第３７卷 第６期 ２０１４年１２月 遵义医学院学报 Ｖｏ１．３７ Ｎｏ．６ Ｄｅｃ．２０１４ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｕｎｙｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＭｉｃｒｏＲＮＡ一７基因敲减小鼠模型的鉴定 朱顺飞，李永菊，陈 超，胡 燕，赵娟娟，郭萌萌，陶弋婧，秦娜琳，徐 林 （遵义医学院免疫学教研室暨贵州省免疫学研究生教育创新基地，贵州遵义５６３０９９） ［摘一要］目的鉴定ｍｉＲ一７基因敲减小鼠模型，为进一步研究ｍｉＲ一７的生物学功能奠定基础。方法常规剪取７只ｍｉＲ ７基因敲减（ｍｉＲ一７ ｋｎｏｃｋ ｄｏｗｎ，ｍｉＲ一７ＫＤ）小鼠的脚趾和尾巴，分别用来提取基因组ＤＮＡ和总ＲＮＡ；剪取１只ｗＴ（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ，ｗＴ）小鼠的尾巴，提取其： ＲＮＡ；将提取的两组小鼠的总ＲＮＡ逆转录成ｃＤＮＡ；分别以基因组ＤＮＡ和ｃＤＮＡ为模 —板，用特异性引物ＰＣＲ技术扩增目的基因增强型绿色荧光蛋白（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＥＧＦＰ）片段；提取ｗＴ和 ｍｉＲ一７ＫＤ小鼠７个不同组织器官的总ＲＮＡ，利用Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ探针法检测各组织器官中ｍｉＲ一７成熟体的表达水平； ＨＥ染色观察ｍｉＲ一７ＫＤ小鼠心脏 肺脏以及结肠的形态学结构改变。结果ＰＣＲ结果显示，模型小鼠的脚趾基因组ＤＮＡ 和尾巴ｃＤＮＡ中均能扩增出载体目的基因ＥＧＦＰ片段；Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ结果显示，ｍｉＲ一７ＫＤ小鼠心脏、肝脏和脾脏等组织 器官ｍｉＲ一７成熟体的表达水平较ｗＴ小鼠均显著下调（Ｐ＜０．０５）；ＨＥ染色结果显示，ｍｉＲ一７ＫＤ小鼠心脏、肺脏以及结肠 形态学结构发生了明显的病理性改变。结论成功鉴定了ｍｉＲ一７基因敲减小鼠模型，为后续深入探讨该分子的生物学功 能提供重要实验基础。 ［关键词］ｍｉＲＮＡ一７；基因敲减；鉴定；表达 ［中图法分类号］Ｒ３３２ 文献标志码］Ａ ［文章编号］１０００—２７１５（２０１４）０６－０５８２－０５ Ｉｄｅｎｔｉｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｍｉｆｃｒｏＲＮＡ一７ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｍｏｄｅｌ Ｚｈｕ Ｓｈｕｎｆｅｉ，Ｌｉ Ｙｏｎ，￣ｕ，Ｃｈｅｎ Ｃｈａｏ，Ｈｕ Ｙａｈ，Ｚｈａｏ Ｊｕａｎｊｕａｎ，Ｇｕｏ Ｍｅｎｇｍｅｎｇ，Ｔａｏ Ｙｉｊｉｎｇ，Ｑｉｎ Ｎａｌｉｎ，Ｘｕ Ｌｉｎ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｂａｓｅ ｏｆ Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｚｕｎｙｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒ— ｓｉｔｙ，Ｚｕｎｙｉ Ｇｕｉｚｈｏｕ ５６３０９９，Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ］ｄｅｎｔｉｔ￣￣ｔｈｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ一７ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ（ｍｉＲ一７ ＫＤ）ｍｉｃｅ ｆｏｒ ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｉｔｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｉｅ ＤＮＡ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｏｅｓ ａｎｄ ｔａｉｌｓ ｏｆ ｓｅｖｅｎ ｍｉＲ 一７ ＫＤ ｍｉｃｅ．Ｔｏｔａｌ ＲＮＡｓ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔａｉｌ ｏｆ ｏｎｅ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ（ＷＴ）ｍｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｅｄ ｉｎｔｏ ｃＤＮＡｓ．Ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ａｎｄ ｃＤＮＡ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｔｈｅ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ＥＧＦＰ ｗａｓ ａｍｐｌｉ— ｌｆｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｐｒｉｍｅｒ．Ｔｏｔａｌ ＲＮＡｓ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｅｖｅｎ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｏｒｇａｎｓ ｉｎ ＷＴ ａｎｄ ｍｉＲ一７ＫＤ ｍｉｃｅ．Ｔｈｅｎ．ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ一７ ｉｎ ｓｅｖｅｎ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｏｒｇａｎｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｎ— ｓｉｎｇ Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｈｅａｒｔ，ｌｕｎｇ ａｎｄ ｃｏｌｏｎ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ＨＥ ｓｔａｉ— ｎｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ＥＧＦＰ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｉｆｅｄ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ａｎｄ ｃＤＮＡ ｆｒｏｍ ｍｉＲ一７ ＫＤ ｍｉｃｅ． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｓｅｖｅｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｏｒｇａｎｓ ｏｆ ＷＴ ｍｉｃｅ，ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ一７ ｉｎ ｈｅａｒｔ，ｌｉｖｅｒ，ｓｐｌｅｅｎ， ｌｕｎｇ，ｋｉｄｎｅｙ，ｔｈｙｍｕｓ ａｎｄ ｐａｎｃｒｅａｓ ｆｒｏｍ ｍｉＲ一７ ＫＤ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５）．ＨＥ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｈｅａｒｔ．１ｕｎｇ ａｎｄ ｃｏｌｏｎ ｆｒｏｍ ｍｉＲ一７ＫＤ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｉｃａｎｔｌｙ ａｂｈｏｒ－ ｆｍａｌ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｒｏｍ ＷＴ ｍｉｆｃｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｍｉＲ一７ＫＤ ｍｉｃｅ ｍｏｄｅｌ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕ１． １ｙ，ｗｈｉｃｈ ｍａｙ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｕｓｅｆｕｌ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｌ‘ＳＵｅｔ－ｅｓｓｉｖｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ一７ ｍｏｌｅ— ｅｕｌｅ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ＭｉＲＮＡ一７；ｋｎｏｃｋ ｄｏｗｎ；ｉｄｅｎｔｉｉｆｅａｔｉｏｎ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ［基金项目］国家自然科学基金资助项目（ＮＯ：８１２６０３９８）；教育部新世纪优秀人才计划项目（ＮＯ：ＮＣＥＴ一１２—０６６１）；贵州 省国际合作项目（ＮＯ：１０Ｃ３１５）。 ［通信作者］徐林，男，博士，教授，硕士生导师，研究方向：肿瘤免疫，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｕｌｉｎｚｈｏｕｙａ＠１６３．ＣＯＩＩＩ。 ・５８２・ ６期 朱顺飞等・ＭｉｃｒｏＲＮＡ一７基因敲减小鼠模型的鉴定 微小ＲＮＡ一７（ｍｉｃｒｏＲＮＡ一７，ｍｉＲ一７）是新近 研究报道的ｍｉＲＮＡ家族成员之一，定位于第１５号 染色体，已有大量文献报道其在细胞和组织器官发 育以及多种肿瘤的发生和生长中发挥着重要 作用¨ 。如Ｌｉｕ等 研究发现，ｍｉＲ一７可靶向 作用于ＲＡＦ１蛋白，抑制血管内皮细胞的增殖；Ｍｅ． ｚａ—Ｓｏｓａ等 研究发现，ｍｉＲ一７通过抑制肿瘤蛋 白ＫＬＦ４的表达，进而促进上皮细胞的转化；Ｐｏ１． １ｏｃｋ等 研究发现，ｍｉＲ一７可通过Ｐ５３信号 途径抑制大脑皮层的发育。由于ｍｉＲ一７在不同 细胞以及组织器官中的靶分子不同，因此其机 体细胞发育和组织器官功能的确切机制仍待大量 研究阐明。我们课题组在前期实验中利用ｍｉＲＮＡ ｓｐｏｎｇｅ（海绵体）技术原理，成功构建了ｍｉＲ一７的 真核表达载体ｐＥＧＦＰ—Ｃ２一ｍｉＲ一７一ｓｐｏｎｇｅ，其可 以有效下调人肺癌细胞中ｍｉＲ一７成熟体的表 达 Ｊ，并利用此载体构建了ｍｉＲ一７基因敲减小鼠 模型。本研究中，我们常规剪取了ｍｉＲ一７基因敲 减小鼠的脚趾和尾巴，分别提取其基因组ＤＮＡ和 总ＲＮＡ，利用ＰＣＲ技术扩增目的基因一增强型绿 色荧光蛋白（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＥＧ— ＦＰ）片段；利用Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ探针法检测两组小鼠７ 个不同组织器官中ｍｉＲ一７成熟体的相对表达水 平，以鉴定ｍｉＲ一７基因敲减小鼠模型；并初步观 察模型小鼠中心脏、肺脏等组织器官的形态学结构 改变，以期为后续深入研究ｍｉＲ一７分子在不同细 胞以及组织器官发育中的生物学功能提供前期的 实验基础。 １材料与方法 １．１ 材料６～８周ＳＰＦ级ＦＶＢ小鼠和第５代 ｍｉＲ一７ＫＤ的ＦＶＢ小鼠［广州赛业生物科技有限 公司，许可证号：ＳＹＸＫ（苏２０１０—０００３）］；Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＶｅｒｓｉｏｎ２．０、ＲＮＡｉｓｏ删Ｐｌｕｓ、２ｘＳＹＢＲ（ｒ） ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ ＴＭ（ＴａＫａＲａ）；Ｔ ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）；ｍｉＲ一７的Ｒｅａｌ— ｔｉｍｅ ＰＣＲ探针（ＭＢＩ公司）；ＩＡＮａｍｐ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｋｉｔ（天根公司）；ＨＥ染色液（泰康医疗）；分析纯级 三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇（重庆川东化工）； Ｃ１０００ Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ荧光定量ＰＣＲ仪、Ｓ１０００ Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ ＰＣＲ仪（Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司）；ＬＥＧＥＮＤ ＭＩＣＲＯ２１Ｒ型低温离心机（Ｔｈｅｒｍｏ）。 １．２ 方法 １．２．１小鼠脚趾基因组ＤＮＡ和尾巴总ＲＮＡ的提 取常规剪取７只ｍｉＲ一７ＫＤ小鼠的脚趾和尾巴， 分别用来提取其基因组ＤＮＡ和总ＲＮＡ；剪取１只 ｗＴ小鼠的尾巴，提取其总ＲＮＡ。基因组ＤＮＡ的 提取方法和反应体系均按照ＴＩＡＮａｍｐ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｋｉｔ试剂盒说明书操作。ＲＮＡ提取操作如下： 每５０～１００ ｍｇ组织中加入ＲＮＡｉｓｏＰｌｕｓ １ｍＬ，匀浆 器研磨，每毫升匀浆液加入２００ ＩｘＬ三氯甲烷，剧烈 震荡１５ Ｓ，室温静置５ ｍｉｎ，１０ ０００ ｒｍｐ低温离心１０ ａｒｉｎ，将离心后得到的上清液移人新的离心管中，随 后加入５００ ｔｘＬ异丙醇，室温静置１０ ｍｉｎ，１２ ０００ ｒｍｐ低温离心１０ ｍｉｎ，可见管底ＲＮＡ絮状沉淀，弃 上清，７５％乙醇１ｍＬ洗涤ＲＮＡ沉淀，７ ３００ ｒｐｍ低 温离心５ ｒａｉｎ，弃上清，干燥ＲＮＡ沉淀，加入６０ ￣ＬＲＮＡｓｅ ｆｌｅｅ ｗａｔｅｒ溶解该ＲＮＡ沉淀。 １．２．