ｒｅｇｉｏｎ，Ｃｈｉｎａ Ａｂｓｔｒａｃｔ ＢＡＣＫＧＲＯＵＮＤ：Ｔｈｅ ｌｆｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｈａｖｅ ｇｒｅａｔｅｒ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｃｅｉｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ ａｌｔｈｏｕｇｈ ｔｈｅ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｐｕｒｉｔｙ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ，ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ｍａｙ ｃａｕｓｅ ａ ｈｕｇｅ ｌｏｓｓ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｈａｓ ｓｏｍｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｅｅｌＩ ａｃｔｉｖｉｔｙ．ＳＯ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｓ ｄｅｂａｔａｂｌｅ． ． ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ：ＴＯ ｉｓｏｌａｔｅ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｒａｂｂｉｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａＩ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｗｈｏｌｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ． ＭＥＴＨ０ＤＳ：Ｔｈｅ ｒａｂｂｉｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａＩ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂｙ ｗｈｏｌｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｒａｂｂｉｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａＩ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｕｎｄｅｒ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．Ｕｎｄｅｒ ｌｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｌｓｓＮ ２０９５．４３４４ ＣＮ ２１．１５８１／Ｒ ＣＯＤＥＮ：ＺＬＫＨＡＨ １０６９ 住辉．等 全骨髓贴壁法培养兔骨髓间充羲千细胞体外定向戒骨诱导分化及鉴定 一 一 Ｘｉａｏ Ｓｈｉ・ｈｕｉ★Ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｆｏｒ ｍａｓｔｅｒ’ｓ ｄｅｇｒｅｅ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｒ，ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ，ｔｙｐｅ Ｉ ｃｏｌｌａｇｅ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ，ａｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ Ｖｏｎ－Ｋｏｓｓａ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｒａｂｂｉｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｕｍａ ａｎｄ Ｈａｎｄ Ｓｕｒｇｅ￣，ｔｈｅ ＦｉｒｓｔＡｆｉｆｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎａｎｎｉｎｇ ５３００２１．Ｇｕａｎｇｘｉ Ｚｈｕａｎｇ Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ Ｒｅｇｉｏｎ． Ｃｈｉｎａ ｘｉａｏｓｈｉｈｕｉ００７＠１２６．ｃｏｍ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：Ｗｅｉ Ｑｉｎｇ－ｊｕｎ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｐｒｏｆｅｓｓｏ￣ ｓＡｓｏｃｉａｔｅ ｃｈｉｅｆ ｐｈｙｓｉｃｉａｎ， Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｒａｕｍａ ａｎｄ Ｈａｎｄ Ｓｕｒｇｅｒｙ，ｔｈｅ ＦＩｒｓｌ Ａｆｉｆｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉａｔｌ ｏｆ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｍｅｄｉａｃｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｎｉｎｇ ５３００２１，Ｇｕａｎｇｘｉ Ｚｈｕａｎｇ Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ Ｒｅｇｉｏｎ．