细菌总DNA提取方法

细菌总DNA提取方法

100412

溶液制备：

母液：1）1.0M Tris-HCl, 称取60.57g Tris（Tris Amino），溶于500ml ddH2O中，用HCl调整pH8.0；

2）0.5M EDTA，称取37.32g EDTA-Na，溶于100ml ddH2O中，用NaOH调整pH8.0。

STE buffer（pH8.0）：

100mM NaCl，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0；高压灭菌，4℃保存。

TE buffer(pH8.0)：10mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)。

取5ml 1mol/L Tris-HCl母液，1ml 0.5mol/L EDTA母液，置于400ml的ddH2O中，然后定容到500ml，高压灭菌后，4℃保存备用；

实验步骤：

1、 取1ml 液体培养的菌体（Gram-negative or Gram-positive bacteria），离心 8000 rmp 2min；

（肺炎克雷伯氏杆菌需离心13000rmp 10min，以沉淀细胞）

2、 弃上清，用400ul STE buffer 清洗两次，每次离心 8000 rmp 2min

（肺炎克雷伯氏杆菌需离心13000rmp 10min，以沉淀细胞）

3、 弃上清，加入200ul TE buffer悬浮沉淀；

4、 加入100ul Tris饱和酚（Tris-saturated phenol，pH8.0）; 振荡器振荡60-120S，以裂解细胞；

注：M. MB200振荡120S, E.coli 振荡60S.

5、 4℃，离心13000rmp 5min，以将水相（aqueous phase）从有机相（orangic phase）中分离出来；

6、 取160ul上层水相，转移至另一个1.5ml Ep管中；

7、 加入40ul TE buffer，以达到200ul体积，再与100ul 氯仿（chloroform）混合，可用1ml 移液抢吹打；

8、 4℃，离心13000rmp 5min；

9、用氯仿抽提裂解液，直到白色的界面（white interface）消失，重复2-3次；

10、将160ul上层水相移入一干净的1.5ml的Ep管中；

11、加入40ulTE buffer，5ul RNase（10mg/ml），37℃保温10min；

12、加入100ul氯仿，混匀，4℃，离心13000rmp 5min；

13、将150ul上清水相移入另一个1.5mlEp管中，-20℃保存。

Refences：

Hai-Rong Cheng, Ning Jiang, Extremly rapid extraction of DNA from bacteria and yeasts, Biotechnology Letter , 2006, Vol.28, p55-59;

Wen-ping Chen and Tsong-teh Kuo，A simple and rapid method for the preparation of gramnegative bacterial genomic DNA；Nucleic Acids Research, 1993, Vol. 21（9）, p2260;