山西医药杂志２０１４年２月第４３卷第３期 Ｓｈａｎｘｉ Ｍｅｄ Ｊ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１４，Ｖｏ１．４３，Ｎｏ．３ ・２４３・ 论 著 ● 实时定量聚合酶链反应结合Ｔａｑｍａｎ荧光探针 ＪＣＶ—Ｐ检测肾移植受者ＪＣ病毒 韩 永 蔡 明 王 强 许晓光 黄海燕 许 亮 周文强 肖 漓 石炳毅 【摘 要】 目的 建立肾移植受者尿液和外周血ＪＣ病毒（ＪＣＶ）感染实时荧光定量聚合酶链反应（ＰＣＲ）检 测方法。方法针对ＪＣＶ基因组设计特异性引物ＪＣＶ－Ｆ和ＪＣＶ—Ｒ，Ｔａｑｍａｎ荧光探针ＪＣＶ－Ｐ，探针的５ 端标记有 荧光基团，在除５ 端外的任意一个位置上标记有淬灭基团；然后处理待测样本，进行ＰＣＲ反应，建立重组质粒标 准曲线，评价特异性、灵敏度、重复性。结果将检测阳性的扩增产物进行基因测序，测序结果经ＢＬＡＳＴ比对后 证实ＪＣＶ基因序列；利用上述方法对８６份样本进行检测：２０份ＪＣＶ血清样本及２Ｏ份ＪＣＶ尿液样本检测均为 阳性，有ｓ型扩增曲线，动态范围测定显示１Ｏ３～１ ０１０拷贝／ｍＬ标准曲线具有良好的相关性；２Ｏ份健康人尿液 样本和２Ｏ份血液样本及６份临床常见的其他病原体血液样本检测均为阴性，无ｓ型扩增曲线。结论实时荧光 定量ＰＣＲ结合Ｔａｑｍａｎ荧光探针ＪＣＶ－Ｐ检测肾移植术后患者ＪＣＶ方法可用于肾移植术后ＪＣＶ感染的的早期诊 断，对预防ＪＣＶ感染造成的多瘤病毒相关性肾病（ＰＶＡＮ）和进行性多灶性脑白质病（ＰＭＬ）具有一定意义。 【关键词】聚合酶链反应； 肾移植；ＪＣ病毒 Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＪＣ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｕｒｉｎｅ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｆｒｏｍ ｒｅｎａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ ｂｙ ｒｅａｌ’ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ＴａｑＭａｎ－ＪＣＶ－Ｐ ｐｒｏｂｅ Ｈａｎ Ｙｏｎｇ，Ｃａｉ Ｍｉｎｇ，Ｗａｎｇ Ｑｉａｎｇ，Ｘｕ Ｘｉａｏｇｕａｎｇ，Ｈｕａｎｇ Ｈａｉｙａｎ，Ｘｕ Ｌｉａｎｇ， Ｚｈｏｕ Ｗｅｎｑｉａｎｇ，Ｘｉａｏ Ｌｉ，Ｓｈｉ Ｂｉｎｇｙｉ．Ｏｒｇａｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｅｉｊ ｉｎｇ Ｋｅｙ Ｏｒｇａｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｔｈｅ ３０９ｔｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ＰＬＡ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９１，Ｃｈｉｎａ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ＪＣＶ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｕｒｉｎｅ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｉｎ ｒｅｎａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ａｎｄ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｉｔｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ＪＣ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅ，ＪＣＶ—Ｆ，ＪＣＶ—Ｒ ａｎｄ Ｔａｑｍａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅ ＪＣＶ－Ｐ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ．５ ｅｘ— ｔｒｅｍｉｔｙ ｏｆ Ｔａｑｍａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅ ＪＣＶ－Ｐ ｗａｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｗｉｔｈ ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ．Ｅｘｃｅｐｔ ５ ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ，ｏｔｈｅｒ ｓｉｔｅｓ ｗｅｒｅ ｍａｒｋｅｄ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｇｒｏｕｐ；ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｆｔｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｐｒ０ｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｉｓ ａｓｓａｙ ｗｅｒｅ ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｓｙｓｔｅｍ— ａｔｉｃａｌｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｙ ＢＩ ＡＳＴ ｗａｓ ｔｈｅ ＪＣ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；Ｅｉｇｈｔｙ－ｓｉｘ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ，ｔｗｅｎｔｙ ｃａｓｅｓ ｏｆ ＪＣＶ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ ｔｗｅｎｔｙ ｃａｓｅｓ ｏｆ ＪＣＶ ｉｎ ｕｒｉｎｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｈａｄ ａ ｇｏｏｄ Ｓ－ｔｙｐｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ．Ｄｙｎａｍｉｃ ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａ ｇｏｏｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ １０３～１ ０１０ ｅｏｐｉｅｓ／ｍＬ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅｓ．Ｔｗｅｎｔｙ ｕｒｉｎｅ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ ｔｗｅｎｔｙ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ｈｅａｌｔｈｙ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ，ｓｉｘ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｗｅｒｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ，ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ Ｓ－ｔｙｐｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ＴａｑＭａｎ—ＪＣＶ－Ｐ ｐｒｏｂｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｅａｒｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ＪＣ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ＪＣ ｖｉｒｕｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ ｌｅｕｋｏｅｎｐｈａ１ａｐａｔｈｙ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ； Ｋｉｄｎｅｙ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ； ＪＣ ｖｉｒｕｓ ＪＣ病毒（ＪＣＶ）属人类多瘤病毒，是一种小双链 ＤＮＡ病毒。ＪＣＶ由Ｐａｄｇｅｔｔｄ等［１ 于１９７１年首先 在进行性多灶性脑白质病（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ 基金项目：国家自然科学基金面上项目（３１３７１３９５）） 国际发明专利：专利号２０１１１０２１８９１．