提高小鼠原代肝星状细胞获得率及纯度的分离方法

《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research

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提高小鼠原代肝星状细胞获得率及纯度的分离方法 ，

，

·研究原著·

徐 莹1，张定棋12，慕永平1，陈佳美1，王清兰2，平 键1，刘 伟1，刘 平12 (1上海中医药大学，上海中医药大学附属曙光医院，上海市中医药研究院肝病研究所，肝肾疾病病证教育部重点实验室，上海中医临床重点实验室，上海市 201203；2上海中医药大学，上海高校中医内科学 E-研究院，上海市 201203)

DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0903 ORCID: 0000-0003-2633-3295(徐莹)

文章快速阅读：

如何提高小鼠原代肝星状细胞取得率及纯度？ 分离方法： 实验动物： 高浓度酶灌流消化结合Nycodenz梯度密度离心两步法 成年雄性C57BL/6小鼠 细胞鉴定方法： (1)锥虫蓝染色鉴定原代星状细胞细胞活力； 结论： (2)流式细胞鉴定原代星状细胞细胞纯度； 适当提高灌流液消化酶浓度可提升 (3)免疫荧光染色鉴定原代星状细胞细胞形态及标志物表达； 分离细胞的数目及纯度。 (4)PCR法检测原代星状细胞3，5，7 d活化相关基因表达情况。 文题释义：

肝星状细胞：又称贮脂细胞，是肝脏中的一种间质细胞，位于Disse间隙，胞体主要呈卵圆形或不规则形，胞质内富含类维生素A脂滴，正常肝脏中肝星状细胞的数目很少，与肝细胞数量之比为1∶20，其总体积占肝体积的1.4%。肝星状细胞主要具有以下功能：储存和代谢维生素A；合成和分泌少量的细胞外基质，主要有Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ型胶原纤维；对内皮细胞起支撑作用，并有调节肝窦大小的作用；合成非胶原糖蛋白和蛋白多糖等功能。

小鼠原代肝星状细胞：从小鼠肝脏中可分离得到的一种可在体外增殖培养的原代间质细胞，广泛用于体外研究肝星状细胞的生物学特性，对肝纤维化及肝癌等肝脏疾病的研究有重要研究价值。

徐莹，女，19年生，宁夏回族自治区银川市人，汉族，上海中药大学在读博士，主要从事慢性肝病的研究。

通讯作者：刘平，博士，教授，上海中医药大学，上海中医药大学附属曙光医院，上海市中医药研究院肝病研究所，肝肾疾病病证教育部重点实验室，上海中医临床重点实验室，上海市 201203；上海中医药大学，上海高校中医内科学 E-研究院，上海市 201203

通讯作者：刘伟，博士，助理研究员，上海中医药大学，上海中医药大学附属曙光医院，上海市中医药研究院肝病研究所，肝肾疾病病证教育部重点实验室，上海中医临床重点实验室，上海市 201203

