维普资讯 http://www.cqvip.com 华中医学杂志２００２年第２６卷第４期 人胃癌组织ＤＮＡ微卫星不稳定性分析 （１１０００３沈阳） 中国人民第２０２医院检验科刘晓茹 崔娴维 宫立国 李海峰 【摘要】 目的探讨微卫星不稳定性（ＭＳＩ）与胃癌的关系。方法２６．７％（８／３０），Ｄ３Ｓ１０６７位点３３．３％（１０／３０）。结论采用ＰＣＲ聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染技术，检测３０ 例胃癌肿瘤组织ＤＮＡ Ｄ２Ｓ１２３位点及Ｄ３Ｓ１０６７位点的ＭＳＩ。结果 ３０例胃癌２个位点ＭＳＩ检出率分别为：Ｄ２Ｓ１２３位点 ＭＳＩ是胃癌发生过程中的分子标志，在胃癌的发生中起着重要作用。 【关键词】 胃癌微卫星ＤＮＡ微卫星不稳定性 研究表明，微卫星不稳定性（ＭＳＩ）在肿瘤发生 中扮演了重要角色，可能是肿瘤发生的一种新机 制［ 。本研究选择２个微卫星标记位点，采用ＰＣＲ 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染技术，对３０例胃癌进 行了ＭＳ１分析。 材料与方法 一、材料 １．试剂ＴａｑＤＮＡ聚合酶购自美国Ｐｒｏｍｅｇａ 公司。 ２．主要仪器ＰＥ４８０ＰＣＲ扩增仪（美国ＰＥ公 司）；垂直板电泳系统（美国Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司）。 ３．标本 胃癌新鲜手术标本共３０例，来自 １９９６－－１９９８年辽宁省肿瘤医院及沈阳军区总医院 收治的病例，经病理诊断为低分化腺癌１２例、中分 化腺癌１４例、高分化腺癌４例，其中男１８例、女 １２例，年龄３３－－８３岁。每例均取自身正常胃粘膜 做对照。组织标本常规方法提取ＤＮＡ。 ４．引物ＰＣＲ引物由宝生物工程（大连）公司 合成。引物序列为：Ｄ２Ｓ１２３位点上游引物：５ 一 ＡＣＡＧＧＡＴＧＣ ｒ（１ 几ｖｒＡ＿３ ，下游引物：５ 一 ＧＧＡＣｒ１ｖｒＣＣＡＣＣＴＡＴ（ ＡＣ３ ；Ｄ３Ｓ１０６７位点 上游引物：５＇－ＴＣＡＴＣＴＡＴＣＴＣＣＣＡＡ（ ＧＴＴＧＡＧ一 ３ ， 下游引物： ５ 一ＧＡＧＣＡ１ｖｒＡＣ ｒ（ １ｖＩｖ１、Ａ Ａ＿ ＧＡＴＡＧＧ一３ 。 二、方法 １．ＰＣＲ反应２５ ｌ ＰＣＲ反应体系中加入基因 组ＤＮＡ１００ ｎｇ，上、下游引物各２０ ｐｍｏｌ／Ｌ，１０× ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ２．５ ｌ，ｄＮＴＰｓ２５０ ｍｍｏｌ／Ｌ，ＴａｑＤＮＡ 聚合酶２ Ｕ。ＰＣＲ扩增条件：Ｄ２Ｓ１２３位点为９６℃／ １分钟，５６℃／２分钟，７２℃／１分钟，３５个循环，最 后７２℃延伸７分钟。Ｄ３Ｓ１０６７位点为９４℃／３０秒， ５６℃／４０秒，７２℃／３０秒，３２个循环，最后７２℃延 伸１０分钟。 ２．结果判定ＰＣＲ扩增产物加入１０肚ｌ加样缓 冲液，９５℃变性１０分钟，冰中骤冷，取１０ ｌ上样 至含７ ｍｍｏｌ／Ｌ尿素的６％聚丙烯酰胺凝胶（１９：１） 内，５０℃、１００Ｖ电泳２～４小时。电泳凝胶银染色， 观察结果。若肿瘤组织的条带与相应正常组织比较 有额外的ＤＮＡ等位片段出现，或出现等位片断泳 动以及某一条带消失即可判断为ＭＳＩ。 结 果 ３０例胃癌２个位点ＭＳＩ检出率分别为： Ｄ２Ｓ１２３位点２６．７％（８／３０），Ｄ３Ｓ１０６７位点３３．３％ （１０／３０）。见图１、图２。 