吉林化工学院
文 献 综 述
中文题目 350吨∕年硫酸双氢链霉素生产装置（分离系统）工艺设计
外文题目 the production process design of the devices dihydrostreptomycin sulfate with an annual output of 350 tons
性 质: □毕业设计 □毕业论文
教 学 院 环境与生物工程学院
专业班级 生工 0502
学生姓名 马 晓 明
学生学号 05130202
指导教师 郑 昆
2009 年 03 月 11 日
吉林化工学院毕业设计(论文)
摘 要
本文综述了链霉素的国内外制药公司的生产技术水平，发展趋势及工艺研究、酶技术的应用。同时对链霉素工业生产的流程：主要是链霉素的发酵和分离提纯方法及实际操作中的条件控制方法加以分析论述。
关键词：链霉素 生产技术水平 发展趋势 发酵 分离提纯 条件控制
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目 录
摘 要 .............................................................. I 前 言 .............................................................. 1 第1章 国内外链霉素生产的研究概况 .................................. 1
1.1 国外生产及技术水平概况 ........................................................................................................................................ 1 1.2 国内生产及技术水平概况 ........................................................................................................................................ 1
1.2.1 产量及出口量 ................................................................................................................................................... 1 1.2.2 生产技术水平 ................................................................................................................................................... 2 1.2.3 产品质量 ........................................................................................................................................................... 2 1.3 国内外技术水平比较和展望 .................................................................................................................................... 2
1.3.1 菌种研究 ......................................................................................................................................................... 2 1.3.2 发酵工艺研究 ................................................................................................................................................. 3 1.3.3 提炼工艺研究 ................................................................................................................................................. 3 1.3.4 酶技术的工艺研究 ......................................................................................................................................... 3
第2章 链霉素生产的工艺流程 ....................................... 4
2.1 生产菌种 .................................................................................................................................................................... 4
