食源性沙门氏菌快速检测技术的应用研究

《上海畜牧兽医通讯》２００８年第１期　・　１９・　食源性沙门氏菌快速　检测技术的应用研究　鄢志刚　徐　锋　王　建　沈莉萍　葛菲菲　刘佩红　（１上海市崇明县动物疫病预防控制中心２０２１５０　２上海市畜牧兽医站２０１１０３）　【’摘要】通过样品试验，得到优化的沙门氏茵检验方法，了解上海地区沙门氏茵污染情况。在免疫胶体金技术、　单抗直接ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ法检测沙门氏茵的基础上，将ＰＣＲ法和单抗直接ＥＬＩＳＡ三种快速检测方法进行比较研究。　用免疫胶体金技术、直接ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ法对鸡蛋、水样、牛奶、猪肉、牛肉、虾仁等样品４０１份进行沙门氏茵检测，并与　常规国标方法对比，直接ＥＬＩＳＡ法的敏感性和特异性迭１００％和９７．３％，免疫胶体金技术敏感性和特异性达１００％　和９５．３％，ＰＣＲ法的敏感性和特异性均为１００％。通过对样品的检测，最终确定较优化的沙门氏茵检测程序。ＰＣＲ　法的特异性优于免疫胶体金技术和直接ＥＬＩＳＡ法。对大量样品检测，可采用免疫胶体金技术或直接ＥＬＩＳＡ法筛　检，除去大量阴性样品，阳性样品用ＰＣＲ法作进一步鉴定；需要确定血清型时则用国标法。　关键词：沙门氏茵；ＰＣＲ；ＥＬＩＳＡ；免疫胶体金；快速检测　沙门氏菌是一种常见的重要人畜共患病原菌【１），它不仅　１、１．４样品：２００６年２月～２００６年５月份从市场及超市中　能导致鸡白痢、鸡伤寒、副伤寒、仔猪副伤寒、流产等动物疾　购买不同批次的猪肉、牛肉、虾仁、鸡蛋分别为８３、７０、２８、７４　病，还能使人类发生伤寒、副伤寒、败血症、胃肠炎和食物中　份；选择上海地区５个牛场原料奶，采１４６份。　毒。在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌引起的中毒病例占　１．２　方法　首位或第二位【２）。沙门氏菌作为致病菌检测的一项重要指　１．２．１　ＰＣＲ法：取样品ＳＣ增菌液或Ｍ一肉汤增菌液细菌　标，在公共卫生、食品卫生、畜牧兽医和出入境检验检疫中均　培养液１　ｍｌ，置于Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，离心收集菌体，用灭菌蒸　有重要意义。但沙门氏菌有２　５００个以上的血清型，复杂的　馏水洗涤２次，最后用１　ｍｌ蒸馏水悬浮，隔水煮沸１５　ｍｉｎ，　各类生化反应型，使常规检验程序复杂繁琐、耗时费力，不仅　８　０００　ｒ／ｍｉｎ离心１５　ｍｉｎ，取上清，即成ＤＮＡ模板溶液。ＰＣＲ　给检验部门带来沉重的负担，而且还使生产部门产品运输和　反应体积５０　，１０×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ　５　，ｄＮＴＰｓ（２．５　ｍｏｌ／Ｌ）　仓储的时间延长，费用增加。因此灵敏度高、特异性强、重复　４　，引物Ｉ和引物ＩＩ（５　ｍｏｌ／Ｌ）各２．５　，模板溶液７．５　，　性好、简易、经济的检测方法是发展的方向。　Ｔａｑ酶（３　ｕ　１）０．７　，三蒸水２７．８　。ＰＣＲ循环参数：９４℃　目前，包括我国在内的许多国家对沙门氏菌的检验普遍　预变性５　ｍｉｍ；９４℃变性４５　ｓ，６０℃返火４５　ｓ，７２℃延伸　采用传统培养方法，报告检验结果大致需４～５　ｄ，对该菌的　５　ｍｉｎ，经３２个循环，最后７２℃保温１０　ｍｉｎ。配制１％琼脂　快速检测研究目前也主要集中在免疫酶试验、免疫扩散法、　糖溶液，按０．５　ｍｇ／Ｌ加溴化乙啶（ＥＢ）制胶，取５　ＰＣＲ产　乳胶凝集试验、免疫荧光法和酶联免疫吸附试验（ＥＬＩｓＡ）等　物点样，用ＰＣＲ　Ｍａｒｋｅｒ作对照，４０　ｖ电泳１　ｈ。取出凝胶，　方法上，但单纯每一方法均存在很多缺点。本研究在ＰＣＲ　置紫外灯下观察。用Ｋｏｄａｋ凝胶成像系统成像¨　）。　法、免疫胶体金（ＧＬＩｓＡ）、直接ＥＬＩＳＡ法检测沙门氏菌的基　１．２．