中图分类号:R394.2 文献标识码:B

稿件接受：2018-03-13

摘要

背景：由于小鼠肝脏小、血管较细，其原代肝星状细胞分离的难度相对较大，且得率有限，难以满足体外实验需求。

目的：建立小鼠原代肝星状细胞高效稳定的分离方法，提高小鼠原代肝星状细胞的得率与纯度，为研究肝纤维化的机制奠定实验基础。

方法：取成年雄性C57BL/6小鼠，以无钙镁离子的前灌流液经门静脉充分灌注肝脏，再先后以1 g/L链霉蛋白酶和0.7 g/L Ⅳ型胶原酶灌注，使用Nycodenz进行梯度密度离心，获取中间层原代肝星状细胞，锥虫蓝染法观察肝星状细胞活力，流式细胞法检测细胞纯度，免疫荧光法检测Desmin表达，并于倒置显微镜下观察细胞培养3，5，7 d后的形态变化，PCR法检测培养3，5，7 d后α-平滑肌肌动蛋白及Ⅰ型胶原蛋白基因表达情况。 结果与结论：①每只小鼠肝脏可获得肝星状细胞(5.5±0.4)×106个，锥虫蓝检测细胞活力均大于95%，流式细胞法检测细胞纯度为94%，免疫荧光检测细胞高表达Desmin；②随着体外培养时间的延长，可见原代肝星状细胞逐渐由圆形向星型发展；③随培养天数增长，α-平滑肌肌动蛋白及Ⅰ型胶原蛋白表达逐渐升高； ④结果提示，实验成功建立了高效分离小鼠肝星状细胞的方法，可为获得高纯度、高细胞活力的小鼠原代肝星状细胞提供技术方案，也为肝纤维化的机制研究提供技术保障。 关键词：

肝星状细胞；细胞分离技术；原代细胞；细胞外基质；荧光鉴定；肝纤维化；细胞得率；国家自然科学基金 主题词：

肝细胞；细胞分离；组织工程 基金资助：

国家自然科学基金重点项目(81530101)；国家自然科学基金项目(81703681)；上海市青年科技英才扬帆计划资助项目(17YF1419800)；中国博士后科学基金资助项目(2016M6013)

Xu Ying, Doctorate candidate, Institute of Liver Diseases, Shuguang Hospital affiliated to Shanghai University of

Traditional Chinese Medicine, Key Laboratory of Liver and Kidney Disease (Ministry of Education), Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine, Shanghai 201203, China

Corresponding author: Liu Ping, M.D., Professor, Institute of Liver Diseases, Shuguang Hospital affiliated to Shanghai University of

Traditional Chinese Medicine, Key Laboratory of Liver and Kidney Disease (Ministry of Education), Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine, Shanghai 201203, China; E-Institute of Traditional Chinese Internal Medicine, Shanghai Municipal Education Commission, Shanghai University of Traditional

Chinese Medicine, Shanghai 201203, China

Corresponding author: Liu Wei, M.D., Assistant researcher, Institute of Liver Diseases, Shuguang Hospital affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese

Medicine, Key Laboratory of Liver and Kidney Disease (Ministry of Education),

Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine, Shanghai 201203, China

An improved method for isolation of mouse primary hepatic stellate cells with high yield and purity

Xu Ying1, Zhang Ding-qi1, 2, Mu Yong-ping1, Chen Jia-mei1, Wang Qing-lan2, Ping Jian1, Liu Wei1, Liu Ping1, 2

(1Institute of Liver Diseases, Shuguang Hospital affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Key Laboratory of Liver and Kidney Disease (Ministry of Education), Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine, Shanghai 201203, China; 2E-Institute of Traditional Chinese Internal Medicine, Shanghai Municipal Education Commission, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China)

3376 文章编号:2095-4344(2018)21-03376-05

Xu Y, Zhang DQ, Mu YP, Chen JM, Wang QL, Ping J, Liu W, Liu P. An improved method for isolation of mouse primary hepatic stellate cells with high yield and

purity. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2018;22(21):3376-3380. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0903

Abstract

BACKGROUND: Due to the small liver and fine blood vessels in the mice, it is difficult to isolate primary hepatic stellate cells, resulting in a limited yield which cannot meet the needs of in vitro experiments.

OBJECTIVE: To explore the high-performance and stable method for isolation of mouse primary hepatic stellate cells, with high yield and purity, thereby laying an experimental foundation for studying the mechanism of hepatic fibrosis.

METHODS: Adult male C57BL/6 mice undertook liver infusion with prefusion solution with no calcium and magnesium ions via the portal vein, followed by digestion using 1 g/L pronase and 0.7 g/L collagenase. Then, the liver samples were centrifuged with Nycodenz density gradient solution to obtain primary hepatic stellate cells from the middle layer. Trypan blue staining method was used to calculate cell viability, and flow cytometry method was used to measure cell purity. Immunofluorescence method was used to detect the expression of Desmin in cells. Cell morphology was observed under inverted microscope at 3, 5, 7 days of primary culture, and the expression of α-smooth muscle actin was detected by PCR.