2.1.2 出发菌株的选择 ............................................................................................................................................. 5 2.1.2 切断支路代谢 ................................................................................................................................................. 5 2.1.3 解除自身的反馈调节 ..................................................................................................................................... 5 2.1.4 增加前体物的合成 ......................................................................................................................................... 6 2.2 无菌空气的制备 ........................................................................................................................................................ 7 2.3 发酵工艺 .................................................................................................................................................................... 8
2.3.1 斜面孢子培养 ................................................................................................................................................. 8 2.3.2 摇瓶种子培养 ................................................................................................................................................. 8 2.3.3 种子罐扩大培养 ............................................................................................................................................. 9 2.3.4 发酵罐培养 ..................................................................................................................................................... 9 2.4 链霉素发酵条件及中间控制 .................................................................................................................................. 13
2.4.1 溶氧的影响及控制 ....................................................................................................................................... 13 2.4.2 温度 ............................................................................................................................................................... 14 2.4.3 pH值 ............................................................................................................................................................ 14 2.4.4 泡沫与消沫 ................................................................................................................................................... 15 2.4.5 中间补料优的化控制[14]............................................................................................................................ 15 2.5 提取及精制 .............................................................................................................................................................. 16
2.5.1 发酵液的过滤及预处理 ............................................................................................................................... 16 2.5.2 提取和精制 ................................................................................................................................................... 17
参考文献 ........................................................... 19
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前 言
链霉素（Streptomycin）是瓦克斯曼〔Waksman S.A.)于1944年从灰色链霉菌（Streptomyces,griseus）培养液中分离出来的一种碱性抗生素。链霉素是一种相当强的有机碱，也是一种多糖类化合物。其分子结构是由链霉肌、链霉糖和N-甲基-L-葡萄糖胺三部分以苷键相联结而成的。链霉素碱稳定性特别差，工业产品主要是其硫酸盐形式，即硫酸链霉素(Streptomycin Sulfate)。链霉素对结核杆菌有强大抗菌作用，其最低抑菌浓度(MIC)一般为0.5 mg/L。它对许多革兰氏阴性菌(G-)如大肠杆菌、肺炎杆菌、肠杆菌属、沙门菌属、布鲁菌属等也具抗菌作用。链霉素对革兰氏阳性菌(G+)抗菌活性较差。链霉素游离碱为白色粉末。大多数盐类也是白色粉末或结晶，无嗅，味微苦。链霉素在中性溶液中能以三价阳离子形式存在，所以，可用离子交换法进行提取。其水溶液比较稳定，但其稳定性受PH值和温度的影响较大。其硫酸盐的水溶液在PH=4-7，室温下放置数星期，仍很稳定，如在冰箱中保存三个月内活性无变化。
目前抗生素的生产主要是利用微生物发酵来进行，少数采用化学合成的方法，当然也有的采用化学法或生化法半合成。对于链霉素可由灰色链霉菌发酵生产。双氢链霉素可由湿链霉菌产生，但通常以半合成方法生产[1]。
一般认为链霉素是治疗结核杆菌感染的首选药物，除此以外，还用于治疗革兰氏阴性菌所引起的泌尿道感染、结核性脑膜炎，鼠疫，肠道感染，肺炎，败血症，百日咳等。链毒素的缺点是容易产生耐药性；长期使用对第八对脑神经有毒害除了医用外，也有报道将链霉素用于农牧业的。例我国新疆某生产建设兵团的农场自1985年起应用链霉素治疗菜类瓜类和粮食等作物的病害，取得较好效果；链霉素还可用于猪肺炎，雏鸡白痢疾、以及鸡，鸭，鹅的巴氏杆菌感染等的治疗。国内有些厂家将生产的链霉素作为农用出口，效益较好[2]。
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第1章 国内外链霉素生产的研究概况
1.1 国外生产及技术水平概况
国外生产链霉素的有近二十个国家的约三十家制药公司。其中主要的公司有美国的默克(Merek公司，辉瑞(Pfizer)公司，施贵宝(Squibb)公司，英国的葛兰素(Glaxo)公司比彻姆(Beecham)公司，德国的赫斯特(Hoeehst)公司，法国的罗纳·普朗克(RhonePoulene)公司，丹麦的挪佛(Novo)公司，日本的协和(Kyowa)发酵株式会社等等。此外还有原苏联，荷兰、印度、保加利亚、西班牙等国家的一些公司。
由于链霉索的耳毒性较严重，世界各国的产量和使用量呈逐年下降趋势。如原苏联1976年链霉素的产量达1415吨，1987年降为600吨，1989年为800吨左右。美国施贵宝公司和匈牙利的诺因工厂先后于1977年和1980年停产。目前国外链霉素的主要生产企业是美国的辉瑞公司和法国的罗纳·普朗克公司。目前全世界链霉素产量估计在2500吨至3000吨左右。
1.2 国内生产及技术水平概况
链霉素是我国较早投入生产的抗生素之一。生产企业曾有十几家，包括杭州药厂，扬州制药厂等。近几年仅剩华北制药厂等五家药厂生产。凭借不断的创新进步和“质量文化”的传承，目前，华北制药厂链霉素年产年产1200吨[3]，占亚洲总产量75%、世界60%的绝对优势，华胜公司成为目前世界最大的链霉素生产企业，产量居世界第一[4]。
1.2.1 产量及出口量
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近十年来，我国链霉素的年产量一直维持在1000吨以上，在1993年以前国内产量最大的是华北制药厂，年产量在650吨左右，其次是大连制药厂和山东济宁抗生素厂，年产量均在200~250吨左右。
1.2.2 生产技术水平
国内链霉素生产水平近十年来提高不快。以发酵单位为例，1982年在19000~21000u/ml之间，而1991年全国平均水平也仅为21715u/ml。国内水平最高的是大连制药厂，1991年发酵单位22990u/m l，生产指数0.6982总收率最高的是华北制药厂，1991年达79.55%
1.2.3 产品质量
目前国内所有链霉素生产企业都能达到出口标准，一般认为华北制药广与上海第四制药厂的质量相对较好。链霉素质最方面的共性问题是：成品色级达不到新优级品标准，异常毒性偏高一生物效价偏低、澄明度不符合标准等。
1.3 国内外技术水平比较和展望
我国链霉素生产最居世界前列。生产技术指标中，发酵水平与英、美公司比略显落后(英国葛兰素公司发酵单位30000~40000u/ml，但发酵周期比我国长1倍，提炼收率高于葛兰素公司，我国处于领先水平。
近几年链霉素工艺技术方面的研究主要有下列几方面：
1.3.1 菌种研究
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主要有链霉素产生菌(Streptom—yces grlseus)之质粒研究[17]。已经证明质粒与链霉素的生物合成有关，并提出了该菌株质粒DNA复制的初步棋式。另外还有原生质融合，质粒DNA转化、DNA重组的研究等。
1.3.2 发酵工艺研究
链霉素B(甘露糖链霉素)的抑制，据报道链霉素B的生物恬性仅为链霉素的五分之一。一般用培养基中加入氯化钙，天门冬酰胺或者各氨酰胺抑制链霉素B的形成。另外也有报道在培养基中加入赖氨酸阻提高链霉素的发酵单位发酵过程的微机控制研究一除对罐温，罐压、pH，糖，氮，溶氧、二氧化碳进行在线数据控制外，有的企业还进行连续脉冲补料的应用研究。
1.3.3 提炼工艺研究
自七十年代至今研究报道甚少。前苏联和东欧国家有一些离子交换动力学等研究文章，如氯化钙复盐一离子交换工艺。我国的工艺比英国葛兰素公司的更为简便，曾有印度公司对我国工艺有兴趣。国内有些厂家在进行高压反渗透膜分离技术应用的研究，据悉可提高提炼总收率0.95％～1.33％[18]。内压中空纤维膜在链霉素发酵液除菌中的应用也显示了其优点：膜对菌体可100%截留,过滤液澄清,黏度低,杂质少,对硫酸链霉素发酵液可取代离心工艺。目前有些厂家在进行Ultra－flo超滤膜的技术研究，虽然此工艺还未用于大规模的生产应用，但实验证明：Ultra－flo超滤膜的应用，能大大提高链霉素预处理的收率，降低链霉素的损失，减少产品在母液及其他废液中的损失，有利环境保护。
1.3.4 酶技术的工艺研究
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据报道，限定量的磷酸盐能诱导链霉索的形成，并导致胞内磷酸醇酶和三磷酸腺苷酶的形成。发酵2～3d后，胞外磷酸醑酶和蛋白酶亦在培养液中发现。当这两种酶活性高时，链霉索单位也较高。
在菌种选育方面，DNA~(R—DNA)技术在链霉素菌种选育中也有发展。DNA重组就是在特定的核苷酸位点用限制性内切酶将一部分DNA从麻分子中切下来．然后再将不同的DNA连接在一起，新形成的杂交DNA再插入到宿主微生物细胞中，在宿主细胞中杂交DNA就象宿主正常基因片段那样进行克隆化(复制)，继而提高抗生素的产量。
第2章 链霉素生产的工艺流程
2.1 生产菌种
放线菌是与人类关系极为密切的一类微生物,它们广泛存在于不同的自然生态环境中，很多抗生素和具有生物活性的次级代谢产物均来自放线菌,链霉菌更是研究的最多的一类菌种。由于抗生素的滥用和使用不当,临床上耐药菌株不断出现,甚至出现超级耐药菌,筛选抗耐药菌的新抗生素或者寻找传统抗生素的替代品成为新的趋势。链霉菌的研究主要集中在链霉素及其改良抗生素。筛选能够抑制耐药菌株的链霉菌是今后努力的方向[5]。
早期发现产链霉素的菌种是灰色链霉菌，后来又找到了产链霉素或其它类型链霉素族抗生素（如羟基链霉素、双氢链霉素）的菌种。如比基尼链霉素、灰肉链霉素等。
灰色链霉菌除产生链霉素族抗生素外还产生其他族抗生素，如细菌的多肽类抗生素和杀假丝菌素、放线酮等物质。放线酮对酵母和其它真菌有很强的作用，但由于毒性大，不能用于治疗人或动物疾病。
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根据链霉素生物合成途径及代谢调节机制，选育链霉素生产菌应从如下几个方面着手
[6]
2.1.2 出发菌株的选择
出发菌株多采用灰色链霉菌（Streptomyces griseus）、比基尼链霉菌和灰色链霉菌等。灰色链霉菌的孢子梗直而短，不呈螺旋形，孢子数量很多，孢子乃断裂而成，呈椭圆形，气生菌丝和孢子均呈白色，单菌落生长丰满，呈梅花型或馒头型，直径为3~4mm，基质菌丝透明，在斜面背后产生淡色色素。
2.1.2 切断支路代谢
当初级代谢和次级代谢处于分路途径时，通过选育需要初级代谢产物的营养缺陷菌株可使相应的次级代谢产物增加。据报道，采用诱变的方法获得L-丙氨酸缺陷株，或选育苏氨酸缺陷、芳香族氨基酸缺陷变株，对提高链霉素的产量有一定的作用。
2.1.3 解除自身的反馈调节
(1) 选育抗链霉素突变株：链霉素本身也可能在链霉素合成中起反馈抑制作用，它能够完全抑制链霉胍激酶。通过在培养基中逐步增加链霉素浓度来培养产链霉素的菌株，就可以选出抗性菌株。结合诱变处理，已获得耐高浓度来培养产链霉素的菌株，就可以选出抗性菌株。结合诱变处理，已经获得耐高浓度链霉素的菌株，使链霉素的产量得到提高。