Ｃｈｉｎａ ｗｅｉｑｉｎｇＪｕｎｇｘｎｎ＠１６３．ｃｏｍ Ｒｅｃｅｉｖｅｄ：２０１２－０５－１９ Ａｃｃｅｐｔｅｄ：２０１２－０６－１６ １０７０ ａｆｔｅｒ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ． ＲＥＳＵＬＴＳ ＡＮＤ ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ：Ａｆｔｅｒ／ｎ ｖｆｆｒｏ ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ｒａｂｂｉｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｅｃｌｌｓ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ Ｍｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｌｇｏｉａｃｌ ｃｈａｒａｃｔｅｄｓｔｉｃｓ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｔｙｐｉａｃｌ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ，ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｔｙｐｅ Ｉ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉａｃｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ，ａｎｄ Ｖｏｎ－Ｋｏｓｓａ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ａｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｎｏｄｕｌｅｓ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ．Ａｌ ｌｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉａｃｔｅ ｔｈａｔ ｒａｂｂｉｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ／ｎ ｖｉｔｒｏ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｗｈｏｌｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｃｎ ｂｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｏ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎｔｏ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ ａｆｔｅｒ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ． Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ：ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；ｗｈｏｌｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ；ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ；ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；ｔｉｓｓｕｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｄｎｇ ｂｏｎｅ；ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ ｇｒａｎｔｓ－ｓｕｐｐｏｄｅｄ ｐａｐｅｒ；ｓｔｅｍ ｅｃｌｌ ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｓ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐａｐｅｒ Ｘｉａｏ ＳＨ，Ｗｅｉ ＱＪ，Ｚｈａｏ ＪＭ，Ｂｏ ＺＤ，Ｗｅｉ ＪＨ，Ｌｉ ＷＡ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｂｂｉｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｗｈｏｌｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ． Ｚｈｏｎｇｇｕｏ Ｚｕｚｈｉ Ｇｏｎｇｃｈｅｎｇ Ｙａｎｊｉｕ．２０１ ３；１ ７（６）：１ ０６９—１ ０７４． ０引言 骨髓来源的间充质干细胞是一类具有高度自我更新和多向分化潜能的干细胞，在相应的 体外培养条件下具有向成骨、软骨、肌腱、肌肉、脂肪细胞分化的潜能，且增殖能力强ｒ 圳。 目前骨髓间充质干细胞是骨组织工程理想的种子细胞Ｉ珥～。正常情况下骨髓中骨髓间充质干细 胞占有核骨髓细胞的０．０００ １％～０．１％，含量很低。