广 西 医 科 大 学 学 报ＲＳＩ ＪＯＵＲＮＡＩ ＯＦ ＧＵＡＮＧＸＩ ＭＥＤＩＣＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ２０１０ Ａｕｇ；２７（４）脱钙骨基质的制备及与软骨细胞体外复合的实验研究 许圣荣赵劲民苏伟 （广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科 南宁 ５３００２１） 摘要目的：探寻良好的软骨组织工程支架材料。方法：制备兔脱钙骨基质（ｄｅｃａｌｃｉｆｉｅｄ ｂｏｎｅｍａｔｒｉｘ，ＤＢＭ），采用液体置换法检 测经脱钙２、３、４ ｄ支架材料的孔隙率。扫描电镜观察ＤＢＭ的超微结构，以及软骨细胞与ＤＢＭ体外复合培养３ ｄ的黏附情况。 结果：脱钙３ ｄ的ＤＢＭ多孔结构及空隙适合软骨细胞的黏附和增殖。软骨细胞和ＤＢＭ体外培养３ ｄ黏附良好。结论：ＤＢＭ 是良好的软骨组织工程支架材料。 关键词 软骨组织工程；脱钙骨基质；支架材料 中图分类号：Ｑ２８ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００５—９３ｏｘ（２０１０）０４—０５１９—０３ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＳＴＵＤＹ ｏＮ ＰＲＥＰＡＲＩＮＧ ＤＥＣＡＬＣＩＦＩＥＤ ＢｏＮＥ ＭＡＴＲＩＸ ＡＮＤ ＣｏＭＢＩ— ＮＡＴｌＮＧ ＷＩＴＨ ＣＥＬＬＳ ＩＮ ＶＩＴＲｏ Ｘｕ Ｓｈｅｎｇｒｏｎｇ，Ｚｈａｏ Ｊｉｎｍｉｎ，Ｓｕ Ｗｅｉ．（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐ Ｔｒａｕｍａ ａｎｄ Ｈａｎｄ Ｓｕｒｇｅｒｙ，ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ａｆｆｉｌｉａ～ ｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｎｉｎｇ ５ ３００２ １，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ ０ｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｌｏｏｋ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｍａｔｅｒｉａｌ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ—ｅｎ ｇｉｎｅｅｒｅｄ ｃａｒｔｉｌａｇｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ｄｅｃａｌｃｉ— ｆｉｅｄ ｂｏｎｅ ｍａｔｒｉＸ（ＤＢＭ）ｏｆ ｒａｂｂｉｔｓ Ｗ３Ｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ．Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ ｐｏｒｏｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂｒａｃｋｅｔ ｍａｔｅｒｉａｌ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｌｉｑｕｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｆｔｅｒ ｄｅｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔＷＯ，ｔｈｒｅｅ ａｎｄ ｆｏｕｒ ｄａｙｓ．Ｔｈｅ ｕｌｔｒａ—ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒ ｏｆ ＤＢＭ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ａｄｈｅｒｅ ｏｆ ＤＢＭ ａｎｄ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ ａｆｔｅｒ ｃｕｌｔｉｖａｔｅ ｔｈｒｅｅ ｄａｙｓ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｐｏｒｏｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＤＢＭ ｄｅｃａｌｃｉｆｉｃａｔｅｄ ｆｏｒ ｔｈｒｅｅ ｄａｙｓ ｆｉｔｔｅｄ ｔｈｅ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ ｔｏ ａｄｈｅｒｅ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ＤＢＭ ａｎｄ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ ａｄｈｅｒｅｄ ｗｅｌｌ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｃｏｎｃｌｕ－ ｓｉｏｎ：Ｔｈｅ ＤＢＭ ｗａｓ ａ ｇｏｏｄ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｍａｔｅｒｉａｌ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ—ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｃａｒｔｉｌａｇｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｔｉｓｓｕｅ—ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｃａｒｔｉｌａｇｅ；ｓｃａｆｆｏｌｄ ｍａｔｅｒｉａｌ；ｄｅｃａｌｃｉｆｉｅｄ ｂｏｎｅ ｍａｔｒｉｘ 研究表明将种子细胞直接植入关节软骨缺损部位，会流 失至关节腔，局部不会形成软骨组织 ］。合适的载体在修复 软骨缺损中起重要的作用。脱钙骨基质（ＤＢＭ）具有良好细 胞组织相容性，天然孑Ｌ隙结构，并且具有可塑性和一定的机 双蒸馏水反复冲洗、浸泡至浸泡液呈中性为止。去酸处理后 的骨块继续在ＰＢＳ液中浸泡２４ ｈ，取出后吹干，３７℃恒温干 燥至恒重（连续３次称重，每次间隔３ ｈ）。每个时间段取６块 骨，分别计算孔隙率和观察其强度。将松质骨皮质骨分开， 置一２Ｏ℃冰箱贮存备用。 １．２．２ ＤＢＭ的观察：大体观察ＤＢＭ的结构；将标本清洗、 固定、脱水、干燥、喷镀后于扫描电镜下观察。 械强度。因此，ＤＢＭ可望成为软骨组织工程支架材料。 １材料和方法 １．１ 实验动物：健康５月龄新西兰大白兔１８只，雌雄不拘， 由广西医科大学实验动物中心提供。 １．２实验方法 １．２．３ ＤＢＭ孔隙率的测定：将上述脱钙２、３、４ ｄ ３个时间 段的ＤＢＭ共１８块，以无水乙醇为置换液体，采用液体置换 法测试支架材料的孔隙率。试管内原始无水乙醇的体积为 １．２．１ ＤＢＭ的制备：取兔的四肢长骨骨端松质骨，去除干 的大小，３Ｏ 过氧化氢３７℃脱蛋白４８ ｈ，无水乙醇脱水２ 次，无水乙醚脱脂２次，过滤后吹干。将１８块松质骨随机分 成３组，分２、３、４ ｄ ３个时间段，０．６ ｍｏｌ／Ｉ ＨＣＩ室温下脱钙， ＊基金项目：广西科学基金资助项目（Ｎｏ．桂科回０３４２０１７，Ｎｏ．桂科基 Ｏ５７５０７８） Ｖｏ，载体被无水乙醇完全浸透并无气泡时（约１０ ｍｉｎ），记此 净周围软组织及骨膜，将松质骨制成０．４ ｃｍｘ０．４ ｃｍ×０．５ ｃｍ 时材料与无水乙醇的总体积为Ｖ ，体积差Ｖ 一、厂０表示支架 材料轮廓的体积，即不包括孔隙的材料体积。然后将材料从 试管中取出，记剩余的无水乙醇的体积为Ｖ ，而体积差Ｖ。一 Ｖｚ则代表浸入支架材料的无水乙醇的体积，即支架材料孔隙 的体积，Ｖ 一Ｖｚ则表示支架材料的总体积。根据公式：孔隙 率（Ｐ）：［（ｖ０一ｖ２）／（Ｖ 一ｖ２）］×ｉ００％，计算出孔隙率。 １．２．４ ＤＢＭ体外降解率的测定：将上述脱钙情况较好的 ＤＢＭ共１８块，称重每块重量相等后置于小瓶中，每瓶３块。 收稿日期：２００８一Ｏ４—０１ 加等量人工降解液（０．１ ｍｏｌ ＰＢＳ），分别于２、４、６、８、１０、１２周 各取出样本３块，干燥后测重量，取平均值并计算重量丧失 率。计算出ＤＢＭ在各个时间段的降解率并绘制出降解率曲 线。公式为：Ｐ一［（Ａ。一Ａ ）／Ａ。］×１００ （Ｐ：降解率，Ａ。： 降解前一个时间点的重量平均值，Ａ ：降解后一个时间点的 重量均值）。 １．２．５ 骨髓问充质干细胞向软骨细胞分化后与ＤＢＭ体外 培养：取向软骨细胞分化较好的细胞制成浓度为１×１０ ／ｍＩ 的细胞悬液放入含有ＤＢＭ的２４孔培养板中，与ＤＢＭ在同 一条件下进行混合培养，培养３ ｄ后进行电镜观察细胞与 ＤＢＭ的黏附情况。 １．３数据处理：采用ＳＰＳＳ１３．０统计软件包，以ａ＝０．０５为 检测水准，实验数据均用 ±Ｓ表示，对脱钙不同时间段ＤＢＭ 的孔隙率采用随机分组设计方差分析及两两比较，Ｐ＜Ｏ．０５ 为差异具有统计学意义。 ２ 结 果 ２．１ ＤＢＭ的大体观察结果：ＤＢＭ呈乳白色，表面粗糙，里面 为不规则网状孔隙，有弹性，压缩易变形，去除外力后可自动 恢复至原状（图１）。 图１ ＤＢＭ的大体观察 ２．２ ＤＢＭ的扫描电镜观察结果：ＤＢＭ布满形状不规则的孔 隙，各孔串联相通，孔隙直径在２３０～４３０ ｎｍ之间，平均孔隙 直径为３３０ ｎｍ，孔壁较粗糙并相互桥接（图２）。 