(2) 选育高浓度磷酸盐抗性突变株：由于高浓度无机磷对链霉素生物合成有抑制作用，因此选育出耐高浓度磷酸盐的新菌种，也是选育高产单位菌种的一个方向。
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(3) 选育营养缺陷型的回复突变菌：一个突变株失去某种生化特征，经过2次突变能回复该特征。有人通过诱变获得了肌醇缺陷的回复突变株，其链霉素产量提高了5倍。
(4) 选育结构类似物抗性突变株：由于某些氨基酸对链霉素生物合成中的某些酶有阻遏作用，因此通过选育某些氨基酸，特别是含硫氨基酸的结构类似物抗性突变株可使链霉素产量提高。据报道，选育乙硫氨酸、蛋氨酸氧肟酸盐、硒代蛋氨酸、1,2,3-三唑、三氟蛋氨酸抗性突变株，均有助于链霉素产量的提高。
2.1.4 增加前体物的合成
(1)葡萄糖胺是生物合成链霉素的前体物质。有人采用诱变方法获得了细胞内葡萄糖胺含量提高3倍的突变株，其链霉素产量比原菌株提高了一倍。
(2)精氨酸也是合成链霉素的前体物，增加菌体细胞精氨酸生物合成能力，有利于链霉素产量的提高。
(3)脒基转移酶是链霉胍合成的关键酶。有人将脒基转移酶进行了克隆，结果细胞内脒基转移酶的量得以扩增，从而增加了链霉素的前体物链霉胍的积累，造成链霉素产量的提高。
利用链霉素抗性基因突变筛选法获得高产菌株的几率较高，大约8.5%左右的链霉素抗性突变株是万古霉素产量获得提高的菌株。最高产量较出发菌株效价提高1.7倍[7]。
链霉菌产抗生素能力与链霉素抗性基因之间的对应关系是抗生素科研领域的一个研究热点。将链霉素抗性筛选法结合传统紫外诱变方法筛选万古霉素突变株，克服了诱变随机
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筛选的盲目性和不定向性，提高了工作效率，正突变率达到8.5%。
2.2 无菌空气的制备
在抗生素的工业发酵中，生产菌大多是好气菌，要求连续通入大量无菌空气，故无菌空气的质量标准是至关重要的。根据生产厂家的经验，如果空气系统除菌失效，造成发酵染菌，其染菌率占总染菌的20%以上，造成巨大的经济损失[8]。20世纪末，随着各行业的快速发展，工业化抗生素发酵以往常用的空气除菌设备（如采用传统的棉花活性炭、超细玻璃纤维、玻璃纤维过滤器、金属镍棒等）都因除菌效率低、过滤器拆装劳动强度大而被各种新型过滤设备所取代，如英国Dominck Hunter公司研制的折叠式过滤器[9]，具有极高的过滤精度，良好的过滤效率，很好的疏水性能，终端过滤器可以经受蒸汽灭菌要求，使用寿命较长，更换方便容易等优点。上海核工业第研究所研发的镍制微孔膜管、聚四氟乙烯微孔膜、聚四氟乙烯复合膜等。大大提高了抗生素发酵行业的空气除菌设备的除菌效率和无菌空气质量。目前国内采用的空气分过滤器过滤介质主要有耐高温高分子膜材料、金属烧结膜材料，其过滤效率可达99.9999% 。如图所示，目前工业发酵企业一般采用二级过滤除菌：总过滤器粗过滤除菌和进罐前分过滤器过滤除菌[10]。这样可很大程度上降低菌含量。
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2.3 发酵工艺
链霉素发酵生产工艺与其它抗生素相似，采用沉没培养法，在通气搅拌条件下，菌种在一定组成的培养基内，经过2~3级的种子扩大培养，最后进行发酵生产。其过程一般包括斜面孢子培养、摇瓶种子培养、种子罐培养和发酵培养等。
2.3.1 斜面孢子培养
将砂土管（或冷冻管）菌种接种到斜面培养基，经培养后即得原始斜面。原始斜面质量要求一般为：菌落分布均匀，密度适中，颜色洁白，但菌落丰满，。再从原始斜面的丰满单菌落接种至斜面上，长成后即得生产斜面，斜面上的菌落应为白色丰满的梅花形和馒头形，背面为淡棕色色素，排除各种杂型菌落。经两次传代，可达到纯化的目的，排出变异的菌株。其质量还应通过摇瓶实验来进行控制。合格的孢子面存在低温冷库（0~4℃）内备用。
2.3.2 摇瓶种子培养
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生产斜面的菌落接种到摇瓶种子培养中，经过培养基即得摇瓶种子。链霉素发酵经常使用摇瓶种子来接种种子罐。种子质量以菌丝阶段、发酵单位、菌丝粘度或浓度、糖氮代谢、种子液色泽和无菌检查为指标。摇瓶种子可以直接接种子罐，也可以在扩大培养，用培养所得的子瓶来接种。药瓶培养的培养基成分为黄豆饼粉、葡萄糖、硫酸铵、碳酸钙等。黄豆饼粉的质量和葡萄糖的用量对种子质量都有影响。
2.3.3 种子罐扩大培养
种子罐培养是用来扩大种子量的。种子罐培养可为2~3级，根据发酵罐体积大小和接种量来确定。第一级种子罐一般采用摇瓶种子接种，2~3级种子罐则是逐级转移，接种量一般都为10%左右。种子质量对后期发酵的影响甚大，种子必须符合各项质量要求（糖氮代谢、菌浓和菌丝阶段、效价和无菌要求），方能转罐。因此在培养过程中，必须严格控制好罐温、通气搅拌和泡沫，以保证菌丝生长良好，得到合乎要求的种子。
2.3.4 发酵罐培养
发酵罐培养是链霉素生物合成的最后一步，也是最关键的一步，所以要搞好发酵，就一定要考虑各因素组成，严格控制条件和质量标准。链霉素的发酵培养基主要由葡萄糖、黄豆饼粉、硫酸铵、玉米浆、磷酸盐和碳酸钙等组成。各成分元素的差异都会影响发酵生产的进行。
1 碳源
链霉素产生菌—灰色链霉菌可以利用葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、D一甘露醇、麦芽糖、乳糖和淀粉，但不利用阿拉伯糖、鼠李糖、山梨糖、卫矛糖、肌醇、蔗糖和棉子糖。