由于组织工程需要大量的种子细胞，从动 物骨髓分离骨髓间充质干细胞的技本术上的难度了许多实验的开展 。因此体外分离培 养纯度高、活力强、生物特性均一的骨髓间充质干细胞对组织工程及细胞的体内、体外实验 显得至关重要。实验采用全骨髓贴壁法将骨髓间充质干细胞从骨髓中分离出来，并在体外进 行培养和扩增，观察其增殖、生长特性和成骨诱导分化潜能。以此建立一套稳定有效、重复 性好的骨髓间充质干细胞体外分离、培养、扩增和成骨诱导分化的方法，为骨组织工程的种 子细胞的获取奠定实验基础。 １材料和方法 设计：细胞学体外观察实验。 时间与地点：于２０１１年６月至２０１２年２月在广西医科大学医学实验中心完成。 材料： 主要试剂与仪器： Ｍａｉｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ： 试剂与仪器 来源 低糖ＤＭＥＭ Ｈｙｃｌｏｎｅ 胎牛血清 浙江天杭生物科技有限公司 青霉素、链霉素溶液、２．５ ｇ／Ｌ胰酶 北京吉诺恩泰生物科技有限公司 １，２５一（ＯＨ）２ＶｉｔＤ３、地塞米松、左旋抗坏血酸、 甘油磷酸钠 Ｓｉｇｍａ 碱性磷酸酶试剂盒 ＧＥＮＥＦ ＡＹ 倒置相差显微镜 ＯＬＹＭＰＵＳ 透射电镜 日立Ｈ７６５０ 扫描电镜 ＶＥＧＡ３ ＴＥＳＣＡＮ，捷克 Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １２００，Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０００４ ｗｗｗ．ＣＲＴＥＲ．ｏｒｇ 肖仕辉．等 全骨髓贴壁法培养兔骨髓阚充质于缅匏体讣定向或骨诱导分化及鉴定 ～ 职伽 特性对其进行分离，虽然在培养过程中混杂有一定数量 细胞贴壁并调节碱性磷酸酶活 ￣［２５１。 的造血干细胞、内皮细胞及成纤维细胞，但这些杂细胞 可通过传代换液去除。目前研究表明，细胞培养早期骨 实验采用经典的成骨诱导方案，在体＃ｔ－－维培养体 髓中各种细胞的存在有利于保持骨髓间充质干细胞生 系中加入含１０ ｎｍｏｌ／Ｌ地塞米松、５０ ｐｍｏｌ／Ｌ抗坏血酸、 长的微环 ，且培养液中存在有少量的造血干细胞及 １ ０ ｍｍｏｌ／Ｌ ３－甘油磷酸钠、０．１ ＩＪｍｏｌ／Ｌ １，２５一（ＯＨ）２ＶｉｔＤ３ 成纤维细胞可通过分泌相关细胞生长因子产生协同作 的成骨诱导剂，成骨诱导７ ｄ后Ｉ型胶原免疫细胞化学染 用促进骨髓间充质干细胞的生长存活。 色呈阳性；诱导１４ ｄ后碱性磷酸酶染色阳性；诱导２１ ｄ 后细胞表面出现钙盐沉积及矿化结节，茜素红及 近年来，骨髓间充质干细胞作为骨组织工程的种子 ｖｏｎ．ｋｏｓｓａ染色均呈阳性，表明骨髓间充质干细胞在成 细胞受到广泛关注，如何在体外将骨髓间充质干细胞成 骨诱导剂的作用下具有向成骨分化的特性；同时在骨髓 功诱导成具有成骨细胞特性且仍保持细胞活力至关重 间充质干细胞成骨诱导２１ ｄ后，作者在电镜下观察细胞 要。骨髓间充质干细胞在分化过程中受到很多因素的影 表面结构及内部超微结构，发现成骨诱导后的兔骨髓间 响，包括自身因素和环境因素。自身因素中最主要的是 充质干细胞体积增大，呈平铺状态，细胞核较规则，常 控制基因表达的转录因子。 呈圆形或椭圆形；细胞连接紧密，具有丰富的微绒毛样 突起，交错样排列；细胞内可见高电子密度且，细胞器 目前研究较多的自身因素主要为Ｃｂｆａｌ转录因 丰富，粗面内质网发达，线粒体明显增多。王志顺等 子（急性骨髓性白血病因子３），在生物进化中高度保守的 和潘生才等 ，Ｊ的研究都发现骨髓间充质干细胞在成骨 细胞核内转录因子Ｃｂｆａ１是成骨细胞分化和骨形成过程 诱导后细胞核及粗面内质网较丰富，可见线粒体，空泡， 中的控制基因，在去除老鼠的Ｃｂｆａ１基因后，成骨细胞 糖原颗粒；经成骨诱导后线粒体及粗面内质网明显增 分化完全受抑制，使骨骼的软骨内骨化成骨和膜内骨化 多，空泡及糖原颗粒增加，细胞内可见高电子密度。实 成骨均不能发生【’‘圳。 验结果与上述两位研究者的实验结果吻合。 环境因素主要包括骨形态发生蛋白、维生素、激素 实验通过全骨髓贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞， 和重力因素等。骨形态发生蛋白主要通过增加细胞内骨 操作简单容易，通过换传代可以获得纯度较高且具有贴 桥蛋白、骨钙素及Ｉ型胶原蛋白及增高碱性磷酸酶的活 壁活性的兔骨髓间充质干细胞，在成骨诱导剂的作用 性来促进细胞分化ｌ‘旧】。１，２５（ＯＨ）２ｖｉｔＤ３是维生素Ｄ活性 下，骨髓间充质干细胞可向成骨细胞分化，且体外诱导 代谢产物，其作用通过维生素Ｄ受体介导，诱导其向成 分化的成骨细胞生长良好，表现出与成骨细胞相似的形 骨细胞分化且能抑制成骨细胞凋亡，促进骨髓间充质干 态学和生物学特性，证实骨髓间充质干细胞具有向成骨 细胞成骨标记物Ｉ胶原蛋白、骨桥蛋白及碱性磷酸酶的 细胞分化的潜能，表明骨髓间充质干细胞是可以作为骨 的分泌［２０－２１］。地塞米松是成骨诱导剂不可缺少的成分， 组织工程种子细胞，为进一步利用异种生物衍生骨支架 其不仅促进骨髓基质细胞生长和分化，而且调节成骨细 进行三维体系培养并构建生物衍生骨组织工程奠定实 胞分泌胰岛素样生长因子，促进细胞外基质胶原合成。 验基础。 值得注意的是骨髓间充质干细胞成骨分化对地塞米松具 有浓度依赖性，低浓度促进骨髓间充质干细胞向成骨细 童 锄：广西留学回国人员科学基金（桂科回０８３２０１２） 胞分化，高浓度使其向脂肪细胞分化，研究表明 “大网膜包裹构建大段血管化组织工程骨实验研究”。 １ ０ ｍｏｌ／Ｌ时促成骨分化作用作用最明显 Ｊ。Ｂ一甘油磷酸 者痢 实验设计者为第二作者，评估者为第三，四作 盐和抗坏血酸同样也是成骨分化不可或缺的条件。