RESULTS AND CONCLUSION: The yield of cells per mouse was (5.5±0.4)×106 cells. Trypan blue assay showed that the viability of isolated cells was over 95%, and the purity of isolated cells was 94% as measured by the flow cytometry. The cells highly expressed Desmin by immunofluorescence. With the prolongation of culture time in vitro, round cells were gradually changed into star-shaped cells, and the

expression of α-smooth muscle actin and type I collagen gradually increased. This study successfully established the high-performance and stable method for isolation of mouse primary hepatic stellate cells, providing a technical scheme for obtaining high-purity and high-viability mouse primary hepatic stellate cells, and also providing a technical support for research on the mechanism of liver fibrosis. Subject headings: Hepatocytes; Cell Separation; Tissue Engineering

Funding: the Key Project of National Natural Science Foundation of China, No. 81530101; National Natural Science Foundation of China, No. 81703681; Shanghai Sailing Program, No. 17YF1419800; China Postdoctoral Science Foundation, No. 2016M6013

0 引言 Introduction

肝星状细胞于19世纪由Kupffer首次描述[1]，位于肝脏窦周间隙(Disse间隙)，静息状态下肝星状细胞内富含脂滴，主要生理功能为贮存脂肪滴、维生素A，以及合成和分泌细胞外基质的作用[2-4]。当肝脏受到病毒感染、药物或毒物损伤、过量饮酒、肝内脂肪堆积等因素时，星状细胞会被逐渐激活，胞质中脂滴减少或消失，α-平滑肌肌动蛋白及Ⅰ型胶原蛋白表达增多，细胞外基质分泌增加[5-7]。活化的肝星状细胞是肝纤维化发生发展的关键效应细胞，是合成与分泌细胞外基质的主要来源[8-10]。病毒感染、药物或毒物损伤、肝内脂肪积聚等因素均可导致肝星状细胞的活化，导致肝纤维化发生[11-13]。许多研究发现，肝星状细胞还具有其他重要功能，如参与肝脏再生、免疫调节和免疫抑制等，是一种重要的多功能间充质细胞[14-16]。这些发现使人们对肝脏中细胞稳态的复杂性有了更深入的了解，也对肝星状细胞的起源和病理生理作用产生极大的兴趣。

肝星状细胞是肝脏主要非实质细胞之一，在肝脏中有着重要的地位。大量研究表明，肝星状细胞的持续激活是肝纤维化发生、发展的核心环节[17-20]。当前研究在既往小鼠肝星状细胞原代分离、培养的基础上进行改进，建立了高效、稳定、经济的小鼠原代肝星状细胞分离方法，大幅度提升了分离小鼠原代肝星状细胞的得率，为进一步深入研究肝星状细胞的生物学行为提供技术方案。

实验主要试剂及仪器：Ⅳ型胶原酶DNA 酶Ⅰ、链霉蛋白酶购于RD公司；DMEM 培养液、胎牛血清购于Gibco公司；Nycodenz分离购于Sigma公司；小鼠Desmin单克隆抗体购于Sigma公司；荧光标记的二抗购于Invitrogen公司；RNA抽提试剂盒：Total RNA Purification Kit MagExtractor(Cat：NPK-201F)、RNA酶去除试剂盒：RNase Destroyer(Lot：BE0724)、反转录试剂盒：Rever Tra Ace qPCR RT Master Mixwith gDNA Remover(Cat：FSQ-301)、qRT-PCR试剂盒：SYBR Green Real Time PCR Master Mix(Cat：QPK-20)均购于TOYOBO公司；Olympus荧光倒置相差显微镜、Beckman离心机、NanoDrop分光光度计、流式细胞检测仪。 1.4 方法 1.4.1 试剂的制备

前灌流液配制(1 L)：称取8 g 氯化钠、 0.4 g氯化钾、0.078 g磷酸二氢钠、0.151 g磷酸氢二钠、2.38 g 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、0.19 g乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、0.35 g碳酸氢钠、0.9 g葡萄糖使用细胞用水定容至1 L即得前灌流液。