图２ ＤＢＭ的扫描电镜观察（×５０） ２．３ ＤＢＭ孔隙率的测定结果：本实验在２、３、４ ｄ不同的脱 广西医科大学学报２０１０ Ａｕｇ；２７（４） 钙时间测得ＤＢＭ的平均孔隙率如（表１）所示，脱钙２ ｄ的平 均孔隙率和３、４ ｄ相比差异有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０５）；脱钙 ３ ｄ和４ ｄ ＤＢＭ的平均孔隙率比较，差异无统计学意义（Ｐ＞ ０．０５），但后者强度明显降低缺乏弹性，而前者松质骨块呈海 绵状，压缩变形并自动恢复至原状，因此本实验采用脱钙时 间为３ ｄ的ＤＢＭ。 表１ 不同脱钙时间ＤＢＭ的孔隙率比较 （ 一１８， ±５） 脱钙时间（ｔ／ｄ） 孔隙率（ ） ２ ６０．９４±８．２４ ３ ８５．３８±５．７６ ４ ８８．８２±４．９９ 注： ２ ｄ与３ ｄ和比较，Ｐ＜Ｏ．０５； ２ ｄ和 ４ ｄ比较，Ｐ＜Ｏ．０５； ３ ｄ和４ ｄ比较， Ｐ＞０．０５ ２．４ ＤＢＭ体外降解结果：ＤＢＭ在体外生理降解液中降解 时，第２～８周的降解速率较慢，从第８～１２周其降解速度明 显加快。当接近１２周时几乎完全裂解（图３）。可见随着降 解后支架材料孔隙率的增大，支架材料的相对表面积增大， 从而使降解液能充分与材料相接触，加快了降解速度。 一 瓣 琏 遨 降解时间（ｔ／周） 图３ ＤＢＭ在各时间段的降解率 ２．５细胞与ＤＢＭ体外黏附结果：本实验中将ＤＢＭ支架与 细胞复合培养３ ｄ后，进行扫描电镜观察，发现细胞大多为多 边形，向四周伸展，细胞大部分黏附在ＤＢＭ的孔壁上，细胞 间紧密接触，细胞排列较为规则，并且有细胞外基质分泌于 细胞周围，部分细胞聚集成团（图４）。 图４ 复合培养３ ｄ后的扫描电镜观察（×２ ０００） 许圣荣，等．脱钙骨基质的制备及与软骨细胞体外复合的实验研究 胶原成分破坏过多，则降低了强度和弹性。 ３讨论 理想的细胞与支架的结合是细胞能够均匀的分布于支 软骨组织工程一个重要的方面，是如何获得能够提供种 架上，细胞排列整齐，细胞问紧密接触。本实验中将软骨细 子细胞生长和细胞因子发挥作用的良好支架，三维支架材料 胞与ＤＢＭ支架复合培养３ ｄ后，发现软骨细胞大部分黏附在 在组织工程的构建中起着重要的作用。 ＤＢＭ的孔壁上，细胞大多为多边形，细胞排列较为规则，细 有实验表明，理想的生物基质材料应具备以下几点 ： 胞问紧密接触，并且有细胞外基质分泌于细胞周围，因此可 ①良好的生物相容性。在植人体内后，无论其本身或其降解 以认为两者结合良好。 产物都对机体无毒副作用，不会引起强烈的机体炎性反应和 通过我们的实验表明，ＤＢＭ制备方便，具有良好的生物 免疫排斥反应；②适度的生物降解性。材料的降解速率需与 学特性，是理想的软骨组织工程细胞载体。 种植入的细胞组织再生速率相匹配；③良好的三维立体结 参考文献： 构。可被制备成海绵状多孔性结构，为种子细胞的均匀分布 和生长提供足够的空间；④良好的表面相容性和一定的生物 ［１］Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ ＭＦ，Ｍａｃｋａｙ ＡＭ，Ｂａｃｋ ＳＬ，ｅｔ ａ１．Ｍｕｌｔｉｌｉｎ— 活性：材料表面有利于种子细胞的黏附与生长，为细胞在材 ｅａｇｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ 料表面生长增殖和分泌基质提供良好的微环境；⑤具有可塑 Ｊ Ｊ ｊ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８４（５ ４１１）：ｌ４３ １４７． 性和一定的机械强度，使材料在手术植入时和植入后的一定 ［２］ Ｓｔｏｎｅ ＫＲ，Ｓｔｅａｄｍａｎ Ｊ Ｒ，Ｒｏｄｋｅｙ ＷＧ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｇｅｎｅｒ— 时间内保持所需的外形和力学特性，从而使再生组织得以最 ａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｎｉｓｃａｌ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｗｉｔｈ ｕｓｅ ｏｆ ａ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｓｃａｆ— 大限度地过渡到生理状态。因此，本实验研究的重点内容之 ｆｏｌｄ［Ｊ］．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ，１９９７，７９Ａ：１ ７７０—１ ７７７． 一是对ＤＢＭ作为软骨组织工程支架材料的生物学特性研 ［３］ Ｋｉｍ ＢＳ，Ｍｏｏｎｅｙ ＤＪ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ 究。 ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｅｘｔｒａ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ 本实验对松质骨经过了脱脂、脱蛋白、脱钙处理。去除 Ｆ－Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９８，１６（５）：２２４—２３２． 了大部分的脂质成分和非胶原蛋白，抗原性大大降低，保留 ［４］Ｔｈｏｍｓｏｎ ＲＣ，Ｗａｋｅ ＭＣ，Ｙａｓｚｅｍｓｋｉ ＭＪ，ｅｔ ａ１．Ｂｉｏｄｅ— 了骨基质中的有诱导成软骨能力的生长因子。国内外学者 ｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｔｏ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｏｒｇａｎｓ［Ｊ］． 通过动物实验证实ＤＢＭ移植后免疫排斥反应小，可在早期 Ａｄｖ Ｐｏｌｙｍ Ｓｃｉ，１９９５，１２２：２４５ ２７４． 促进软骨及骨的形成，经脱钙和降抗原处理后获得的脱钙骨 ［５］ Ｒｅｉｎｈｏｌｚ Ｇ Ｇ，Ｌｕ Ｉ ，ＳａｒｉｓＤ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ 基质具有良好的生物相容性＿６’ ，并且认为支架材料孔径大 ｏｆ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００４，２５ 于２００ ｎｍ软骨细胞才能长人，ＤＢＭ孔隙率要达到８Ｏ 以 （９）：１ ５１１—１ ５２１． 上。本实验中脱钙３ ｄ的ＤＢＭ扫描电镜观察显示，ＤＢＭ具 ［６］ １ｗａｔａ Ｈ，Ｓａｋａｎｏ Ｓ，Ｉｔｏｈ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｈｏｎｅ 有良好的三维空间结构，平均孔径为３３０ ｎｍ，天然的多孔隙 ｍａｔｒｉｘ ａｎｄ ｎａｔｉｖｅ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｏｒｔｈｏ— 结构，孔隙率达到８５ 以上，可提供宽大的内表面积和空间 ｐａｅｄｉｃ ｓｕｒｇｅｒｙ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｌａｔ Ｒｅｓ，２００２，（３９５）： 容纳大量的种子细胞，利于细胞黏附、生长、细胞外基质沉 ９９—１０９． 淀、营养和氧气的进入以及代谢产物的排出，符合软骨组织 ［７］ Ｋｌａｗｉｔｔｅｒ Ｊ，Ｈｕｌｌｂｅｒｔ Ｓ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｏｕｓ ｃｅｒａｍｉｃｓ 工程载体材料的要求；另一方面脱钙时间过短（脱钙２ ｄ），达 ｆｏｒ ｔｈｅ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ｌｏａｄ ｂｅａｒｉｎｇ ｏｒｔｈｏｐｄｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ 不到需要的孔径和孔隙率，而脱钙时间过长（脱钙４ ｄ），支架 ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ，１９７１，２：ｌ６１—１６５． 广西医科大学学报２０１０ Ａｕｇ；２７（４） 黄曲霉毒素诱发大鼠肝细胞癌过程中 Ｐ３８ ｍＲＮＡ表达水平的动态变化 陈茂伟 曹骥苏建家 焦杨 欧超 班克臣 （广西医科大学第一附属医院传染病科南宁 ５３００２１） 摘要 目的：了解Ｐ３８ ｍＲＮＡ在黄曲霉毒素相关肝细胞癌发生发展过程中的变化情况。方法：取雄性４周龄ＳＤ大鼠７７只为 ＊资金项目：李嘉诚基金会西部教育计划赠款项目（Ｎｏ．教外港 研究对象，随机分为实验组６６只，对照组¨只。实验组应用黄 ［２００１１３３）；广西留学回国人员科研基金资助项目（Ｎｏ．桂科回 曲霉毒素Ｂ１诱发肝细胞癌，对照组按正常饲养方法饲养，两组 ０２３６００７） 大鼠分别于实验第１２、２Ｏ、３６、４６周进行肝组织活检，第５８周时 １广西肿瘤防治研究所 处死取肝。所有组织标本均进行常规病理组织学检测，并应用 ２广西医科大学药学院 ＲＴ—ＰＣＲ检测Ｐ３８ ｍＲＮＡ的表达水平。结果：实验组存活至实 △通信作者，Ｅｍａｉｌ：ｊｉａｎｊｉａｓｕ２００２＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ 验结束并发生肝细胞癌的大鼠共２４只（出癌组），６只无任何肿 收稿日期：２ｏ１ｏ ０１ １１ 瘤发生（未出癌组），对照组１１例均未发生肿瘤。各组大鼠均可