微生物的分离与培养

实验原理：

一、 培养基的制备

培养基通过人工加入微生物的生长所必需的各种成分，包括水，碳源，单元，无机盐和生长因子各种营养物质配置而成的养料。 二、 微生物的接种

微生物接种技术是生物科学研究中最基本的操作技术。由于实验目的，培养基种类及容器等不同，所以接种方法不同。用不同的接种方法以获得生长良好的纯种微生物。 三、 微生物的培养

不同的微生物对营养需求不同，根据这点可以通过培养基对微生物的做初步分离。 四、 质粒的提取

碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA和质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的。在PH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断链，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断链，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以PH4.8D的NaAc高盐缓冲液冲击去调节其PH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质—SDS的复合物等一起沉淀下来而被除去。 五、 PCR技术

DNA的半保留复制时生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋或单链。在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制或同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶，dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

六、 琼脂糖凝胶电泳

许多重要的生物，如蛋白质，核酸等都具有可电离的基因，在某一特定的PH下他们可以电离正电荷或负电荷，当加上电均后，这些带点分子就会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。而电泳技术就是利用在电均的作用下，由于待分离样品中各种分子带点性质，分子大小形状等的差异，从而产生不同的迁就率，对样品进行分离，鉴定或纯化的技术。 PCR产物的回收 将含有质粒DNA的荧光色带切下，溶解后填充到硅胶柱中，利用硅胶在高盐低PH下吸附DNA，在低盐和高PH条件下DNA可在被洗脱的原理，进行DNA的回收和纯化。

七、 酶切

性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶（水解磷酸二酯键）。

八、 重叠延伸PCR技术（引物摒接PCR）

重叠延伸PCR技术由于采用有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠摒接起来，重叠PCR技术关键是重叠互补引物的设计，重叠延伸PCR在基因的定点突变，融合基因的构建，长片段基因的合成，基因敲除以及目的基因的扩增方面有其广泛而特殊的应用。

实验流程

1：培养基的制备

1.1 药品的称量：在电子天平上按照配方称取蛋白胨（5g）NaCl（2.5g）牛肉膏（1.5g）琼脂（4g）

1.2 溶解加热与调解PH值：水浴加热至溶解，并用纯水定容至500ml，滴加1mol/L的NaOH滴定PH值为7.0~7.5

1.3 分装与灭菌：对三角烧瓶分别编号为A、B并依次加入250ml培养液，在B中加入预先称好的4g琼脂

1.4 固体培养基抗性的加入与倒平板：按照1/1000的剂量在三角烧瓶B中加入2.5μl的卡那霉素，摇匀后打开培养皿倒入较小的培养皿

 备注：为防止培养基在凝固过程中冷凝水回流造成培养基污染，注意培养皿

放置时上下面问题。同时，所有操作均在酒精灯附完成。 2：大肠杆菌的接种与培养

2.1微生物的接种：将完成灭菌的接种针沾取适量菌液，在已经凝固的培养基上如图3.2进行平板划线，注意：划线目的是在于将菌液转移到培养基上

2.2微生物的培养：将完成接种培养基放入设定温度为37℃的生化培养箱中过夜培养

 备注：抗生素拥有半衰期，注意在半衰期中

完成培养。同时所有操作均在酒精灯附完成。

三角烧瓶等仪器打开和关闭时注意瓶口通过火焰。 3：质粒的提取

3.1试剂盒的准备:将RNA酶加入S1中，去80ml无水乙醇加入到W2中 3.2质粒提取:去2ml菌液于2ml的离心管中，8000rpm/min离心2min，弃上清液，重复以上操作一次，保证细菌沉积量。加入250μl S1充分摇匀，使细菌悬浮。对准管壁，打入250μl S2，为防止基因组和质粒一起被提取出来，温和翻转5次，静置1min。加入约350μl S3,充分混匀后冰上放置约10min。12000rmp/min 离心10min，并将上清液转移至制备管中静置1min。12000rmp/min 离心1min，弃滤液。在制备管打入500μl W1，12000rmp/min 离心1min，弃滤液。加入700μl W2，12000rmp/min 离心1min，重复2次。弃滤液后12000rmp/min 离心空甩1min，去除残余W2.制备管打入100μl Elunt 静置1min，12000rmp/min 离心1min，洗脱质粒。

 备注：试剂盒完成准备后要在相应的试剂瓶上做上规定标记。提取时时刻记

住相应的操作时留清液还是留沉淀。操作时注意试剂加入的顺序和剂量。离心时转速和时间的设定可以按照高转速少时间的原则灵活调整。 4：PCR技术（聚合酶链式反应）

4.1 PCR反应体系（50μl）的构建：质粒（1μl）、Buffer缓冲液（5μl）、pfu DNA聚合酶（0.5μl）、dNTP（3μl）引物（1+1μl）、剩下的用H2O2补足到50μl

4.2 PCR反应体系中各成分的作用：质粒提供目的基因即模板，Buffer缓冲液提供稳定的缓冲体系，pfu DNA聚合酶可以修复碱基之间的磷酸二酯键，dNTP提供4种碱基，引物可以控制复制的开始。

4.3 PCR仪程序的设定：预变性（96℃ 5min）→[变性（95℃ 30s）→引物退火（58℃ 30s）→引物延伸（72℃ 1min）循环30次]→最后延伸（72℃ 2min）  备注：加入试剂是注意确保试剂的全部加入，使用前检查PCR程序的设定，

PCR仪显示开始工作后不可以在加入待扩增的基因。PCR仪工作时不建议打

开盖子。

5：琼脂糖凝胶电泳提纯目的基因

5.1 制胶：分别称取4.5g琼脂，用纯水定容至300ml，加入三角烧瓶中并编号A/B，水浴加热至溶解，A瓶中加入适量核酸染料。分别倒入两个电解槽中，插入梳子待琼脂凝固

5.2 跑电泳（PCR产物电泳）：在PCR产物中加入2μl溴酚蓝染液，摇匀。在A胶的第一个孔中加入6μl的Marker，后面的孔中每孔加入10μl产物——溴酚蓝复合物。放入电泳槽中电泳 5.3 跑电泳（质粒）：在溴酚蓝中加入适量核酸染料，形成溴酚蓝——核酸染料复合物，在B胶第一个孔中同样加入6μl的Marker，取3μl质粒和1μl溴酚蓝——核酸染料复合物充分摇匀后加入后面的孔中。放入电泳槽中电泳

 备注：在制胶时注意电解槽的密封。取

胶时注意动作轻柔，防止胶被拉坏。点样时注意头不要讲凝胶捅破。电泳时注意正负极，凝胶在电泳槽中不要倾斜放置 6：PCR产物的回收

6.1 回收PCR目的产物实验：取500μl的溶胶剂和适量胶块于2ml离心管中，65℃水浴加热至溶解。将液体转移到硅胶柱中，静置1min后8000rpm离心1min。下层滤液倒回硅胶柱中静置1min后8000rpm重复离心1min。加入500μl W2 8000rpm离心30s，弃滤液。重复加入500μl W2 12000rmp 离心30s。将硅胶柱放入1.5ml离心管中，加入DI 100ml静置1min。12000rmp离心1min 下层滤液中含有产物

 备注：溶胶时注意胶体的完全溶解 7：酶切

7.1质粒的酶切实验：在1.5ml离心管中分别加入DI（14μl）、酶切缓冲液（2μl）、质粒（2μl）、EcoR I（1μl）、Swa I（1μl）后轻轻混匀，1000rpm离心10s。37℃水浴加热30min后温度改为65℃水浴10min。1000rpm离心10s。取10μl与10x缓冲液混匀，电泳检测

 备注：加入的为DI去离子水，酶需要放到冰箱中低温保存，使用时任何高

温物体严禁靠近装有酶的试剂管。加酶时注意及时更换移液头。 9：重叠延伸PCR技术（引物摒接PCR） 9.1构建扩增体系A：Mix（10μl）、Pfu DNA聚合酶（1μl）、DNTP(3μl)、10x Buffer（5μl）、Add水（补足总体积至50μl） 9.2构建扩增体系B：上轮PCR产物（3μl）、Pfu DNA聚合酶（1μl）、DNTP(3μl)、10x Buffer（5μl）、首尾引物（1+1μl）Add水（补足总体积至50μl）

9.3程序设定：扩增体系A扩增，扩增产物为完整模板，在将模板加入扩增体系B进行扩增

 备注：不可以使用TapDNA聚合酶

实验结果

培养基的制备

大肠杆菌的接种与培养

质粒的提取

PCR技术（聚合酶链式反应）

琼脂糖凝胶电泳

酶切

重叠延伸PCR技术（引物摒接PCR）