１ ｌｕｋｏｅｎｐｈａｌａｐａｔｈｙ，ＰＭＬ）患者中发现并分离出。 器官移植后，免疫抑制剂的使用是诱导多瘤病毒激 活复制的重要原因，其中，４Ｏ 以上的肾移植患者 可检测到ＪＣＶ的复制。ＪＯｇ的感染也可致肾移植 患者的多瘤病毒相关性肾病（ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ—ａｓｓｏｃｉ— 作者单位：１０００９１北京，解放军３０９医院全军器官移植 研究所 通信作者：石炳毅，Ｅｍａｉｌ：ｓｈｉｂｉｎｇｙｉ＠ｍｅｄｍａｉｌ．ｃｏｒｎ．ｃｎ 山西医药杂志２０１４年２月第４３卷第３期 Ｓｈａｎｘｉ Ｍｅｄ Ｊ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１４，Ｖｏ１．４３，Ｎｏ．３ ａｔｅｄ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ，ＰＶＡＮ）。实时荧光定量聚合酶 链反应（ＰＣＲ）技术是在原来普通定性ＰＣＲ的基础 上在反应体系中加入一段特异性探针，使得ＰＣＲ 反应结果更加准确、特异性更高、更可靠，整个反应 过程都是在封闭管中进行，不会造成污染导致的假 阳性结果出现＿＿２］。目前国内对ＪＣＶ的研究尚属空 白，更没有成熟的检测方法或试剂。迫切需要能够 实现快速、有效且准确检测ＪＣＶ的产品，以用于 ＪＣＶ载量的检测，ＪＣＶ相关性疾病的预测及治疗监 测。 １材料与方法 １．１ 临床样本收集：选择明确诊断的肾移植后 ＪＣＶ感染者ＪＣＶ血液样本２Ｏ份、ＪＣＶ尿液样本２０ 份；健康人尿液样本２０份、血液样本２０份；乙肝病 毒（ＨＢＶ）血液样本、丙肝病毒（ＨＣＶ）血液样本、 ＥＢ病毒（ＥＢＶ）血液样本、人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ） 血液样本、人类细小病毒Ｂ１９（ＨＰＶ Ｂ１９）血液样本 和ＢＫ病毒（ＢＫＶ）血液样本各１份，共８６份样本 进行检测，利用自行设计的一套实时荧光定量ＰＣＲ 检测ＪＣＶ。 １．２ 诊断标准：①２Ｏ份ＪＣＶ血清标本及２Ｏ份 ＪＣＶ尿液标本：肾移植术后血液或尿液实时ＰＣＲ 病毒拷贝数达到阳性标准的标本；②健康人尿液样 本２Ｏ份、血液样本２０份：均选健康人群体检时的 血液和尿液标本；③其余６份血液样本均选自患有 相对疾病，同时也无任何其他相关疾病的患者血液 标本。 １．３纳入标准：①肾移植后ＪＣＶ感染患者。②健 康人群只感染ＪＣＶ一种病毒者。③健康体检者。 ④ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＥＢＶ、ＨＣＭＶ、ＨＰＶ Ｂ１９及ＢＫＶ 感染同时排除ＪＣＶ感染者。⑤实验过程符合国务 院办公厅颁发《人体器官移植条例》医院伦理学标 准的要求。 １．４仪器和试剂：本试验采用ＡＢＩ ７５００荧光定量 ＰＣＲ仪（美国ＡＢＩ公司），离心机（Ｂｅｃｋｍａｎ公司）， 微量加样器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）。体液ＤＮＡ提取试 剂盒购自杭州维特洁生化有限公司，Ｔａｑ酶、 ｄＮＴＰｓ等实时荧光定量ＰＣＲ相关试剂、大肠杆菌 感受态细胞ＪＭ１０９、ＤＮＡ凝胶回收试剂盒 （ＤＶ８Ｏ５Ａ）购自宝生物工程（大连）有限公司，质粒 提取试剂盒（Ａ７１００）购自天根生化科技（北京）有 限公司；引物片段由北京鑫诺美迪基因检测技术有 限公司合成。 １．５模板制备：血清样本采集：用无菌注射器在受 检者手臂弯曲处或手背处抽取静脉血３～５ ｍＬ，注 入无菌收集管，室温放置不超过４ ｈ，待样本自行析 出血清或直接室温１ ６００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ分离出 血清，转移到１．５ ｍＬ灭菌离心管中备用。尿液样 本采集：留取中段晨尿约２０ ｍＬ（不超过容器体积 的２／３）密封送检。 标本保存与处理：样本应尽快检测，４℃保存 不超过２４ ｈ，一２０℃条件下可以长期保存。另外 肝素可能会抑制ＰＣＲ反应，本试剂盒不适用于含 有肝素的样本检测。ＪＣＶ样本（尿液与血液）的处 理与ＤＮＡ提取：采用煮沸裂解法处理样本提取核 酸。①血液样本：取１００ Ｌ血清或血浆样本与５０ Ｌ浓缩液混匀，１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ后去除 上清，加入２５ Ｉ 裂解液混匀沉淀，１Ｏ０℃煮沸１０ ｍｉｎ，离心１０ ｍｉｎ，上清即为纯化的病毒核酸。②尿 液样本：取１ ０００“Ｌ尿液样本，１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎ后去除上清，加入５Ｏ肚Ｌ裂解液混匀沉淀， １００℃煮沸１０ ｒａｉｎ，离心１０ ｒａｉｎ，上清即为纯化的 病毒核酸。 １．６引物与探针的设计：针对ＪＣＶ基因组设计特 异性引物ＪＣＶ—Ｆ和ＪＣＶ—Ｒ，与Ｔａｑｍａｎ荧光探针 ＪＣＶ—Ｐ。见表１。Ｔａｑｍａｎ荧光探针ＪＣＶ—Ｐ的５ 端 标记的荧光基团是６一羧基荧光素（ＦＡＭ），３ 端标记 的淬灭基团是黑洞淬灭剂１（ＢＨＱ１）。 表１引物和探针序列 名称 序列 ＪＣＶ—Ｆ ５＇－ＧＧＴＡＴＡＣＡＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣＡＡＣＡ一３ ＪＣＶ—Ｒ ５＇－ＣＡＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＡＡＣＡＣＡＧＧＡＴＣＣ一３ ＪＣＶ－Ｐ ５ 一ＧＣＡｒＧＣＡＧ ｒＩ ’ＡＣＡＧＧＡＡＡＧＴＣＴＩｖＩ’ＡＧＧＧＴ一３ ＪＣＶ ＤＮＡ的ＰＣＲ液的配制：将各成分（引物、 探针和反应缓冲液）按一定比例混合在一起。单个 反应聚合酶链式反应液包括：１０×反应缓冲液２．５ ＦＬ，ＪＣＶ—Ｆ（１０ Ｆｍｏｌ／Ｌ）Ｏ．６０ ＦＬ，ＪＣＶ—Ｒ（１０ ｕｍｏｌ／Ｌ）０．３０ ＦＬ，ＪＣＶ—Ｐ（１０ Ｆｍｏｌ／Ｌ）０．７０ ｕＬ， ｄＮＴＰ ３．０ Ｌ，最后用无菌超纯水将反应体系补至 １９．８ ｕＬ。 检测反应：取ＰＣＲ液１９．８ Ｌ和ＤＮＡ聚合酶 Ｏ．２ ｕＬ（１个单位）配制成反应体系，然后加入５．０ Ｌ待检模板。每批次反应均设置阴性质控（Ｈ ０） 和ＪＣＶ定量标准品Ｉ～Ⅳ。反应条件：９４℃，４ ａｒｉｎ；９４℃，１５ Ｓ；６０。Ｃ，３５ ｓ，４０个循环。采用荧光 定量ＰＣＲ仪，荧光信号收集时设定为ＦＡＭ荧光 素，荧光信号收集设在６０。Ｃ。ＪＣＶ样本（尿液与血 山西医药杂志２Ｏ１４年２月第４３卷第３期 Ｓｈａｎｘｉ Ｍｅｄ Ｊ。Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１４，Ｖｏ１．４３，Ｎｏ．３ 液）的处理与ＤＮＡ提取：采用煮沸裂解法处理样本 与提取核酸。构建ＪＣＶ定量标准品工～Ⅳ。 １．７结果判断：检测通道没有出现ｓ型扩增曲线， 判定为ＪＣＶ阴性。检测通道出现Ｓ型扩增曲线， 判定为阳性，并利用ＪＣＶ定量标准品检测所生成 的标准曲线计算待测样本的浓度（拷贝／ｍＬ）。检 测反应时，ＪＣＶ定量标准品工～Ⅳ［浓度分别是（５ ×１０ ）～（５×１０ ）拷贝／ｍＬ］与样品同时检测，ＪＣＶ 定量标准品工～Ⅳ的靶基因浓度已知。根据定量 标准品浓度与检测结果ＣＴ值，系统自动生成一条 标准曲线。根据待测样品的检测ＣＴ值，可计算出 样品中靶基因的浓度。 ２ 结 果 结果见图１。２Ｏ份ＪＣＶ血液样本及２Ｏ份ＪＣＶ 尿液样本检测均为阳性，有Ｓ型扩增曲线通过计算 机生成的标准曲线，动态范围测定显示在１Ｏ。～ １Ｏ 拷贝／ｍＬ标准曲线具有良好的相关性；健康人 尿液样本（２０份），血液样本（２０份），及临床常见的 其他病原体，包括ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＥＢＶ、ＨＣＭＶ、 ＨＰＶ Ｂ１９和ＢＫＶ各１份检测均为阴性，无Ｓ型扩 增曲线。将检测阳性的扩增产物进行基因测序，测 序结果经ＢＬＡＳＴ对比后证实为ＪＣＶ基因序列。 ３讨 论 ＪＣＶ是一种机会感染性病原体，健康人群中血 清学抗体阳性率高达８Ｏ 以上。初次感染一般发 生在儿童时期，并且多无临床症状。形态学上，尿 液中Ｄｅｃｏｙ细胞检测与肾组织活检均不能区分 ＢＫＶ与ＪＣＶ感染。ＪＣＶ具有致瘤性，近年国外研 究结果发现，ＪＣＶ在体外可使人及动物多种组织类 型正常细胞发生恶性转化，在仓鼠及转基因小鼠体 内可诱发多种肿瘤形成，但其致瘤机制尚不清 楚Ｅ 。 目前临床上对ＪＣＶ引起的ＰＶＡＮ和ＰＭＬ尚 无有效的治疗方法，目前最重要的治疗措施是重建 机体免疫功能，对于肾移植受者来说，免疫抑制剂 的减量或停药有利于改善临床症状。另外国内外 研究也取得了一定进展，例如：①针对提高ＪＣＶ特 异性细胞毒性Ｔ细胞水平的免疫调节治疗，可能是 解决ＰＶＡＮ和ＰＭＬ治疗难题的新途径ｒ４］。②抗 病毒治疗：到目前为止，仍然没有能够特异性识 别、杀伤ＪＣＶ的药物出现。一项多中心的前瞻性 研究发现，联合应用阿糖胞苷经静脉或鞘内给药并 不能比单独进行高效抗反转录病毒治疗 （ＨＡＡＲＴ）得到更好的临床治疗效果［５］。③免疫 调节治疗：干扰素一ａ、干扰素一Ｂ、白细胞介素一２等都 可能有助于恢复被ＰＭＬ损害的神经系统功能。血 清素一２ａ受体阻断剂可能阻止ＪＣＶ侵犯中枢神经 系统及其播散。这类药物包括奥氮平、米氮平、齐 拉西酮、利培酮等＿６］。④造血生长因子：白细胞介 素一７、重组人粒细胞集落刺激因子都能够加速淋巴 细胞成熟，联合使用免疫球蛋白，能促进机体对 ｊｃｖ产生免疫应答ｌ＿７］。