酶缓冲液配制(1 L)：称取8 g氯化钠、 0.4 g氯化钾、0.078 g磷酸二氢钠、0.151 g磷酸氢二钠、2.38 g 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、0.19 g乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、0.35 g碳酸氢钠、0.56 g氯化钙使用细胞用水定容至1 L即得酶缓冲液。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 细胞分离实验。

1.2 时间及地点 于2017年6月至12月在上海中医药大学附属曙光医院肝病研究所完成。 1.3 材料

后分散液配制(50 mL)：称取链霉蛋白酶17 mg；胶原酶17 mg使用EB酶缓冲液定容至50 mL得后分散液。

密度梯度分散液(100 mL)：称取28.7 g碘海醇溶液溶于100 mL 格氏平衡盐溶液中即得密度梯度分散液。

所有配制液均经0.45 µm滤膜过滤，4 ℃保存备用。 1.4.2 小鼠原代肝星状细胞的分离 体积分数3%过氧化氢水循环消毒管道约20 min，换用灭菌细胞用水循环 20 min。预充前灌流液，注意排空管道内气泡，同时37 ℃

3377

实验动物：雄性C57BL/6小鼠10只，体质量(27.0± 2.1) g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，普通饲料喂养，进行实验前禁食24 h。

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徐莹，张定棋，慕永平，陈佳美，王清兰，平健，刘伟，刘平. 提高小鼠原代肝星状细胞获得率及纯度的分离方法[J]. 中国组织工程研究，2018，22(21):3376-3380. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0903

水浴保持各灌流液温度。用3%戊巴比妥按0.01 mL/g腹腔注射麻醉小鼠，仰卧位固定四肢，剖开腹部暴露门静脉及下腔静脉，将24 G留置针插入门静脉，并用手术细线从门5 mL/min的速度灌注肝脏，当肝脏充盈时剪断下腔静脉，充分灌注约10 min至肝脏变为均匀的土黄色；更换为1 g/L及230/280 nm波长吸光度的比值。

1.5 主要观察指标 ①原代肝星状细胞得率范围；②流式细胞检测肝星状细胞标志物Desmin阳性表达率；③原代肝Desmin表达情况；⑤PCR检测α-平滑肌肌动蛋白及Ⅰ型胶原蛋白的表达情况。

静脉下穿过用于固定留置针，将前灌流液50 mL以 星状细胞形态学变化；④免疫荧光检测肝星状细胞标志物

链霉蛋白酶溶液(50 mL)继续灌注约10 min，再更换为 1.6 统计学分析 应用SPSS 18.0软件进行统计处理，计

0.7 g/LⅣ型胶原酶溶液(50 mL)灌注约10 min(图1A)；灌流完毕后摘除肝脏置于无菌器皿中，剔除肝脏背膜及胆囊，轻柔撕碎肝脏组织，将肝组织移入分散液(40 mL)，37 ℃摇床消化10 min，用100 μm孔径的过滤肝组织悬液，随后加入体积分数20%胎牛血清2-5 mL终止消化。将细胞悬液37 ℃ 1 700 r/min离心5 min，弃上清取沉淀细胞，加入 30 mL无血清DMEM 培养基重悬混匀后再次37 ℃、 1 700 r/min离心5 min，弃上清，加入10 mL DMEM培养基、1.5 mL DNA 酶Ⅰ、8.5 mL密度梯度分散液混匀成细胞悬液，用移液缓慢铺10 mL格氏平衡盐溶液GBSS，24 ℃、12 000 r/min离心22 min。离心后可见细胞分层，吸取中间白膜层细胞(图1B)，加入无血清DMEM培养基，1 700 r/min离心5 min重复2次清洗细胞碎片，最终将细胞沉淀加入含体积分数20%胎牛血清的DMEM培养基培养。