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培养基中含寡糖或多糖(如麦芽糖和淀粉)虽生长亦如葡萄糖，但合成链霉素不如葡萄糖，虽然果糖和转化糖二者一般都比葡萄糖生长好，但链霉素单位较低，若干菌株如同利用葡萄糖一样能利用脂肪、油或其它脂肪酸醋类。故可以认为碳源选择对菌体生长来说范围是较广的，但对合成链霉素则要求高、范围窄。而由于菌株之不同，往往对碳源利用亦不尽相同，故可在灰色链霉菌分类上加以应用，但不论那个菌株，在复合培养基中，都以利用葡萄糖的链霉素产率最高。亦有认为灰色链霉菌之碳源利用次序如下：葡萄糖最好，其次为乳糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、蔗糖、阿拉伯糖、甘油。而甘露醇则几乎不利用，葡萄糖用量在2~14外，而以8%葡萄糖用量为最佳。若干糖之利用报道不一，但有一点可以认为，葡萄糖在链霉素发酵中是一种较好的碳源。
淀粉代葡萄糖作为碳源对菌体生长无妨，在合成培养基中淀粉作为碳源菌丝量比葡萄糖等其它碳源多，且淀粉培养基的利用比葡萄糖快，蛋白酶活力高，但链霉素单位低。有人认为，淀粉用酸或淀粉酶水解后成水解液再应用则可达与葡萄糖相同之单位水平，而用淀粉水解液同时调整磷酸盐用量后则效果更佳，认为淀粉利用较快，故需降低磷酸盐用量，淀粉与葡萄糖间之磷酸盐用量参数为9.9%：11.1% =淀粉：葡萄糖。发酵中加油后往往使糖利用变慢，但可使氮利用加快，菌丝量有所增加，亦有用鲸鱼油于代葡萄糖应用的。一般脂肪酸都能利用，如乳酸、酒石酸、丙酮酸、丙二酸等能刺激链霉素的合成，反一丁烯二酸亦如此，但其异构物顺二丁烯二酸则无此作用。草酞乙酸、戊二酸和a-酮戊二酸亦有刺激作用，而乙酞丙酸、戊酸、己二酸则无效。其中以乳酸和丙酮酸对链霉素合成最有效。
2 氮源
氮源目前都采用复合氮源。有机氮源如黄豆粉等，无机氮源如硫酸铵等铵盐：在合成培养基上表明有机氮源对生长并不十分需要，但对链霉素合成是非常重要的。根据一系列氨基酸单一氮源试验，其中利用L-脯氨酸之链霉素单位接近于复合培养基，也由于脯氨酸
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利用缓慢之故。各种氮源之利用程度(用菌丝干重作为考察指标)进行比较，其顺序为丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、蛋白脉、天门冬酞胺、尿素、乙酞胺、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、硝酸钠、亚硝酸钠。但生长快的链霉素单位并不一定高，如谷氨酸盐为很好的生长氮源，但对链霉素产量极低，而脯氨酸虽利用缓慢但可得较好的链霉素产量。玉米浆、酵母等都是辅助氮源，而每批玉米浆间常存在一定差距，往往由于玉米浆质量不稳定亦给链霉素生产带来一定波动，而质量不稳定的原因认为主要是氨基酸含量不同所致，其中主要是极性氨基酸、丝氨酸、脯胺酸和蛋氨酸等。另外玉米浆成分中含有灰分、重金属离子、磷酸盐、酸类(包括挥发酸)、含氮物(包括游离氮)、还原物质(糖)和氨基酸，由于原因较复杂，除化学分析组分外，还要配合进行生物法考察才可应用。添加少量酵母后，其主要作用不在于氮源上，而由于无机磷的关系，曾将其相当量的磷酸盐取代酵母可取得同样的效果。用青霉菌菌丝水浸液(380C} 18~24小时处理或黄豆粉浸液(pH6. 0, 38~40℃)，处理2小时作为氮源，则其单位高峰出现比未处理者为早，说明可溶性氮比不溶性氮易利用，对缩短周期或有所裨益。
3 磷源
营养物质除碳、氮源外，磷源亦是很主要的因素之一，由于营养物供能及合成菌丝蛋白，整个代谢过程很多需有磷酸盐的参与，同时物质代谢所产生的能量，一部分被利用于高能磷酸化合物(主要是ATP)的生成。此种高能性的磷酸键成为各种生命活动的源泉而被消耗，而ADP在磷酸盐参与下再合成ATP。由于氧化磷酸化过程中必需有磷酸盐存在，可见磷酸盐之重要性，而无机磷酸盐用量必需很好加以选定，这要根据菌株和培养基而定，磷过多对菌体生长无碍，但对链霉素合成有严重抑制作用，这是由于糖利用过速引起，另外磷过多则链霉素易磷酸化成为磷酸链霉素，并在S. griseu无细胞系中链霉素与ATP共存时形成磷酸链霉素得以证实，由于磷酸链霉素无生物活性，故此亦为磷过多影响发酵单位的原因之一。
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4 微量金属及其它
由于复合培养基都有不少微量金属离子存在，故一般就不再需添加，在合成培养基上需要加入一定量微量金属，否则就影响菌体生长。在发酵100小时后加入，由于它能抵销F2+之阻碍甘露糖链霉素转化为链霉素的作用，而有利于链霉素的合成，但在100小时前加入则无效。发酵过程中链霉素除合成外还有部分降解，故亦有在发酵液中加入链霉素的吸附剂，如活性炭或离子交换树脂等，甚至链霉素单位可提高50%。
5 次级因子
所谓基本因子是指与菌体生长有关的如上述碳、氮源、微量金属、维生素等，因其为菌体生长与再生所必需的，甚至溶氧，抗菌素合成用之前体(如青霉素G的前体苯乙酸)，都可称为基本因子。
有些因子能影响发酵结果，但其真正作用机理还不够了解，严格说亦不能认为是营养物或前体者，就称这些因子为次级因子。次级因子在微生物代谢过程中能改变其化学或物理参数，或部分地影响发酵结果，而能掌握微生物活性向欲得的产物方向发展。次级因子例如威士忌酒蒸馏残物—酒糟用于新生霉素生产是一种很好的营养物，据说酒糟中含有称为BL3的生长因子。