２直接ＥＬＩＳＡ方法被检抗原的处理：鲜牛奶、原料奶、　础上，对ＧＬＩＳＡ、直接ＥＬＩＳＡ和ＰＣＲ快速检测样品中的沙门　虾仁、熟食制品、水样、鸡蛋等样品，直接从选择性增菌液ｓｃ　氏菌进行了比较，并探讨了检测大量样品的优化程序，即对　或Ｍ肉汤后增菌液中取１　ｍｌ于Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，离心收集沉　大量样品采用ＧＬＩＳＡ或直接ＥＬＩＳＡ筛检，以除去大量阴性　淀，采用少量ＰＢＳ洗涤后，悬浮，沸水浴２０　ｍｉｎ，４℃保存备　样品，对阳性样品再采用ＰＣＲ法检测，定型以国标方法作血　用【　。　清型鉴定。　１．２．３　直接ＥＬＩＳＡ法：参照文其乙等报道的程序进行【６】，　１材料和方法　主要步骤：将处理的抗原取５０　加入酶标板孔内，５０～　１．１材料　６０℃烘干，冷甲醇固定５～１０　ｍｉｎ，ＰＢＳＴ洗涤３次，　１．１．１　菌种：肠炎沙门氏菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）由扬州　５　ｍｉｎ／￣，再加入最佳工作浓度的ＣＢ８、ｄｅ７酶标单抗混和液　大学畜禽传染病学农业部重点开放实验室惠赠。大肠杆菌　５０　／孑乙，３７℃水浴孵育２　ｈ，以后各步同常规直接ＥＬＩＳＡ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）由上海市畜牧兽医站保存。　法，每块被检样品板中设立阳性、阴性、空白对照各一孔。　１．１．２试剂：引物由上海生工生物工程公司合成，ｂｕｆｆｅｒ、　ｏ０４ｑｎ＞０．５为阳性＂）。　ｄＮＴＰｓ、Ｔａｑ酶、低分子量ＰＣＲ　Ｍａｒｋｅｒ购自华美生物工程公　１．２．４免疫金标法（ＧＬＩＳＡ）：在检测卡的样品孔中加入一　司；常规试剂为国产分析纯试剂。免疫胶体金采用Ｎｅｏｇｅｎ　部分富集培养物（１２０　），样品沿检测卡流动，出现易于区分　公司产品。　的可见结果。如果只在对照区形成一个条带，则样品为沙门　１．１．３培养基：细菌培养基包括普通营养琼脂、胆硫乳琼脂　氏菌阴性；在对照区和检测区同时出现条带，则可初步鉴定　（ＤＨＬ）、缓冲蛋白胨水（ＢＰＷ）、三糖铁琼脂（ＴｓＩ）、亚硒酸盐　样品为沙门氏菌阳性。　胱氨酸培养基（ｓｃ），均按国标配制或购自杭州天和公司；Ｍ　１．２．５敏感性试验：采用平板计数法，确定沙门氏菌细菌数　一肉汤参照Ｓｐｅｒｂｅｒ方法配制【３］。　量为１０　ｃＦｕ／ｍｌ，然后将沙门氏菌和大肠杆菌按１：１、１：１０、　基金项目：上海市科技兴农重点攻关项目（农科攻宇（２００２）第３—４—１号】　维普资讯 http://www.cqvip.com

・２０　・　《上海畜牧兽医通讯》２００８年第１期　１：１００、１：１　０００、１：１０　０００混合，分别取混合物１　ｍｌ用ＰＣＲ　方法、ＧＬＩＳＡ　ＥＬＩＳＡ方法进行检测。　１．２．６样品常规检验和联合快速检测：按国标方法进行常　规检验［引，ＧＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＡ试验同步进行。取１８～２４　ｈ培养　的Ｓｃ增菌液１　ｍｌ，加至９　ｍｌ　Ｍ肉汤中，３７℃，培养６　ｈ后，作　直接ＥＬＩＳＡ检测。取Ｍ肉汤富集培养物１２０　ｌ加入ＧＬＩＳＡ　卡中进行检测。对ＧＬＩＳＡ和俄直接ＥＬＩＳＡ阳性样品和　１０％的ＥＬＩＳＡ结果阴性的随机样品，作ＰＣＲ扩增检测。取　阳性菌株进行血清学试验和生化试验，并将４种方法的结果　进行比较。　１．２．７数据分析：与国标法相比检出试验的敏感性、特异性　和符合率分别按下列公式进行计算。　敏感性＝真阳性数／（真阳性数＋假阴性数）；特异　性＝真阴性数／（真阴性数＋假阳性数）；符合率＝（真　阳性数＋真阴性数）／被检总数。　２　结果　２．１　沙门氏菌和大肠杆菌不同比例混合，ＧＬＩＳＡ、直接　ＥＬＩＳＡ法和ＰＣＲ法的检测比较，试验结果见表１。沙门氏菌　与大肠杆菌组成比例为１：１　０００时，用ＥＬＩＳＡ法、ＧＬＩＳＡ法　检测为阴性，而ＰＣＲ法则能检出。　表１　ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ和ＧＬＩＳＡ法检测结果　２．