1.4.3 原代肝星状细胞的培养 原代肝星状细胞以(3-6)× 108 L-1的浓度接种至培养皿，在37 ℃恒温、体积分数5% CO2细胞培养箱培养，24 h首次换液(体积分数10%胎牛血清DMEM)，之后每48 h更换液1次，培养至第6代。 1.4.4 原代肝星状细胞的存活率鉴定 用0.04%锥虫蓝染色，鉴定细胞存活率，普通光镜下未着色者为活细胞，细胞计数后统计细胞成活率。

1.4.5 原代肝星状细胞的纯度鉴定 流式细胞法检测原代肝星状细胞的细胞纯度。细胞经胰酶消化，1 000 r/min离心10 min，PBS洗2遍，PBS重悬细胞，分装至EP管 (100 µL/管)，2 000 r/min，离心6 min，弃上清，加100 µL PBS重悬并分散细胞，加一抗(Desmin小鼠单克隆抗体，1∶100)孵育1.5 h，2 000 r/min，离心6 min， 离心重复2遍，加100 µL PBS重悬并拍散细胞，加荧光标记的抗小鼠二抗(1∶1 000)，4 ℃避光孵育30 min。各管加1 mL PBS，2 000 r/min离心6 min，重复2遍。最后加0.5 mL PBS重悬，再用滤膜过滤除去细胞团以避免堵塞流式仪。

1.4.6 原代肝星状细胞的免疫荧光观测 将分离的原代肝星状细胞培养于放有细胞黏附片的24空板中，于7 d时收集细胞，40 g/L多聚甲醛固定10 min，体积分数0.5% Triton X-100 孵育透膜10 min，小鼠Desmin单克隆抗体(1∶200) 37 ℃避光1 h，用荧光标记的抗小鼠二抗室温下避光孵育 1 h，DAPI染核，抗荧光促灭封片剂封固，在荧光倒置微镜下观察并拍取照片。

1.4.7 PCR检测 将分离获取的细胞直接铺板，分别于3，5，7 d收集细胞，使用TOYOBO试剂盒提取RNA，使用NanoDrop分光光度计测定RNA浓度，并记录260/280 nm

3378

量资料以x_

±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果 Results

2.1 原代肝星状细胞的得率、存活率和纯度鉴定 分离制备了10只小鼠，可获得肝星状细胞为(5.5±0.4)×106 个/只，存活率均大于95%。流式细胞检测，其Desmin阳性表达率 为94%(图2)。

2.2 倒置显微镜细胞形态学观察 分离后的原代肝星状细胞在倒置显微镜下呈球形，内含丰富的脂滴，折光性强，贴壁于培养皿中(图3A)；3 d后可见细胞伸展生长，细胞内仍然可见少量脂滴颗粒(图3B)；培养5 d时，肝星状细胞已充分展开，体积明显增大，细胞呈典型的星形，细胞内脂滴颗粒明显减少，增殖加快(图3C)；培养7 d时，细胞铺满培养板孔，细胞更密集，已完全呈典型的肌成纤维样细胞形态(图3D)。