因为 者，第一，五，六作者进行实验干预，均经过系统培训，未使 ｐ一甘油磷酸盐可提供磷离子作为磷酸酶作用的底物，诱 用盲法评估。 导和激活碱性磷酸酶，促进有机磷向无机磷转化及矿盐 韧益臌 课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济 沉积及钙化，是骨髓间充质干细胞发生矿化结节沉积的 组织直接或间接的经济或利益的赞助。 必要条件 。Ｃｏｅｌｈｏ－￣［２４】认为骨髓基质细胞只有在ｐ一甘 伦理要 实验过程中对动物处置方法符合２００６年科技 油磷酸钠存在的情况下才可以发生矿化结节的沉积；抗 部 关于善待实验动物的指导性意见》的规定。 坏血酸是细胞合成胶原不可或缺的成分，不仅可以促进 考声豫文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密， ＩＳＳＮ ２０９５．４３４４ ｃＮ ２１－１５８１／Ｒ Ｃ０ＤＥＮ：ＺＬＫＨＡＨ １０７３ 肖仕辉．等 全骨髓姑壁法培养兔骨髓阚充质干细胞体外定向战骨诱导分化爱鉴定 ＷＷＷ．ＣＲＴＥＲ．ｏｒｇ 无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他 人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。 ４参考文献 【１】Ｌｅｅ ＨＳ，Ｈｕａｎｇ ＧＴ，Ｃｈｉａｎｇ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒ０ｍ ｆｅｍｏｒａｌ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｎｅａｒ ｔｈｅ ｓｉｔｅ ｏｆ ｏｓｔｅｏｎｅｃｒｏｓｉｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２００３；２１（２）：１ ９０—１ ９９． 【２】 Ｆｉｓｈｅｒ Ｍ，Ｈｙｚｙ Ｓ，Ｇｕｌｄｂｅｒｇ ＲＥ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｆｔｅｒ ｔｉｂｉａｌ ａｂｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ ｒａｔｓ ｉｓ ａｇｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．Ｂｏｎｅ．２０１０；４６（２）：３９６－４０１． ［３】 Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｓ，Ｋｕｒｏｄａ Ｓ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｉｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ（ＢＭＳＣ）一ａ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｓｔｕｄｙ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．２００６；１ ０８７（１）：１ ５－２７． 【４】 Ｂｕｔｎａｄｕ－Ｅｐｈｒａｔ Ｍ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｏ，Ｍｅ￣ｅｓ ＤＧ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ ｏｆ ｇｏａｔ ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｂｙ ｃｈｏｎｄｒｅｃｙｔｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒ０ｍ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ．Ｃｌｉｎ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｔａｔ Ｒｅｓ．１ ９９６；３３０）：２３４－２４３． ［５】５ Ｗａｋｉｔａｎｉ Ｓ，Ｇｏｔｏ Ｐｉｎｅｄａ ＳＪ，ｅｔ ａ１．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ｌａｒｇｅ，ｆｕｌｌ－ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｄｅｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｔｉｌａｇｅ．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ａｍ．１９９４：７６（４）：５７９－５９２． 【６】Ｌｉ ＸＦ，ＺｈａｏＪＭ，Ｓｕ Ｗ，ｅｔ ａ１．Ｚｈｏｎｇｇｕｏ Ｚｕｚｈｉ Ｇｏｎｇｃｈｅｎｇ Ｙａｎｊｉｕ ｙｕ Ｌｉｎｃｈｕａｎｇ Ｋａｎｇｆｕ．２０１１：１５（１０）：１７２１－１７２５． 李晓峰，赵劲民，苏伟．等．大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定【Ｊ】 中国组织工程研究与临床康复，２０１１，１５（１０）：１７２１—１７２５． 【７】Ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｃｈｉｎａ．Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｓｕｇｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｉｎｇ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌｓ．