・适用技术・ 蛋白质印迹技术在生物医学中的应用方法 秦继迅 （遵义市生产力促进中心５６３０００） 摘要：蛋白质印迹（Ｗｅｓｔｅｎ ｂｌｒｏｔ）技术是通过聚丙烯酰胺电泳根据分子量大小分离蛋白后转移到 杂交膜上，然后通过一抗／二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。蛋白质印迹技术进行蛋白质分 析最流行和作成熟的技术之一，超过６０％的生命科学工作者使用该方法。 关键词：Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ免疫转膜显色抗体 ＷｅｓｔｅｍＢｌｏｔ中文一般称为蛋白质印迹。它是 分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种 持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以 固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗 反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离 的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广 泛应用于检测蛋白水平的表达。 实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶 体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起 电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通 过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在 所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。 蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福 大学的乔治・斯塔克（ＧｅｏｒｇｅＳｔａｒｋ）。在尼尔・伯 奈特（ＮｅａｌＢｕｍｅｔｔｅ）于１９８１年所著的《分析生物化 学》（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）中首次被称为Ｗｅｓｔｅｒ－ ｎＢｌｏｔ。 ２分类 ＷｅｓｔｅｍＢｌｏｔ显色的方法主要有以下几种： ｉ．放射自显影 ｉｉＩ底物化学发光ＥＣＬ ｉｉｉ．底物荧光ＥＣＦ １原理 ｉｖ．底物ＤＡＢ呈色 ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ与Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交或Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂 现常用的有底物化学发光ＥＣＬ和底物ＤＡＢ呈 交方法类似，但ＷｅｓｔｅｍＢｌｏｔ采用的是聚丙烯酰胺 色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前 凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显 发表文章通常是用底物化学发光ＥＣＬ。只要买现 色”用标记的二抗。经过ＰＡＧＥ分离的蛋白质样 成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二 品，转移到固相载体（例如纤维素膜ＮＣ膜） 抗用ＨＲＰ标记）：反应底物为过氧化物＋鲁米诺，如 上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保 遇到ＨＲＰ，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。 ２０１０年荤ｌ斑 ・逋用玟不。 ３操作 效的进行转移。这种方法是用有孔的塑料和有机 提取细胞或组织蛋白、测定大致含量 制备ＳＤＳ．ＰＡＧＥ胶 Ｉ 玻璃板将凝胶和纤维素膜夹成”三明治”形状， 而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳， 选择适当的电泳方向就可以使蛋白质离开凝胶结 合在纤维素膜上。转移后的纤维素膜就 称为一个印迹（ｂｌｏｔ），用于对蛋白质的进一步检 测。印迹首先用蛋白溶液（如１０％的ＢＳＡ）处理以 蛋白样品变性、电泳 Ｊ 电泳转膜 ； 封闭纤维素膜上剩余的疏水结合位点，而后用 所要研究的蛋白质的抗血清（一抗）处理，印迹中 只有待研究的蛋白质与一抗结合，而其它蛋白质不 与一抗结合，这样清洗去除未结合的一抗后，印迹 封闭 ｌ 一抗 中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。处 ＴＢＳＴ洗涤 ｌ 理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是 指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗是 抗鼠Ｉｇ Ｇ的抗体。处理后，带有标记的二抗与一 抗结合，可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白 质的位置。目前有结合各种标记物的抗特定Ｉｇ Ｇ 的抗体可以直接购买作为标记的二抗。最常用的 一ＨＲＰ标记的二抗 ｌ ＴＢＳＴ洗涤 ｌ ＥＣＬ试剂作用 Ｉ 种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用 Ｘ．光片曝光、显影 ｌ 适当的底物溶液处理，当酶纯化底物生成有颜色的 产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋 结果分析 白质的位置。在酶连抗体中使用的酶通常是碱性 磷酸酶或辣根过氧化物酶。碱性磷酸酶可以将无 色的底物５一溴一４一氯吲哚磷酸盐（ＢＣＩＰ）转化为蓝色 蛋白质印迹法首先是要将电泳后分离的蛋白 质从凝胶中转移到纤维素膜上，通常有两种方 法：毛细管印迹法和电泳印迹法。