２小鼠７个不同组织器官总ＲＮＡ提取常规 解剖获取ｗｒ和ｍｉＲ一７ＫＤ小鼠的心脏、肝脏、脾脏、 肺脏、肾脏、胸腺和胰腺各７０ｒａｇ，用来提取总ＲＮＡ，提 取操作方法见１．２．１；同时，两组小鼠心脏、肺脏、结肠 分别置于４％甲醛中，为ＨＥ染色切片备用。 １．２．３总ＲＮＡ逆转录成ｅＤＮＡ内参基因ＧＡＰ— ＤＨ按照ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ 试剂盒说明书操作，ＲＮＡ ７ ５ ｐ，Ｌ，ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８ ｐｒｉｍｅｒ １ ｐｕＬ，ＤＥＰＣ ｔｒｅａｔｅｄ ｗａｔｅｒ ３．５ Ｌ，６５ ｃ【＝ ５ ｍｉｎ，立即取出冰浴２ ｒａｉｎ以上；５ｘ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ Ｌ，ＲｉｂｏｌｏｃｋＲｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｅｒ ｌ Ｌ，Ｒｅｖｅｒｔ Ａｉｄ Ｒｅ－ ｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｅｒｉｐｔａｓｅ １ Ｌ，１０ ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ ２ ｔｘＬ， ４２℃１ ｈ，７０℃１０ ｍｉｎ，４ 保存。ｍｉＲ一７逆转录 反应体系及条件：１０ ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ １．５ ｐ，Ｌ，Ｒｅｖｅｒｔ Ａｉｄ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｅｒｉｐｔａｓｅ ０．２５ ｒ Ｌ，５×ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆ－ ｅｒ ３ Ｌ，ＲｉｂｏｌｏｃｋＲｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｅｒ ０．１９ ＩｘＬ，ＲＮＡ ５ Ｌ，５×Ａｂｉｏｎ Ｐｒｉｍｅｒ ３ Ｌ，ＤＥＰＣ ｔｒｅａｔｅｄ ｗａｔｅｒ ２．０６ Ｌ，总体系为１５ Ｌ。反应条件：１６℃３０ ａｒｉｎ，４２℃３０ ｒａｉｎ，８５℃３０ ｒａｉｎ，降至４℃。 １．２．４检测两组小鼠７个不同组织器官中ｍｉＲ一 ７成熟体的相对表达水平 利用Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ 技术对组织器官中ｍｉＲ一７表达水平进行检测和 比较分析。内参基因ＧＡＰＤＨ的上游引物为：５’一 ＧＡＧｃｃＡＡＡｃＧＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴ一３’，下游引物为： ５’一ＧＡＣＧＧＧＣＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＣＴＴ一３’。 内参基因Ｒｅａｌ—Ｔｉｍｅ ＰＣＲ反应体系：２× ＳＹＢＲ（ｒ）ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ ＴＭ １０ ｐ，Ｌ，ＤＥＰＣ ｔｒｅａｔｅｄ ｗａ— ｔｅｒ ７ Ｌ，ｃＤＮＡ ２ ＬＬＬ，ＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（１０ Ｍ） ０．５ ＩｘＬ，ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（１Ｏ Ｍ）０．５ ｐ．Ｌ，总体 系为２０ Ｌ。反应条件：９５℃预变性３０ Ｓ，９５℃ ・５８３・ ４ 遵义医学院学报 ３７卷 达ｍｉＲ一７可显著抑制ＣＧＧＢＰ１蛋白的表达，进 ３讨论 目前，随着对ｍｉＲＮＡ研究的不断深入，已知 ｍｉＲＮＡ的数量与日俱增。不过，大部分ｍｉＲＮＡ的 而抑制肺癌细胞的体内生长 。本研究中，我们 进一步发现ｍｉＲ一７基因敲减小鼠模型中心脏、 肺脏以及结肠均较ｗＴ小鼠形态学结构发生了明 生物学功能仍然未知。在基因功能研究中，最有效 的方法是利用基因敲出／敲减或过表达技术来改变 显的病理性改变。这些研究结果提示，ｍｉＲ一７作 为ｍｉＲＮＡ家族的重要分子之一，不仅在组织器官 肿瘤发生发展中发挥重要作用，而且在机体组织 器官的发育中也具有重要的功能。因此，后 特定基因的表达，进而分析其生物学功能。因此， 对于ｍｉＲＮＡｓ分子来说，基因敲出／敲减或过表达 技术也是深人探讨其生物学功能的重要手段之一。 已有的研究显示，与ｍｉＲＮＡ互补的反义寡核苷酸 可作为ｍＲＮＡ结合的竞争性抑制剂来研究特定 ｍｉＲＮＡｓ分子的生物学功能，但是此技术抑制效能 时间短，只能做短期分析 一１０１。