Ｎ Ｔ ■ ２ 图１ 胃癌患者Ｄ２Ｓ１２３位点微卫星不稳性，Ｎ为 正常组织，Ｔ为肿瘤组织（图２同此） 图２ 胃癌患者Ｄ３Ｓ１０６７位点微卫星不稳定性 讨 论 微卫星是由２～６个核苷酸组成的，是具有高 度多态性的简单串联排列而成的核苷酸重复序列。 它广泛存在于原核及真核细胞的基因组中。ＭＳＩ是 指由于复制错误引起的简单重复序列的改变，就肿 瘤而言，指的是肿瘤组织与其相应的非肿瘤组织 ＤＮＡ结构性等位基因的大小发生改变。肿瘤遗传 维普资讯 http://www.cqvip.com 学研究表明，细胞的恶性转化与遗传物质的不稳定 程中的常见改变，是基因组不稳定的一个标记，且 有关，ＭＳＩ是胃癌发生过程中的常见现象，可能参 ＭＳＩ作为肿瘤遗传不稳定的一个敏感指标已逐渐 与了胃癌的发生及发展 Ｊ。 被大家接受，因此，检测ＭＳＩ有可能成为胃癌预防 研究表明，ＤＮＡ错配修复缺陷是基因不稳定 及诊断的重要手段。 的主要原因，且与人类肿瘤密切相关 Ｊ。该系统任 何一基因突变都会导致错配修复功能缺陷，结果产 参考文献 生遗传不稳定，表现为复制错误（ＲＥＲ）或ＭＳＩ，从 １ Ｗｏｏｓｔｅｒ Ｒ，Ｃｌｅｔｏｎ—Ｊａｎｓｅｎ ＡＭ，Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｎ ｅｔ ａ１．Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ 而肿瘤易感 Ｊ。本研究在３０例胃癌中发现Ｄ２Ｓ１２３ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔｓ（ｍｏｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ）ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ． 位点ＭＳＩ ８例，占２６．７％。微卫星Ｄ Ｓ１２３位点与 Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，１９９４，６：１５２ 错配修复基因ｈＭＳＨ２（２ｐ２２）相邻，ｈＭＳＨ２基因与 ２ Ｒｈｙ１１ ＭＧ，Ｐａｒｋ ＷＳ，Ｍｅｌｔｚｅｒ ＳＪ．Ｍｉｅｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｓｎｔａｂｉｌｉｔｙ 遗传性非息肉性大肠癌的发病有关 ５，该基因的突 ｏｃｃｕＩＳ ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ． 变常造成ＤＮＡ修复紊乱，导致ＭＳＩ。本实验 １９９４，９：２９ ３ Ｌｏｅｂ ＬＡ．Ｍｕｔａｔｏｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｍａｙ ｂｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉ— Ｄ２Ｓ１２３位点２６．７％的ＭＳ１支持ｈＭＳＨ２基因的突 ｓｔａｇｅ ｃａｒｄｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９１，５１：３０７５ 变与ＭＳＩ有关的学说。ＭＳＩ在部分胃癌的发生中 ４熊斌，郑树．错配修复基因与肿瘤．国外医学肿瘤学 起作用是与ＤＮＡ错配修复基因缺陷有关。 