２沙门氏菌检测方法的平行试验结果：采集牛场原料牛　奶、鸡蛋、牛肉、猪肉等样品，共４０１份。采用ＥＬＩＳＡ、ＧＬＩＳＡ　和ＰＣＲ方法同步进行，并用国标方法进一步验证。见表２。　结果显示，直接ＥＬＩＳＡ法检测４７个阳性样品，ＧＬＩＳＡ　法检测５５个阳性样品，ＰＣＲ法检测出３７个阳性样品，国标　方法检测出３７个阳性样品。　计算得知，直接ＥＬＩＳＡ的敏感性为１００％，特异性为　９７．３％，与国标的符合率为９７．５％；ＧＬＩＳＡ的敏感性为　１００％，特异性为９５．３％，与国标的符合率为９５．５％；ＰＣＲ方　法的敏感性和特异性均为１００％，与国标法的符合率为　１００％。　Ｍ　ｊ　２　３　４　５　６　Ｍ　５０１ｂｐ　圉１　人工混合样品ＰＣＲ扩增产物电泳图谱　１～５分别为沙门氏茵和大肠杆菌１：１、１：１０、１：１００、１：１０００、　１：１００００混合物，６为Ｅ　ｃｏｉｌ，Ｍ为ＰＣＲ　ｍａｒｋｅｒ。　表２沙门氏菌检测方法的平行试验结果　３讨论　本研究通过大量样品的检测，进一步证实：ＧＬＩＳＡ、单抗　直接ＥＬＩＳＡ法灵敏度高，特异性强，可避免人为因素造成的　假阴性，且能在短时间内快速筛去大量的阴性样品，检测时　间比传统方法大为缩短，且不需特殊仪器，易于操作、便于推　广。而ＰＣＲ法虽然较ＧＬＩＳＡ法、ＥＬＩＳＡ法的敏感性高、特异　性强、快速准确，且结果分析简单，对待检样品要求不高，检　测时间更短，但ＰＣＲ法费用高、操作复杂、操作中的残留污　染易导致假阴性和假阳性，而且需要专用仪器设备，对基层　检验人员的可操作性较差。因此，实际应用中难以大面积推　广。　ＧＬＩＳＡ、直接ＥＬＩＳＡ法不存在假阴性，因此可以有效地　防止阳性样品的漏检，该法的假阳性率一般在２．５％～５％之　间。通过对多种样品的实验，结果表明，ＧＬＩＳＡ、直接ＥＬＩＳＡ　的假阳性完全可以通过ＰＣＲ法来加以排除，而且ＰＣＲ法从　样品处理到结果判定，只需３～４　ｈ，远比国标法快速，且敏感　性高、特异性强，结果分析简单。　根据上述试验，我们推荐样品检测方法和程序：大量样　品以直接ＥＬＩＳＡ或ＧＬＩＳＡ粗选，阳性者采用ＰＣＲ法筛选，　对沙门氏菌血清型确定仍需用经典方法加以鉴定。此种联　合检测技术具有高度的特异性、敏感性和快速简便等优点。　参考文献　［１］陆承平．兽医微生物学［Ｍ］．北京：中国农业出版社．２００１．２２３　［２］张艳红。吴延功，杜元钊，等．沙门氏菌快速检测方法研究进展　［Ｊ］．动物医学进展，２００１，２２（２）：３９～４１　［３］Ｃｌｏａｋ　ＯＭ．，Ｄｕｆｌｙ　Ｇ．，Ｓｈｅｒｉｄａｎ　ＪＪ．．ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｓｕｒｆａｃｅ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏ　ｒｅｓｃｅｎｔ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｒａｐｉｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｓｐｐ．ｆｒｏｍ　ｍｅａｔ　ａｎｄ　ｐｏｕｌｔｒｙＵ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏ．　ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，４：５８３～５９０　［４］文其乙．沙门氏菌的基因分型和指纹图谱分析及其在分子流行病　学中的应用［Ｊ］．中国畜禽传染病，１９９４，６：５７～５９　［５］黄金林，焦新安，文其乙，等．应用聚合酶链反应快速检测沙门氏　菌［Ｊ］．扬州大学学报（农业与生命科学版），２００２，２３（３）：５～７　［６］黄金林，焦新安，刘佩红，等．ＰＣＲ快速检测沙门氏菌试剂盒的研　制与应用［Ｊ］．中国公共卫生，２００４，２０（４）：４５１～４５２　［７］黄金林，焦新安，潘志明，等．直接酶联免疫吸附法和聚合酶链反　应联合检测沙门菌的应用［Ｊ］．中国预防医学杂志，２００４，２４（５）：　３１～３２　［８］中华人民共和国国家标准．食品卫生微生物检验．沙门氏菌，　２００３．Ｇ１３４７８９．３１．４～８