⑤拓扑异构酶抑制剂等药 物也可能对ＪＣＶ引起的ＰＶＡＮ和ＰＭＬ起到治疗 及预防作用Ｌ８］。ＪＣＶ的早期诊断尤为重要，采取早 诊断、早治疗的策略可以有效地防止ＪＣＶ再繁殖 导致的移植肾损害。 实时荧光定量ＰＣＲ检测方法建立的关键是外 标准品的制备［ｇ］。外参照标准品通常由以下几种 方式获得：①直接化学合成单链目的基因片段，它 的优点是纯度高、定量准确，但受化学合成工艺的 限制。②利用设计的引物从可疑感染标本获得扩 增片段并基因测序验证，它的优点是方法简单，对 于本实验而言，需要设计合适引物从大量标本 ＤＮＡ抽提物中扩增所需要的野生型靶基因片段， 再将扩增的ＰＣＲ产物进行测序确认，工作量较大， 而且结果确认困难。③从纯化病毒株扩增片段，克 隆入载体，制备质粒作为标准品，此方法获得的标 准品质粒特异性好，纯度较高，性质稳定，而且由于 其相对分子质量一般较大，不易造成污染出现假阳 性；同时，质粒后期的大量制备方便，价廉¨１。’ｎ］。但 目前国内尚无纯化的ＪＣＶ株保存＿】 ，直接应用第 ３种方法获得外标准品有困难，因此将第１种和第 ２种方法结合起来，构建的质粒作为实验标准品具 有稳定性、重复性好，扩增效率高等特点，获得较为 满意的效果，本研究所应用的ＴａｑＭａｎ ＪＣＶ－Ｐ探针 即为将第１种和第２种方法结合起来构建的质粒， 对目标序列有很高的特异性，而且设计相对简单， 定量准确，无需内参照，方法操作简单、安全、自动 化程度高而且可预防污染，可以做到绝对定量。通 过方法学评价可以看出，本法具有很好的重复性、 ・ ２４６ ・ 山西医药杂志２０１４年２月第４３卷第３期 Ｓｈａｎｘｉ Ｍｅｄ Ｊ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１４，Ｖｏ１．４３，Ｎｏ．３ 特异性、较高的灵敏度（１０。拷贝／ｍＬ）和较宽的线 性范围（１０。～１Ｏ 。拷贝／ｍＬ）。 ［４］ 蒋荣猛，黄昌宏，李兴旺．Ｊｃ病毒研究进展［Ｊ］．传染病信息，２Ｏ１Ｏ，２３（６）：３７２—３７５． ｆ ＳＡ，ＭｃＫｅｅｖｅｒ ＰＥ，ｅｔ ａ１．Ｖｉｒａｌ—ｉｎｄｕｃｅｄ ［５］ Ｌｏｎｄｏｎ ＷＴ，ＨｏｕｆＪＣＶ早期临床症状缺乏特异性，一些临床表现 会误诊为急性排斥反应。因此本文所建立的荧光 定量ＰＣＲ结合ＴａｑＭａｎ ＪＣＶ—Ｐ探针技术检测肾移 植受者尿液、外周血中的ＪＣＶ，特异性好，灵敏度 ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａｓｉｎ ｓｑｕｉｒｒｅｌ ｍｏｎｋｅｙｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｇ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｌ Ｒｅｓ， １９８３，１０５：２２７—２３７． ［６］ 鲍玉洲，王莉，步星耀，等．ＳＶ４０ ＢＫＶ及ＪＣＶ在人脑肿瘤中 的表达［Ｊ］．中国肿瘤临床，２００４，３１（２２）：１２６５—１２６７． 高，尚可以快速、简便对ＪＣＶ相关性肾病进行筛 查，一般３０ ｍｉｎ即可得到反应结果，且成本低、假 阳性少，可用于临床肾移植术后ＪＣＶ感染的早期 ［７］ Ｋｕｓｎｅ Ｓ，Ｖｉｌｃｈｅｚ ＲＡ，Ｚａｎｗａｒ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ ｊｃ ｕｒｉ— ｎａｒｙ ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｉｎ ｋｉｄｎｅｙ ａｎｄ ｌｉｖｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ ａｓｓｏｃｉ— ａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ ｃｌｅａｒａｎｃｅ［Ｊ］．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ， ２０１２，２０６（６）：８７５－８８０． 诊断，指导临床早期治疗、避免造成移植肾功能丧 失具有重要的临床意义。按照本方法设计的用于 检测ＪＣＶ的试剂盒，经过验证具有敏感性高、特异 性好、反应速度快、假阳性少且成本低的优势，已经 ［８］邢华医，杜怡峰．进行性多灶性白质脑病［Ｊ］．临床神经病学 杂志，２Ｏ１２。２５（２）：１４７—１４８． ａｃｈｅｎｂｅｒｇ ＣＢ，Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ ｊｃ，ｅｔ ａ１．