分册，１９９７，２６（１）：１６ 本研究在３０例胃癌中发现Ｄ３Ｓ１０６７位点ＭＳＩ ５ Ｔｈｉｔｘｘｔｅａｕ ＳＮ，Ｂｒｅｎ Ｇ，Ｓｃｈａｉｄ Ｄ．Ｍｉｅｒｏｓａｔｄｌｉｔｅ ｉｓｎｔａｂｉｌｉｔｙ １０例，占３３．３％。微卫星Ｄ３Ｓ１０６７位点跨越脆性组 ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｃｏｌｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３，２６８：８１６ 氨酸三联体基因（ＦＨＩＴ）的位点３ｐ １４．２，ＦＨＩＴ基 ６ ＭａｓａｔａｋａＯｈｍ，Ｈｉｒｏｓｈｉ Ｉ，ＭａｒｉａＧ ｅｔａ１．ＴｈｅＦＨＩＴｇｅｎｅ， 因和多种肿瘤有关，研究发现胃癌、食管癌有５０％ ｓｐａｎｎｉｎｇ ｔｈｅ ｃｈｒｏｌＴｌｏｓｏｍｅ ３ｐ１４．２ ｆｒａｇｉｌｅ ｓｉｔｅ ａｎｄ ｒｅｎａｌ ｃａｒ— 的缺失转录 ６。Ａｋｉｈｉｋｏ等用ＰＣＲ．ＳＳＣＰ直接测序， ｄｎｏｎ－ｍ－ａｓｓｏｄａｔｄｅ ｔ（３；８）ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ，ｉｓ ａｂｎｏｒｍａｌ ｉｎ ｄｉｇｅｓ— 对４０例原发性胃癌研究ＦＨＩＴ的突变，结果发现， ｔｉｖｅ ｔｒａｃｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ，１９９６，８４：５８７ 其第６外显子６１编码的ＡＣＧ变成了ＡＴＧ。Ｋｕｍａｒ ７ Ｋｕｒｎａｒ Ｋ，Ｒａｆｆａｃｅ Ｂ，Ｔ盯ｅｓａ Ｄ ｅｔ ａ１．Ｐｏｔｅｎｔｉｌａ ｇａｓｔｒｏｉｎ ｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｔｍ－￣ｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｌｏｃｕｓ ａｔ ｔｈｅ ３ｐ１４．２ ＦＲＡ３Ｂ ｓｉｔｅ ｉ— 发现在３ｐ １４．２位点，许多肿瘤细胞系（包括胃癌细 ｄｅｎｔｉｆｉｄｅ ｂｙ ｈｏｍｏｚｙｇｏｎｓ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｃａｎｃｅｒ 胞系）均表现纯合缺失，提示此位点可能有一个与 Ｒｅｓ，１９９６，５６：９７８ 胃肠道肿瘤有关的抑癌基因 ］。本试验结果表明该 收稿日期：２００２．１．１５． 位点ＭＳＩ与ＦＨＩＴ基因有关联。ＭＳＩ是胃癌发生过 华中医学杂志 二ｏｏ二年 第二十六卷 第四期 华中睡挚 主管单位湖北省卫生厅 协办单位 主办单位中华医学会武汉分会 湖北省新华医院 Ｃｅｎｔｒａｌ Ｃｈｉｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ 编辑出版华中医学杂志编辑部 武汉滨湖双鹤药业有限责任公司 华中科技大学同济医学院附属同济医院 双月刊 （４３００１４武汉市中山大道７９１号） 主 编裘法祖 电 话（０２７）８２８３３５４４ 华中科技大学同济医学院附属协和医院 武汉大学人民医院 编辑部主任余志松 国内总发行武汉市报刊发行局 武汉市中心医院 ． 发行范围公开发行 国外总发行 中国国际图书贸易总公司 广告经营许可证武工商广字０１—７号 （Ｊｒ京３９９信箱国外代号：ＢＭ６４９５） 印刷 长江水利委员会航测信息工程院 刊号 订购处全国各地邮政局 规定出版日期双月２０日 邮发代号３８—２６ 第２６卷第４期２００２年８月２０日出版 每册定价４．５０元