2.3 细胞免疫荧光Desmin染色 结蛋白Desmin为肝星状细胞典型分子标志，细胞免疫荧光染色进一步证实，培养7 d时，细胞完全表达结蛋白Desmin。

2.4 PCR法检测原代肝星状细胞中α-平滑肌肌动蛋白及I型胶原蛋白的表达情况 随培养天数增长，α-平滑肌肌动蛋白及Ⅰ型胶原蛋白表达逐渐升高(图5)。提示原代肝星状细胞在培养过程中发生自活化。

3 讨论 Discussion

由于肝星状细胞在肝脏中比例较少，并且小鼠体积较小，血管细，分离原代肝星状细胞的操作难度较大，难以满足大多实验的需求，为保证实验细胞用量，需多次分离多只小鼠，时间及经济成本较高。在过去的几十年中，对肝纤维化的发生机制及其转归的研究一直是医学界研究的重点，目前肝星状细胞已成为研究肝纤维化发生机制中最受重视的细胞[21-22]。因此，体外分离足量、稳定且纯度高的肝星状细胞是体外研究的必备条件。目前大多数分离大鼠原代肝星状细胞进行研究，而越来越多的研究表明小鼠模型在疾病研究中有其独特的优势，如体内实验操作性更方便、饲养更经济、获得基因工程鼠更容易[23-25]。但由于小鼠肝脏小、血管较细，其原代肝星状细胞分离的难度相对较大，且得率有限[(0.5-1.0)×106个/肝)，难以满足体外实验需求[25-28]。鉴于此，当前研究采用在体原位肝脏灌注结合密度梯度离心技术，在适当提高消化酶含量的前提下调整灌流及消化时间，使细胞得率大幅度提升，对于探讨各种致病因素引起肝脏纤维化发生的分子机制提供便利。

ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH

Xu Y, Zhang DQ, Mu YP, Chen JM, Wang QL, Ping J, Liu W, Liu P. An improved method for isolation of mouse primary hepatic stellate cells with high yield and

purity. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2018;22(21):3376-3380. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0903

A

格式平衡盐溶液 原代肝星状细胞层 Nycodenz/MEM混合液

B

图1 小鼠原代肝星状细胞分离

Figure 1 Isolation of mouse primary hepatic stellate cells

图注：图中A为消化液灌流中的小鼠肝脏，可见肝脏变为土黄色，肝组织充分消化裂解；B为Nycodenz梯度密度离心后的细胞分层，白色分层为原代肝星状细胞。

3

3 d 5 d

7 d

图2 流式细胞技术检测细胞纯度

Flow cytometry detection of cell purity Figure 2 图注：图中A为细胞选取区域；B为细胞表达Desmin阳性率。

mRNA 相对表达 A

B

2 1 0

α-平滑肌肌动蛋白 I型胶原蛋白

a A

b B

c C

图5 原代肝星状细胞不同时间α-平滑肌肌动蛋白及Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达变化

Figure 5 Expression changes of α-smooth muscle actin and type I collagen mRNA in mouse primary hepatic stellate cells at different times of culture

图注：随时间的增长，原代肝星状细胞 α-平滑肌肌动蛋白及Ⅰ型胶原蛋白的基因表达逐渐升高。

d

D

0 d 3 d 5 d 7 d

图3 体外培养不同时间原代肝星状细胞在倒置显微镜下的形态学变化(A, ×100; B-D, ×200)

Morphological changes of mouse primary hepatic stellate cells under inverted microscope at different time of in vitro culture (A, Figure 3 ×100; B -D, ×200) 图注：图中A-D为原代肝星状细胞在0-7 d的形态变化，随着体外培养时间的延长，可见原代肝星状细胞逐渐由圆形向星形发展。

0day 3day 5day 7day

DAPI DESMIN MERGE

图4 细胞免疫荧光Desmin染色(×400) Figure 4 Immunofluorescence Desmin staining of cells (×400)

图注：图为原代肝星状细胞免疫荧光染色，可见在培养第7d时表达原代肝星状细胞高表达Desmin。

通过反复实验，发现提高小鼠原代肝星状细胞分离得率及纯度的主要技术条件包括：①灌流前保证各灌流液温度在37 ℃左右，确保胶原酶及蛋白酶在适宜温度充分发挥作用；②灌注时应避免气泡进入门静脉，导致灌注形成栓塞，影响灌注效果；③灌流液消化酶含量的选择。链霉蛋白酶可以选择性消化肝细胞[11]。当前实验中发现链霉蛋白酶的浓度对肝星状细胞的得率影响较大，经过多次摸索，发现适当提高链霉蛋白酶含量可增加原代肝星状细胞纯

P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org

度，实验最终确定使用的链霉蛋白酶浓度为1 g/L，比文献报道使用链霉蛋白酶浓度0.05-0.50 g/L要高[29]。提示适当提高消化酶浓度可显著提高肝星状细胞得率，这可能与较高浓度的链霉蛋白酶能够使肝脏消化更加充分有关；④细胞分离液的选择。Nycodenz与Percoll均是较常用的细胞分离液，Percoll的黏滞度比Nycodenz要高。有实验比较了2种分离液分离原代肝星状细胞，发现Percoll易出现白色絮状物，而Nycodenz在细胞分离时梯度形成更为稳定，分离