２００６．０９－３０． 中华人民共和国科学技术部．关于善待实验动物的指导性意见． ２００６—０９．３０． 【８】 Ａｂｄａｌｌａｈ ＢＭ，Ｋａｓｓｅｍ Ｍ．Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ（Ｓｋｅｌｅｔａ１） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ ｔＳａｔｕｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．Ｊ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．２００９； ２１８（１１：９－１２． 【９ ９】Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ ＡＪ，Ｃｈａｉｌａｋｈｊａｎ ＲＫ，Ｌａｌｙｋｉｎａ ＫＳ．Ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｉｆｂｒｅｂｌａｓｔ ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｉｎ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｇｕｉｎｅａ－ｐｉｇ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｎｄ ｓｐｌｅｅｎ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｎｅｔ． １ ９７０；３（４）：３９３－４０３． ［１０】Ｏｗｅｎ Ｍ．Ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ Ｓｕｐｐ１．１９８８； １ ０：６３．７６． 【１ １】Ｔｓｅ、／＼ Ｐｅｎｄｉｅｔｏｎ ＪＤ，Ｂｅｙｅｒ ＷＭ，ｅｔ ａ１．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２００３；７５ （３）：３８９・３９７． 【１２】Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ ＭＦ，ＭａｃｋａｙＡＭ，Ｂｅｃｋ ＳＣ，ｅｔ ａ１．Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｒｎ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９９９；２８４（５４１１）：１４３－１４７． 【１ ３】Ｊｉａｎｇ Ｙ，Ｊａｈａｇｉｒｄａｒ Ｂ Ｎ，Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ Ｒ Ｌ，ｅｔ ａ１．ｐｕｌｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒＯｍ ａｄｕｌｔ ｍａｒｒｏｗ．Ｎａｔｕｒｅ． ２００２；４１８ｆ６８９３）：４１－４９． 【１４】Ｚｈｅｎｇ ＹＨ，Ｈｅ Ｋｕａｎｇ ＳＪ，ｅｔ ａ１．Ｇｕｏｊｉ Ｙｉｙａｏ Ｗｅｉｓｈｅｎｇ Ｄａｏｂａｏ．２０１ ０；１ ６（０２）：１ ２９－１ ３４． 郑有华，何滔，匡世军，等．人骨髓间充质干细胞体外分离培养及其 生物学特性【Ｊ］＿国际医药卫生导报，２０１０，１６（０２）：１２９－１３４． １０７４ 【１５】Ｄｖｏｒａｋｏｖａ Ｊ，Ｈｒｕｂａ Ａ，Ｖｅｌｅｂｎｙ Ｖ’ｅｔ ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｅｎｔｒａｐｐｅｄｉｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｓｅｔｓ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔ．２００８； ３２（９）：１１１６－１１２５． 【１６】Ｊｉａｎｇ Ｈ，Ｘｉａｏ ＺＭ．Ｚｈｏｎｇｇｕｏ Ｌｉｎｃｈｕａｎｇ Ｋａｎｇｆｕ．２００６；１０（４５） ：１１８－１２０． 江华，肖增明．骨髓间充质干细胞在骨科疾病修复中的应用［Ｊ】．中 国ｌ临床康复，２００６。１０（４５）：１１８－１２０． 【１７】Ｈｕａｎｇ Ｔ，Ｍｅｎｇ ＺＢ，Ｊｉａ ＢＳ，ｅｔ ａ１．Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｙｉｘｕｅ．２０１０；３１（９）： １０８９．１０９１． 黄涛，孟志斌，贾丙申，等．全骨髓贴壁法分离培养ｒＢＭＳＣｓ及成骨 诱导探讨［Ｊ】．广东医学，２０１０，３１（９）：１０８９－１０９１． 【１ ８１ Ｈｕａｎｇ Ｙ，Ｌｉ ＹＨ．Ｚｈｏｎｇｇｕｏ Ｓｈｅｎｇｗｕ Ｇｏｎｇｃｈｅｎｇ Ｚａｚｈｉ．２００６； ２６（５）：８５－８８． 黄艳，李莹辉．影响骨髓间质干细胞向成骨细胞分化的因素 ［Ｊ】．中国生物工程杂志，２００６，２６（５）：８５－８８ 【１９】Ｈｕ Ｚ，Ｐｅｅｌ ＳＡ，Ｈｏ ＳＫ，ｅｔ ａ１．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｂｏｎｅ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ－ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｒａｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ａｃｌｌ ｄｉｉｆｅｒｅ－ｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｊ Ｃｒａｎｉｏｆａｃ Ｓｕｒｇ．