毛细管印迹法是 将凝胶放在缓冲液浸湿的滤纸上，在凝胶上放一片 纤维素膜，再在上面放一层滤纸等吸水物质并 的产物；而辣根过氧化物酶可以以Ｈ Ｏ：为底物，将 ３一氨基．９ 乙基咔唑氧化成褐色产物或将４一氯萘酚 氧化成蓝色产物。另一种检测辣根过氧化物酶的 方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶在Ｈ：Ｏ： 存在下，氧化化学发光物质鲁米诺（１ｕｍｉｎｏｌ，氨基苯 用重物压好，缓冲液就会通过毛细作用流过凝胶。 缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到纤维素膜 二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可 以增大１０００倍，通过将印迹放在照相底片上感光 就可以检测辣根过氧化物酶的存在。除了酶连二 抗作为指示剂，也可以使用其它指示剂，主要包括 以下一些：Ｔ１２５标记的二抗：可以通过放射性自显 影检测。荧光素异硫氰酸盐标记的二抗：可以通过 上，纤维素膜可以与蛋白质通过疏水相互作用 产生不可逆的结合。这个过程持续过夜，就可以将 凝胶中的蛋白质转移到纤维素膜上。但这种 方法转移的效率较低，通常只能转移凝胶中一小部 分蛋白质（１０％ ２０％）。电泳印迹可以更快速有 ２０１０年第ｌ期 ‘埴用投木。 在紫外灯下产生荧光来检测。Ｔ１２５标记金黄色葡 于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检 萄球菌蛋白Ａ（ＰｒｏｔｅｉｎＡ）：ＰｒｏｔｅｉｎＡ可以与ＩｇＧ的 测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这 Ｆｃ区特异性的结合，因此ＰｒｏｔｅｉｎＡ可以代替二抗： 标记的二抗：二抗通过微小的金颗粒包裹，与一抗 样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以 Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ显色或者发光体系是否正常。 １１２５标记的ＰｒｏｔｅｉｎＡ通过放射性自显影检测。金 作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个 结合时可以表现红色。生物素结合的二抗：印迹用 常用的蛋白质内参有ＧＡＰＤＨ和细胞骨架蛋 生物素结合的二抗处理后，再用碱性磷酸酶或辣根 过氧化物酶标记的凝集素处理。生物素可以与凝 集素紧密结合，这种方法实际上相当于通过生物素 与凝集素的紧密结合将二抗与酶连接，通过酶的显 色反应就可以进行检测。这种方法的优点是由于 生物素是一个小分子蛋白，一个抗体上可以结合多 个生物素，也就可以结合多个酶连接的凝集素，可 以大大增强显色反应的信号。除了使用抗体或蛋 白作为检测特定蛋白的探针以外，有时也使用其它 探针如放射性标记的ＤＮＡ，可以检测印迹中的ＤＮＡ 结合蛋白。 ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ结果检测：化学发光法检测，膜与 化学发光底物孵育，经ｘ胶片曝光显影。图片扫 描保存为电脑文件，并用ＧＩＳ１０００分析软件将图片 上每个特异条带灰度值的数字化。ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ数 据分析：目的蛋白的灰度值除以内参ＧＡＰＤＦ的灰 度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白 相对含量。 ４注意事项 内参即是内部参照，对于哺乳动物细胞表达来 说一般是指由管家基因编码表达的蛋白，它们在各 组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达 水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正蛋 白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验 结果的准确性。 在Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ中使用内参其实就是在 ＷＢ过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这 样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由 白ｂｅｔａ ａｃｔｉｎ或ｂｅｔａ．ｔｕｂｕｌｉｎ。一般要选择一个在处 理因素作用的条件下蛋白含量不会发生改变的蛋 白作内参。 为了让实验更加严谨有说服力都要设计对照 实验，对照分为：阳性对照（最好有标准品（比如Ｐ— ａｃｔｉｎ，ＧＡＰＤＨ）或阳性血清）；阴性对照（测血时用 相应小鼠未免疫血清（即正常血）；空白对照（不加 一抗，用ＰＢＳ代替）；无关对照（用无关抗体）。一 抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择最适当 的比例，一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背 景的深浅。实验设计时所采用的抗原批次要一样， 尽量的避免人为的带来个体差异。特别在做裂解 液时更要注意所采用的操作条件，尽可能的排除可 变因素给实验带来不确定性。凝胶的质量直接影 响以后的实验结果，要特别注意几点：凝胶要均一 没有气泡；积层胶与分离胶界面要水平；ＡＰ和ＴＥＭ— ＥＤ的量不能过多，太多会导致胶易脆裂；拔梳子 时要快，尽量保证点样孔平整。电泳、转膜时特别 要注意正负极，电压电流都不能过高；转膜时“三 明治”的叠放次序不错，同时要防止产生气泡；尽 量让电转温度保持在１０度以下，冰浴为宜。封闭 时一般在室温下２ｈ就够了，但是要注意如果是生 物素标记的二抗就不宜用牛奶，因为牛奶中含有生 物素，用ＢＳＡ效果更好。加一抗二抗要严格保证 反应时间，洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净， 有利于降低背景；还要注意一抗二抗的匹配。在 显色发光时要特别注意二抗所对应的显色方法，特 以看得清楚目的条带为标准。 别是在发光时要注意发光时间和显影时间的控制，