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徐莹，张定棋，慕永平，陈佳美，王清兰，平健，刘伟，刘平. 提高小鼠原代肝星状细胞获得率及纯度的分离方法[J]. 中国组织工程研究，2018，22(21):3376-3380. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0903

获得原代肝星状细胞的得率及纯度也较Percoll高，并且Nycodenz配制相当更简便[30]；⑤由于肝星状细胞与Kuppfer细胞密度相近，因此密度梯度离心吸取中间层时应当避免吸到下层，以减少Kuppfer细胞的混入；⑥原代肝星状细胞的培养。原代肝星状细胞贴壁较快，4 h基本全部贴壁，因而接种的细胞数目甚为重要，原代肝星状细胞离体后需要适应体外环境，接种浓度太低或数量太少，将会减弱细胞自分泌和旁分泌细胞因子的刺激作用，影响细胞的正常生长。此外，建议细胞培养的前24 h采用含体积分数20%胎牛血清的培养液进行培养。

综上，该实验通过提高消化酶浓度、控制后分散液消化时间等方法较大幅度提高分离获得原代肝星状细胞的数量及纯度，为肝星状细胞活化及相应分子、生物学功能研究提供了重要的技术保障。

作者贡献：实验设计为徐莹，实验评估慕永平、陈佳美、王清兰和平健，实验实施为徐莹和张定棋，徐莹成文，刘平和刘伟审校。

经费支持：该文章接受了“国家自然科学基金重点项目(81530101)”、“国家自然科学基金项目(81703681)”、“上海市青年科技英才扬帆计划资助项目(17YF1419800)”、“中国博士后科学基金资助项目(2016M6013)”的资助。所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。

利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。

机构伦理问题：实验方案经航海中医药大学动物实验伦理委员会批准。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在戊巴比妥钠麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。

写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。

文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。

文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。

生物统计学声明：该文统计学方法已经上海中医药大学生物统计学专家审核。

文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。

开放获取声明：这是一篇开放获取文章，根据《知识共享许可协议》“署名-非商业性使用-相同方式共享3.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。

4 参考文献 References

[1] Ito T. Cytological studies on stellate cells of Kupffer and fat-storing cells

in the capillary wall of human liver. Acta Anat Jpn. 1951;26:42.

[2] Tsuchida T, Friedman SL. Mechanisms of hepatic stellate cell activation.

Nat Rev Gastro Hepat. 2017;14(7):397-411.

[3] Lo Re O, Panebianco C, Porto S, et al. Fasting inhibits hepatic stellate

cells activation and potentiates anti-cancer activity of Sorafenib in hepatocellular cancer cells. J Cell Physiol. 2018;233(2):1202-1212. [4] Perumal NK, Perumal MK, Halagowder D, et al. Morin attenuates

diethylnitrosamine-induced rat liver fibrosis and hepatic stellate cell activation by co-ordinated regulation of Hippo/Yap and TGF-β1/Smad signaling. Biochimie. 2017;140:10-19.

3380

[5] 张锦生.肝星状细胞激活的内在机制[J].世界华人消化杂志, 2005,13(7):

831-834.

[6] Everett L, Galli A, Crabb D. The role of hepatic peroxisome proliferator‐

activated receptors (PPARs) in health and disease. Liver. 2000;20(3): 191-199.

[7] Wrana JL. Transforming growth factor-β signaling and cirrhosis.

Hepatology. 1999;29(6):1909-1910.

[8] Rockey DC. Vascular mediators in the injured liver. Hepatology. 2003;

37(1):4-12.

[9] 陆伦根,柏乃运.肝星状细胞的生物学及其与肝硬化门脉高压相关性[J].肝脏,

2000,5(2):105-106.