２００５；１ ６（６）： １００６．１０１４． ［２０】Ｍｏｒａｌｅｓ Ｏ，Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ ＭＫ，Ｌｉｎｄｇｒｅｎ Ｕ，ｅｔ ａ１．Ｅ￣ｃｔｓ ｏｆ １ ａｌｐｈａ，２５・ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ３ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｏｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ＵＭＲ １ ０６ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ．Ｅｎｄｏｃ ｉｎｏＩｏｇ ２０Ｏ４：１４５（１）：８７－９４． 【２１】ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎ ＪＰ，ｖａｎ Ｄｒｉｅｌ Ｍ，ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｍｄ ＧＪ，ｅｔ ａ１．Ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｅｘｔｒａ ｅＩｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｅｕｋａｒｙｏｔ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ．２０１１；１１（１－３）： １ ９９．２２６． 【２２】Ｊａｉｓｗａｌ Ｎ，Ｈａｙｎｅｓｗｏｒｔｈ ＳＥ，Ｃａｐｌａｎ ＡＩ，ｅｔ ａ１．Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｒｉｉｆｅｄ，ｃｕｌｔｕｒｅ－ｅｘｐａｎｄｅｄ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１ ９９７； ６４（２）：２９５－３１ ２． 【２３】Ｍａｒｉｅ ＰＪ，Ｆｒｏｍｉｇｕｅ Ｏ．Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｒｅｇｅｎ Ｍｅｄ．２００６； １（４）：５３９—４５８． ［２４】Ｃｏｅｌｈｏ ＭＪ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ＭＨ．Ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｉｎ ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｐａｒｔ Ｉ１：ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ， ｂｅｔａ－ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｎｄ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ ｏｎ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｉｃ ｄｉｆｅｒｅｎｔ－ｉａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０００；２１（１１）：１０９５—１１０２． 【２５】Ｍａｎｉａｔｏｐｏｕｌｏｓ Ｃ，Ｓｏｄｅｋ Ｊ，Ｍｅｌｃｈｅｒ ＡＨ．Ｂｏｎｅ ｏｆｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ Ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｏｆ ｙｏｕｎｇ ａｄｕｌｔ ｒａｔｓ．Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．１ ９８８；２５４（２）：３１ ７－３３０． 【２６】Ｗａｎｇ ＺＳ，Ｗａｎｇ ＪＹ，Ｗａｎｇ ＢＺ，ｅｔ ａ１．Ｚｈｏｎｇｇｕｏ Ｚｕｚｈｉ ＧｏｎｇｃｈｅｎｇＹａｎｊｉｕ ｙｕ Ｌｉｎｃｈｕａｎｇ Ｋａｎｇｆｕ．２００９；１ ３（１）：１ １－１ ６． 王志顺，王江泳，王保芝。等．骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分 化的超微结构改变【Ｊ】＿中国组织工程研究与临床康复，２００９， １３（１）：１１－１６． 【２７】Ｐａｎ ＳＣ，Ｔａｎｇ ＹＪ，Ｘｉｅ ＫＧ，ｅｔ ａ１．Ｚｈｏｎｇｇｕｏ Ｚｕｚｈｉ ＧｏｎｇｃｈｅｎｇＹａｎｊｉｕ ｙｕ Ｌｉｎｃｈｕａｎｇ Ｋａｎｇｆｕ．２０１１：１５（３２）： ５９１ ８．５９２２． 潘生才＇唐毓金，谢克恭，等．大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化 的超微结构变化【Ｊ】．中国组织工程研究与临床康复，２０１１。 １ ５（３２）：５９１ ８．５９２２． Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １２００，Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０００４ ｗｗｗ．ＣＲＴＥＲ．ｏｒｇ