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ［９］ Ｒａｍｏｓ Ｅ，Ｄｒｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ ｉｎ ６７ ｒｅｎａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ 申请专利，适合于大规模临床开展，因而能保证及 时的病例诊治及治疗效果监测。 参考文献 Ｅａ］Ｐａｄｇｅｔｔ ＢＬ，Ｗａｌｋｅｒ ＤＬ，ＺｕＲｈｅｉｎ ＧＭ，ｅｔ ａ１．Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｐｏｖａ— ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｗｉｔｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｔｉｆｏ—— ｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ，２００２，１３（８）：２１４５—２１５１． ［１０２ Ｓｉｇｕｉｅｒ Ｍ，Ｓｅｌｌｉｅｒ Ｐ，Ｂｅｒｇｍａｎｎ ＪＦ．ＢＫ—ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ：ａ ｌｉ— ｔｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｍｅｄ Ｍａｌ Ｉｎｆｅｃｔ，２０１２，４２（５）：１８１—１８７． ａ ＪＥ，Ｒｏｍｅｒｏ—Ｇｏｍｅｚ ＭＰ，ｅｔ ［１１］ Ｂａｒｃｅｎａ—Ｐａｎｅｒｏ Ａ，Ｅｃｈｅｖａｒｒｉａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒ— ｎａｌｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｃａｌ１ｅｕｃｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ，１９７１，１（７７１２）：１２５７— １２６０． ＢＫＶ ａｎｄ ＪＣＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ［Ｊ］．Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２０１２，３５（２）：１７３—１７９． ｎｅｚ ＰＡ，Ｋｏｕｒｉ Ｖ，Ｃｏｒｄｅｒｏ Ｇ．ｅｔ ａ１．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎ ［１２］ Ｍａｒｔｉ［２３刘龙山，王长希．多瘤病毒及其相关的移植肾病ＥＪ］．中华’肾 脏病杂志，２００５，２１（９）：５５８—５６０． ｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ ＢＫＶ，ＪＣＶ ａｎｄ ＳＶ４０ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ［３］Ｔａｈｅｒｉ Ｓ，Ｋａｆｉｌｚａｄｅｈ Ｆ，Ｓｈａｆａ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ— ｏｍａｖｉｒｕｓ（ＢＫ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｊｃ ｖｉｒｕｓｅｓ）ｖｉｒｕｒｉａ ｉｎ ｒｅｎａｌ ｔｒａｎｓ— ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ Ｃｕｂａｎ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ［Ｊ］．Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ，２０１２，１５７（２）： ３１５—３２１． ｐｌａｎｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｋｉｄｎｅｙ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ Ｒｅｓ Ｍｅｄ Ｓｃｉ．２０１］．】６（７）．９】６ ９２２ （收稿日期：２０１３－０９—０３） 消 息 本刊加入中国知网中国全文数据库的声明 本刊已许可中国学术期刊（光盘版）电子杂志社在中国知网及其系列数据库产品中以数字化方式复制、 汇编、发行、信息网络传播本刊全文。该社著作权使用费与本刊稿酬一并支付。作者向本刊提交文章发表的 行为即视为同意我社上述声明。 本刊编辑部