[10] 刘清华,李定国,黄新,等.激活素A对肝星状细胞细胞外基质合成的影响[J].世

界华人消化杂志,2003,11(6):745-748.

[11] 董培红.肝星状细胞与肝纤维化[J].临床医学, 2005,25(11):71-73. [12] 张玉,周曦,易龙,等.大鼠原代肝星状细胞分离,鉴定及培养方法的研究[J].局

解手术学杂志,2018,27(1):5-11.

[13] 陈少锋,赵湘培,余胜民,等.排钱草总生物碱对大鼠肝星状细胞相关细胞因子

蛋白表达的影响[J].广西医学,2018,40(2):174-176.

[14] Svegliati Baroni G, D’Ambrosio L, Ferretti G, et al. Fibrogenic effect of

oxidative stress on rat hepatic stellate cells. Hepatology. 1998;27(3): 720-726.

[15] Li M, Hong W, Hao C, et al. SIRT1 antagonizes liver fibrosis by blocking

hepatic stellate cell activation in mice. FASEB J. 2018;32(1):500-511. [16] Schon HT, Bartneck M, Borkham-Kamphorst E, et al. Pharmacological

intervention in hepatic stellate cell activation and hepatic fibrosis. Front Pharmacol. 2016;7:33.

[17] Wallace MC, Friedman SL, Mann DA. Emerging and disease-specific

mechanisms of hepatic stellate cell activation. Semin Liver Dis. 2015; 35(2):107-118.

[18] Najimi M, Berardis S, El-Kehdy H, et al. Human liver mesenchymal

stem/progenitor cells inhibit hepatic stellate cell activation: in vitro and in vivo evaluation. Stem Cell Res Ther. 2017;8:131.

[19] Weiskirchen S, Tag CG, Sauerlehnen S, et al. Isolation and culture of

primary Murine hepatic stellate cells. Methods Mol Biol. 2017;1627: 165-191.

[20] Mederacke I, Dapito DH, Affò S, et al. High-yield and high-purity isolation

of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers. Nat Protoc. 2015;10(2):305-315.

[21] Zhang Q, Qu Y, Li Z, et al. Isolation and culture of single cell types from

rat liver. Cells Tissues Organs. 2016;201(4):253-267.

[22] Mohar I, Brempelis KJ, Murray SA, et al. Isolation of non-parenchymal

cells from the mouse liver. Methods Mol Biol. 2015;1325:3-17.

[23] 张玉,周曦,易龙,等.大鼠原代肝星状细胞分离,鉴定及培养方法的研究[J].局

解手术学杂志,2018,27(1):5-11.

[24] 陈少锋,赵湘培,余胜民,等.排钱草总生物碱对大鼠肝星状细胞相关细胞因子

蛋白表达的影响[J].广西医学,2018,40(2):174-176.

[25] 李亚琳.小鼠肝星状细胞的分离纯化新方法的建立与应用[J].国际检验医学

杂志,2012, 33(9):1028-1029.

[26] 张强,陈曦,苏畅,等.小鼠肝星状细胞的分离、培养及鉴定方法[J].外科理论与

实践,2009, 14(1):46-48.

[27] 常文举,宋陆军,王洪山,等.小鼠肝星状细胞分离纯化和体外培养模型的建立

[J].中华实验外科杂志,2011,28(2):307-309.

[28] 李海媛,王雪,时永全,等.建立同时分离培养小鼠肝细胞及肝星状细胞的技术

[J].现代生物医学进展,2014,14(16):3033-3037.

[29] 韩聚强,杜静华,徐小洁,等.小鼠原代肝星状细胞的分离、鉴定及生物学功能

分析[J].生物技术通讯,2017,28(5):600-603.

[30] Schönenberger MJ, Kovacs WJ. Isolation of peroxisomes from mouse

brain using a continuous Nycodenz gradient: a comparison to the isolation of liver and kidney peroxisomes. Methods Mol Biol. 2017;1595: 13-26.

ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH