大提质粒步骤

来源：飒榕旅游知识分享网

1. 取150ml过夜培养的菌液，加入离心管中，12000rpm离心2-3min收集细菌，尽量吸取全部上清。

2. 向留有菌体沉淀的离心管中加入12ml Buffer P1，使用涡旋振荡器充分混匀，悬浮细菌沉淀。

3. 向离心管中加入12ml BufferP2，温和的上下颠倒混匀十几次，使菌体充解，室温放置3-5min。此时溶液应变得清凉粘稠。

4. 向离心管中加入12ml Buffer B3，立即上下颠倒混匀十几次，此时出现白色絮状沉淀，室温放置5min。12000rpm离心10min，将上清液全部倒入除内毒素过滤器中，慢慢推动推柄过滤，过滤收集收集在干净的50ml的离心管中。

5. 向滤液中加入11ml异丙醇，上下颠倒混匀。

6. 向已装入收集管中的吸附柱中加入2mlBufferPS，12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回到收集管中。

7. 将步骤5中滤液与异丙醇的混合溶液转移到平衡好的吸附柱中。

8. 6000-12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回到收集管中。

9. 向吸附柱中加入10mlBuffer PW，6000-12000rpm离心2min，将吸附柱重新放回到收集管中。

10. 重复步骤。

11. 将吸附柱重新放回到收集管中，12000rpm离心5min，倒掉废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

12. 将吸附柱置于一个新的收集管中，向吸附膜中间部位加入1-3mlEndo-Free BufferEB，室温2-5min，12000离心5min，将质粒溶液收集到收集管中。-20℃保存质粒。

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