链霉素发酵合成培养基中加入巴比妥酸衍生物比对照链霉素单位提高4.5倍。而巴比妥不能视为前体，其合成培养基的发酵单位接近复合培养基可以认为巴比妥能改变若干主要代谢过程，推测其在培养基中起若干未知化合物的作用；另一解释认为巴比妥培养基中灰色链霉菌菌丝自溶延缓，由于用于合成链霉素的酶系统在自溶延缓的菌丝中较稳定，亦可视为在巴比妥培养基中提高单位的原因。
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2.4 链霉素发酵条件及中间控制
2.4.1 溶氧的影响及控制
链霉素产生菌一灰色链霉菌是一种高度需氧菌。它在整个代谢过程中以葡萄搪做为主要碳源，只有以氧做为最终电子受体时方能获得大量能量，来满足菌体生长、繁殖和合成链霉素的需要.物质代谢与能量代谢是相辅相成的。据文献记载[19]，空气中，氧在培养液中的饱和浓度(1 a tm, 25℃ })大约只有0.2毫克分子(O2)/升，而链霉素发酵液中菌体的摄氧率在10~50毫克分子(O2)/升小时。因此向发酵液中迅速地补充溶解氧.是链霉素发酵中的重要问题[11] 。
对溶氧水平有较大影响的因素主要有：
a、菌体代谢是否旺盛。
b、培养液的粘度：过高的粘度会影响氧的传递，即影响氧由气相溶解于液相之中。
c、补料：补糖后糖代谢加快，补入10秒钟后溶氧即明显下降，但经30~40分钟后又逐渐恢复到补前水平。这种变化当补糖量超过1.0%时较明显。当补无机氮源使氨基氮增加l0mg/100ml以上时，亦有这种变化。
d、罐压：实验证明罐压对溶氧的影响较空气流量对溶氧的影响更为明显。在菌体生长前期，空气流量在一定范围内的增减对溶氧几乎没有什么影响，而罐压变化则溶氧变化明显。在培养前期，一般罐压每升高或降低0.lkg/cm2溶氧浓度就升高或降低4%左右；在培养中、后期，罐压每升高或降低0.lkg/cm2溶氧浓度就升高或降低3%左右。但罐压不能控
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制过高，超过一定限度对菌体的生长、代谢就要产生不良影响。
e、空气流量：体积氧传递系数中Vs为空气在罐中的直线速率，它与空气流量是等效的。从提高KLa的角度看，应尽量增大Vs,但超过一定限度后溶氧浓度不再上升，反而会造成泡沫上升，发酵中间产物未及被利用即被带出而造成不良后果，甚至使搅拌器周围充满气泡从而使搅拌失去作用，造成溶氧下降。从价值工程原理出发，应确定一个最适空气流量vs}，即不使通气量过剩，又满足灰色链霉菌对氧的需求。
f、搅拌：搅拌对溶氧浓度影响最大。在培养过程中如停止搅拌、溶氧浓度迅速下降几乎到0，此时如果增加空气流量，增大罐压都无济于事。同时对于不同的搅拌桨形式以及速度对溶氧也会产生很大的影响。机械搅拌能损坏菌丝体，对发酵液过滤不利，采用空气搅拌器则克服了这一缺点，提高了罐的利用率。采用大直径小浆叶的搅拌器，在适当增加转速下，能得较高的吸氧率。另外将涡轮式改为多棒式搅拌器，可降低功率消耗近一半。
2.4.2 温度
灰色链霉菌对温度敏感。据报道，z-38菌株对温度高度敏感：250℃时，发酵单位为1180毫克/升/118小时；27℃时,，2041毫克/升/118小时；29℃时，2194毫克升/104小时，而31 ℃时则为414毫克/升/72小时。故认为链霉素生产适宜培养温度为28.5℃左右。有些人认为不一定在24~31℃的范围，应随菌株不同而适宜温度有所改变。
2.4.3 pH值
pH值直接影响到发酵过程中各种酶活动，影响菌体对基质代谢的速度，甚至改变菌体的代谢途径及细胞结构。菌体的发育生长和抗生素的合成有不同的适宜pH值。发酵过程
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中pH值必须予以控制，才能符合菌体生长和抗生素合成的需要。影响pH值的因素有生化反应过程特性，以及发酵过程的环境变量，如温度。另外，作为发酵过程氮源的(NH4)2S04和碳源的糖等补料加到发酵液中也会影响pH值。
适合链霉菌菌丝生长的pH约为6.5~7.0，适合于链霉素合成的pH约为6.8~7.3，pH低于6.0或高于7.5，对链霉素的生物合成不利。pH对链霉素发酵影响很大，故很多国家为了准确控制pH值，使用pH自动控制装置。这样，可提高发酵单位，又可以减少培养基中碳酸钙的用量，在发酵液预处理时，还可减少中和用的酸量[12]。
2.4.4 泡沫与消沫
链霉素发酵过程产生大量泡沫，尤其在发酵前期，由于菌丝生长处于对数生长期，代谢旺盛，在通气和连续搅拌条件下产生大量泡沫，如不及时进行消沫控制，就产生逃液等现象，发酵不易正常进行。故一般都需加一定量之消沫剂进行消沫。 消沫剂分油脂类、脂肪酸类、脂肪酸酷类、醇类、醚类、磷酸酷类、胺类、酞胺类、金属碱类、硅酮类等，抗菌素生产中可应用硅酮、聚氧乙烯和聚氧丙烯的共聚物，其中硅酮对微生物影响小，是一种较好的消沫剂
国内已成功地使用了聚氧乙烯聚氧丙烯甘油醚和聚氧丙烯甘油醚作为消沫剂，随着表面活性剂化学的发展，合成聚醚消沫剂已向末端用疏水基封链发展，使形成两端是疏水链，中间是亲水链的嵌段聚合物，从而增强表面活性，提高消沫能力[13]。
2.4.5 中间补料优的化控制[14]
补料决定了发酵液中的各种营养物质即基质的浓度。而基质是发酵过程中菌体生长及
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抗生素合成的能量和物质基础。发酵过程可粗略分为菌体生长期和抗生素分泌期。其中抗生素分泌期产生的抗生素占总量的70~80%左右。缩短菌体生长期，延长抗生素分泌期并保持抗生素生产的最大增长率是提高抗生素产量的关键。一方面补料应保证发酵过程中菌体对能量和物质的需要；另一方面若补料量过多则会导致基质浓度过高。菌体生长期基质浓度过高会导致菌种浓度过高，引起整个细胞群体的退化和产率降低，不利于生产；在抗生素分泌期基质浓度过高则会导致代谢向合成菌体的方向发展，减少产量，也不利于生产。因此，不仅需要按照产生菌的生理特性选择合适的发酵培养基，且必须根据发酵过程中的代谢变化对培养基进行控制，使菌体生长迅速又不易衰老且能保持最大的抗生素生产能力。简言之，就是根据发酵时间，基质浓度，菌体浓度，尾气含量，溶解氧浓度等变量来确定最优补料量，优化目标为发酵终止时抗生素产量最高。