ｍｉＲＮＡ海绵体技 术则是目前使用最多的高效ｍｉＲＮＡ抑制剂，不仅 其设计简单，且抑制效力和持续时间均显著优于反 义寡核苷酸。因此，利用此技术使得构建特定 ｍｉＲＮＡ分子敲出／敲减的转基因小鼠模型变得相 对容易。本研究中，我们在之前应用ｍｉＲＮＡ海绵 体技术成功构建的ｍｉＲ一７真核表达载体ｐＥＧＦＰ —Ｃ２一ｍｉＲ一７一ｓｐｏｎｇｅ基础之上 ，进一步鉴定 基于该载体构建的ｍｉＲ一７基因敲减小鼠模型。 ＰＣＲ结果显示，第五代模型小鼠脚趾基因组ＤＮＡ 和鼠尾总ＲＮＡ中仍能扩增出目的片 ＥＧＦＰ。这 提示，我们利用ｐＥＧＦＰ—ｃ２一ｍｉＲ一７ —ｇｐｏｎｇ载体 不仅成功构建了ｍｉＲ一７基因敲减小鼠模型，且 ｐＥＧＦＰ—Ｃ２一ｍｉＲ一７一ｓｐｏｎｇｅ真核表达载体能够 在小鼠基因组中稳定遗传表达。我们随后利用ｌｉｔ —ＰＣＲ技术检测了ｍｉＲ一７ＫＤ小鼠较ｗＴ小鼠心 脏、肝脏以及脾脏等７个重要组织器官中ｍｉＲ一７ 成熟体的相对表达水平。结果发现，ｍｉＲ一７ＫＤ小 鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺以及胰腺的 ｍｉＲ一７成熟体的表达水平较ｗＴ小鼠均显著下 调，这表明ｍｉＲＮＡ ｓｐｏｎｇｅ技术可在体内长效抑制 ｍｉＲＮＡ的表达。 新近研究显示，ｍｉＲ一７与肺癌、乳腺癌、肝癌 以及胰腺癌等多种肿瘤的发生、发展密切相关。 如Ｏｋｕｄａ等 研究发现，ｍｉＲ一７可通过对ＫＬＦ４ 信号途径的作用抑制乳腺癌脑转移；Ｍａ 等¨ 研究还发现，在肝癌细胞中，低表达ｍｉＲ一７ 可上调Ｃｕｌｌｉｎ ５蛋白的表达，进而促进癌细胞由 Ｇ 期向ｓ期的转化；Ｎｉｅｔｏ等 研究则显示，ｍｉＲ 一７在胰腺癌中是显著低表达的，上调其表达可 显著抑制胰腺癌细胞的生长和转移侵袭能力。 类似地，我们课题组在前期研究中也发现，过表 ・Ｓ８６・ 续进一步利用此模型深入探讨ｍｉＲ一７调节这些 组织器官发育的具体机制，不仅对于最终阐 明ｍｉＲ一７的生物学功能，而且对于探讨特定组 织器官的发育学也具有重要意义。 总之，本研究中我们发现利用ｍｉＲＮＡ—ｓｐｏｎｇｅ 技术原理构建的ｍｉＲ一７基因敲减小鼠模型中，７ 个重要组织器官ｍｉＲ一７成熟体的表达水平均较 、ｌ琵ｌ： １］１ ］２ ＷＴ小鼠显著下调，这为后续深入研究ｍｉＲ一７在 组织器官发育中的作用及其相关机制提供了重要 的前期实验基础。 一一一一 一一一 ］ ３ 一～一遵义医学院学报 ３７卷 此从形态学角度可推断出硫酸锌预处理能够减轻 心肌缺血再灌注损伤，即对缺血再灌注心肌超微结 构具有保护作用。由此可见，硫酸锌预处理与缺血 学报，２０１３，３６（４）：３３２—３３５． ［５］Ｆｌａｍｅｎｇ Ｗ，Ｂｏｒｇｅｒ Ｍ，Ｄａｅｎｅｎ Ｗ．Ｕｔｔｒａｓｔｒｕｅｔｕｒａｌ ａｎｄ ｃｙ— ｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙｃａｒｄｉａｃ 预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有相似的保 护作用，且提示硫酸锌预处理能够模拟缺血预处理 的心肌保护作用。但是这两种预处理方式的心肌 保护作用具体机制有待进一步探索研究。 综上所述，本研究结果表明缺血／再灌注可对 心肌细胞超微结构造成严重损伤，硫酸锌预处理可 替代缺血预处理减轻再灌注所致心肌细胞超微结 构损伤，以及线粒体评分数值较低即线粒体损伤较 小，由此可推测出硫酸锌预处理大鼠心脏可产生心 肌保护作用。 ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉａ ｉｎ ｍａｎ［Ｊ］．Ｔｈｏｒａｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｓｕｒｇ，１９８０， ７９（３）：４１３—４２４． ［６］汪永义，薛松，刘沙，等．阿司匹林抑制ＮＦｋｂ激活减轻 心肌缺血再灌注损伤［Ｊ］．医学研究生学报，２００３，１６ （２）：１０１—１０４． ［７］Ｋｅｒｅｍ Ｍ，Ｂｅｄｉｒｌｉ Ａ，Ｏｆｌｕｏｇｌｕ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｐｒｅｃｏｎｄｉ－ ｔｉｏｎｉｎｇ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｌｉｖｅｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｕｓｔａｉｎｉｎｇ ｅｎｅｒｇｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｆｔｅｒ ｐａｒｔｉａｌ ｈｅｐａｔｅｃｔｏｍｙ ｕｎｄｅｒ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｔ，２００６，２６（８）：９９４—９９９． ［８］Ｖｅｎｕｇｏｐａｌ Ｖ，Ｌｕｄｍａｎ Ａ，Ｙｅｌｌｏｎ Ｄ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｅａｒｔ ｄｕｒｉｎｇ ｓｕｒｇ［Ｊ］．Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｅ Ｓｕｒｇ，２００９， ３５（６）：９７７—９８７． ［参考文献］ ［１］Ｊｉａｎｇ Ｗ Ｌ，Ｆｕ Ｆ Ｈ，Ｘｕ Ｂ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｆｏｒｓｙｔｈｏｓｉｄｅ ｉｎ ｒａｔ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ——ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕ－－ ［９］袁小兰．预适应与后适应的研究进展［Ｊ］．数理医学杂 志，２０１１，２４（５）：５９１—５９４． ［１０］马淇，刘垒，陈俭．活性氧、线粒体通透性转换与细胞 凋亡［Ｊ］．生物物理学报，２０１２，２８（７）：５２３—５３６． ［１１］Ｍａ Ｑ，Ｆａｎｇ Ｈ，Ｓｈａｎｇ Ｗ，ｅｔ ａ１．Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｆｌａｓｈｅｓ：Ｅａｒｌｙ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｓｉｇｎａｌｓ ｆｏｒ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ——ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐ・－ ｒｙ：ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２０１０，１７（８—９）：６３５—６３９． ［２］宋瑞，高秉仁，赵启明，等．锌对体外循环心肌缺血再 灌注的保护作用［Ｊ］．中华小儿外科杂志，２００７，２８ （１０）：５１５—５１８． ｔｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２０１１，２８６（３１）：２７５７３—２７５８１． ［１２］Ｆａｎｇ Ｈ，Ｃｈｅｎ Ｍ，Ｄｉｎｇ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｉｍａｇｉｎｇ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｆｌａｓｈ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ—ｃｏｕｐｌｅｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ［３］Ｊｕｈａｓｚｏｖａ Ｍ，Ｚｏｒｏｖ Ｄ Ｂ，Ｙａｎｉｖ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｇｌｙｃｏ・ ｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ一３Ｂ ｉｎ ｅａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｉｒｃｕｌａ— ｔｉｏｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９，１０４（１１）：１２４０—１２５２． ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ａｎｉｍａｌｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，２０１１，２１（９）： １２９５—１３０４． ［收稿２０１４—０８—２５；修回２０１４—１０—１７］ （编辑：谭秀荣） ［４］陈伟，杜文娟，徐鹏，等．乳化异氟醚后处理对缺血／再 灌注大鼠离体心脏超微结构的影响［Ｊ］．遵义医学院 （上接第５８６页） ［７］李永菊，周涯，陈超，等．ｐＧ—ｍｉＲ一７一Ｓｐｏｎｇｅ转基因小 鼠载体的构建及鉴定［Ｊ］．遵义医学院学报，２０１４，３７ （２）：１５６—１６０． ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ＫＬＦ４［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１３，７３（４）：１４３４— １４４４． ［１２］Ｍａ Ｃ，Ｑｉ Ｙ，Ｓｈａｏ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ一７ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｃｕｌｌｉｎ ５（ＣＵＬ５）ｔｏ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ Ｇ１／Ｓ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ『Ｊ］．ＩＵＢＭＢ Ｌ ，２０１３，６５（１２）：１０２６—１０３４． ［８］ｘｕ Ｌ，Ｗｅｎ Ｚ，Ｚｈｏｕ Ｙ，ｅｔ ａ１．ＭｉｃｒｏＲＮＡ一７ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ＴＬＲ９ ｓｉｇｎａｌｉｎｇｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｌｔｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｉｎ０ｓｉｔｉｄｅ一 ３一ｋｉｎａｓｅ，ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｕｂｕｎｉｔ ３／Ａｋｔ ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｂｉ— ｏｌ Ｃｅｌｌ，２０１３，２４（１）：４２—５５． ［１３］Ｎｉｅｔｏ Ｍ，Ｈｅｖｉａ Ｐ，Ｇａｒｃｉａ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｍｉＲ一７ ｉｍ— ｐａｉｒｓ ｉｎｓｕｌｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｐａｎｃｒｅａｓ ａｎｄ ｉｎ ［９］Ｍａ Ｄ，Ｔａｏ Ｘ，Ｇａｏ Ｆ，ｅｔ ａ１．ｍｉＲ一２２４ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａｎ ｏｎｃｏ —ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂｕｄｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２０１２，２１ （８）：１７６１—１７７４． ｍｉＲＮＡ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＡＫＴ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｌ Ｌｅｔｔ，２０１２，４（３）：４８３—４８８． ［１０］Ｃｏｌｌｉｓｏｎ Ａ，Ｈｅｒｂｅｒｔ Ｃ，Ｓｉｅｇｌｅ Ｊ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ａｌｔｅｒｅｄ ｅｘｐｒｅｓ— ｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｉｎ ｔｈｅ ａｉｒｗａｙ ｗａｌｌ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ａｓｔｈｍａ： ［１４］Ｈｕ Ｙ，Ｌｉａｏ Ｚ，Ｃｈｅｎ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｏｖｅｒ—ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｍｉｃｒｏＲＮＡ 一７ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ ＣＧＧＢＰ１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１４，３０（２）：１２５— １３Ｏ． ｍｉＲ一１２６ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ［Ｊ］．ＢＭＣ Ｐｕｌｍ Ｍｅｄ，２０１１．１１：２９． ［１１］Ｏｋｕｄａ Ｈ，Ｘｉｎｇ Ｆ，Ｐａｎｄｅｙ Ｐ Ｒ，ｅｔ ａ１．ｍｉＲ一７ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｂｒａｉｎ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ—ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ［收稿２０１４—０９—２５；修回２０１４—１０—１３］ （编辑：谭秀荣） ・５９０・