链霉素发酵采用中间补碳、氮源、通常补加葡萄糖、硫酸铵和氨水，这样还能调节发酵的pH值。根据耗糖速度，确定补糖次数和补糖量。发酵各阶段的最适糖浓度，系根据菌种的特性确定的。放罐残糖浓度最好低于1%，以解除葡萄糖对甘露糖的分解阻遏作用，提高链霉素产量。
2.5 提取及精制
对于链霉素的提取，早期利用活性炭吸附的方法。随着科学技术的不断发展和提高，也采用过加带溶剂的溶媒萃取法，或直接从发酵液中以难溶的盐类的沉淀法，但这些方法用于工业工业生产存在一定的困难。目前主要采用离子交换法以及膜技术的应用如中空纤维膜、超滤、微滤、反渗透等方法。虽然有些技术仍处于试验阶段，但其发展前景是乐观的。
2.5.1 发酵液的过滤及预处理
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发酵终了时，链霉菌所产生链霉素，有一部分是菌丝体相结合的。用酸、碱或盐做短时间处理后，与菌丝体相结合的大部分链霉素就能释放出来，工业上，常才用草酸或磷酸等酸化剂处理，以草酸效果较好，可用草酸将发酵液酸化至pH3左右，直接蒸汽加热70~75℃，维持2min，迅速冷却，过滤或离心分离。过滤后，所得酸液也可进行碱处理，进一步除去蛋白质，或者直接用NaOH调节至pH至6.7~7.2。
原液质量标准一般是：外观澄明；pH6.7~7.2；温度在10℃以下；高价离子含量少；链霉素浓度为5000 u/ml左右。
原液中高价离子对离子吸附影响很大，因此必须在发酵预处理是将这些离子除去。草酸能将Ca2+除去。一些络合剂如三聚磷酸钠能和Mg2+形成络合物，减少树脂对Mg2+的吸附。
2.5.2 提取和精制
链霉素早期的提取方法采用活性炭吸附法、带溶法、沉淀法、离子交换法。目前国内外多采用离子交换法提取链霉素[20]。
链霉素在发酵液中，是三价的阳离子，可以用阳离子交换树脂吸附。实验表明，磺基树脂虽能吸附链霉素，但二者亲和力太强，不宜用酸洗脱下来。缩醛树脂吸附链霉素后，用酸很容易洗下来。因此工业曾用缩醛树脂提取链霉素。国外采用一种大网格缩醛阳离子树脂来提取链霉素。袁直等[15]利用HYY弱碱树脂对链霉素的分离纯化进行了实脸，针对树脂的吸附和脱附性能进行研究，吸附全达28万/ml树脂，脱附率达96%。
对于离子交换树脂法提取链霉素，其吸附方式有正吸附和反吸附。这两种方式在实际
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应用中各有其优缺点。为了防止链霉素的损失，一般采用三罐或四罐串联吸附。依原液流向分为主、副、次等交换罐，应使最后一罐流出液中的单位小于100 u/ml，当主罐流出液的链霉素浓度达到进口浓度的95%左右。当达到饱和时，可以进行解吸，将副罐升为主罐，依此类推。最后补上新罐继续吸附。一般解吸速度为吸附流速的1/10,解吸中出现链霉素单位时，就串入脱色树脂罐和中和树脂罐。开始出现的低单位液可并入原液重新吸附，与出口液达一定浓度时，可作为高单位开始收集。
由于链霉素发酵液中绝大部分是菌丝体和未用完的培养基，以及各种各样的代谢产物，链霉素浓度远较各种杂质的低， 仅为5000单位/毫升左右。大量蛋白、多肽和高价离子的存在对离子交换吸附影响很大。在离子交换处理前，一般采用蒸汽加热（70～75℃）方法使蛋白质凝固变 性。添加磷酸或一些络合剂如三聚磷酸等使高价离子草酸、磷酸生成不溶性沉淀物，然后通过板框过滤或离心分离将这些沉淀物除去。这一预处理将导致10％ 以上的链霉素所添加的草酸、磷酸或络合剂，既增加了链霉素提炼成本，又会降低产品 纯度、污染环境。同时所得的发酵滤液中仍存在许多蛋白、多肽和其它各种杂质，将会减少树脂的吸附容量或污染树脂，造成树脂的沉降和堵塞，进而缩短树脂的寿命，增加抗生素提炼的成本。此外采用离子交换法提炼链霉素，总收率不高，只达72％。同时需大量解吸液。解 吸液中链霉素浓度低，各种杂质如色素、金属离子等含量较高，造成下游工艺处理困难 ，产品纯度不高。
目前膜法工艺取代链霉素生产中的薄膜蒸发工艺，使这一问题得到了很好的解决。例如Ultra－flo 超滤技术实质是把传统工艺中剔除蛋白(絮凝沉淀)、菌丝分离（板框压滤/鼓式真空过滤），去除乳化(破乳剂的使用)等多种传统的提炼与纯化工艺用Ultra－flo 超滤技术加以替代，既减少了设备的投资，及原辅材料(如助滤剂、絮凝剂、破乳剂等) 的消耗，还大大提高了链霉素预处理的收率，使得传统意义上板框压滤/鼓式真空过滤 工艺中10～15％的链霉素损失下降到1％的水平。有如某药厂利用中空纤维微孔滤膜(PVDF)[16]进行了
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链霉素发酵液除菌试验,发酵液湿菌体含量为百分之十几发酵液效价为4000～6000μg/ml,膜对菌体可100%截留,过滤液澄清,黏度低,杂质少,对硫酸链霉素发酵液可取代离心工艺,对离心机不能过滤而采用板框过滤的春蕾链霉素,均能得到更好的过滤效果,这对后续工艺的精制和最终产品质量的提高都显示出了极大的优越性。
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