(12)发明专利申请
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 104666345 A (43)申请公布日(43)申请公布日 2015.06.03
(21)申请号 201510115484.9(22)申请日 2015.03.17
(71)申请人毛泽春
地址518000 广东省深圳市南山区深云村三
栋30D申请人关丽云(72)发明人毛泽春 关丽云
(74)专利代理机构深圳市中知专利商标代理有
限公司 44101
代理人孙皓(51)Int.Cl.
A61K 31/409(2006.01)
A61K 35/413(2015.01)A61K 38/36(2006.01)A61K 38/00(2006.01)A61K 31/575(2006.01)
(54)发明名称
快速培育牛黄的方法(57)摘要
一种成本低、制备周期短、性能稳定且副作用小的快速培育牛黄的方法。包括获取天然牛胆汁的步骤，还包括以下步骤：1)制备含纤维蛋白原和其它凝血因子的基本原液；2)配制含脱氧胆酸、胆酸、胆红素钙、胆固醇、磷脂、氯化钙的混合物备用；3)配制含牛磺酸和微量FeSO4、MgSO4和ZnSO4的混合液备用4)取新鲜牛胆汁备用；5)按设定流程制备牛胆结石沉淀物；6)之后，经分离、整形、干燥获得牛胆结石。本发明1)生产周期短。2)安全副作用小。3)游离胆红素浓度更易受到控制。4)生成的牛胆结石完整、有效的成分和生物活性更好。其从制备原理、反应条件和过程属于一种新的方法，生成的牛黄与天然牛黄相比质量更稳定。
权利要求书3页 说明书9页 附图3页
C N 1 0 4 6 6 6 3 4 5 A CN 104666345 A
权 利 要 求 书
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1.一种快速培育牛黄的方法，包括获取天然牛胆汁的步骤，其特征在于，还包括以下步骤：
1)制备含纤维蛋白原和其它凝血因子的基本原液；2)依据药用要求，按重量百分比配制如下混合物备用：
3)依据药用要求，配制如下混合液备用：牛磺酸：2－10％；按需加入微量FeSO4、MgSO4和ZnSO4；
4)按常规方法取得与所述混合物用量成比例的新鲜牛胆汁备用；5)按以下四种流程中的任意一种流程制备牛胆结石沉淀物：流程一：
a.将备用的基本原液、新鲜牛胆汁和混合物加入反应器皿中；b.再将缓冲液加入所述反应器皿中，调节pH至7.3±0.3；c.然后向所述反应器皿中加入凝血酶，所述凝血酶与纤维蛋白原的比例为0.05－10IU/mg；
d.采用水浴或气浴对反应器皿进行升温，在30±10℃的环境中温育，温育期间，持续混匀时间不低于10秒钟；
流程二：
a.将按凝血酶与所述基本原液中的纤维蛋白原的比值为0.05－10IU/mg的比例获取的凝血酶、所述备用的新鲜牛胆汁和混合物加入反应器皿中；
b.将缓冲液加入所述反应器皿中，调节pH至7.3±0.3；c.再将备用的基本原液加入所述的反应器皿中；d.采用水浴或气浴对反应器皿进行升温，在30±10℃的环境中温育，温育期间，持续混匀时间不低于10秒钟；
流程三：
a.将所述备用的基本原液和混合物加入反应器皿中；b.将缓冲液加入所述反应器皿中，调节pH至7.3±0.3；
c.再按凝血酶与所述基本原液中的纤维蛋白原的比值为0.05－10IU/mg的比例向所述反应器皿中加入凝血酶；
d.再将备用的新鲜牛胆汁加入该反应器皿中；
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权 利 要 求 书
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e.最后，采用水浴或气浴对反应器皿进行升温，在30±10℃的环境中温育，温育期间，持续混匀时间不低于10秒钟；
流程四：
a.按凝血酶与所述基本原液中的纤维蛋白原的比值为0.05－10IU/mg的比例获取的凝血酶和所述备用的混合物加入反应器皿中；
b.将缓冲液加入所述反应器皿中，调节pH至7.3±0.3；c.再将备用的基本原液加入所述的反应器皿中；d.再将备用的新鲜牛胆汁加入该反应器皿中；e.采用水浴或气浴对反应器皿进行升温，在30±10℃的环境中温育，温育期间，持续混匀时间不低于10秒钟；
6)将获得的牛胆结石沉淀物分离之后去掉上清液，再加入备用的混合液，静置；7)之后，再对上述牛胆结石沉淀物偏心旋转形成球状牛胆结石沉淀物；8)球状牛胆结石沉淀物的整形；
9)冷冻后低温真空干燥形成牛胆结石。
2.根据权利要求1所述的快速培育牛黄的方法，其特征在于：所述基本原液按以下方法获取：
1)在动物全血中加入抗凝剂；
2)从含有抗凝剂的动物全血中分离出动物血浆；3)将动物血浆置于0℃以下保存；
4)将冷冻后的动物血浆置于0－10℃的环境中解冻；
5)从解冻后的血浆中分离出含有纤维蛋白原和其它凝血因子的血浆解冻沉淀物。3.根据权利要求2所述的快速培育牛黄的方法，其特征在于：所述血浆解冻沉淀物按以下步骤获取：
1)取浓度为3.2％的柠檬酸钠作为抗凝剂，抗凝剂与动物血液的体积比值为1：9；2)以1500g的离心力，离心15－20分钟制成血浆；
3)将上述血浆置于－5℃以下冷冻不少于30分钟的时间，再置于0－10℃解冻；4)再以1000g的离心力对解冻的血浆进行离心分离出血浆解冻沉淀物；5)用双蒸馏水或生理盐水调节纤维蛋白原的浓度至0.01－0.02％即可。4.根据权利要求1所述的快速培育牛黄的方法，其特征在于：所述凝血酶为牛凝血酶。5.根据权利要求1所述的快速培育牛黄的方法，其特征在于：所述动物血浆是牛血浆。6.根据权利要求1所述的快速培育牛黄的方法，其特征在于：所述球状牛胆结石沉淀物的整形是在整形机中，以转速300－500转/分钟，温度在18－26℃的条件下整形15－30分钟。
7.根据权利要求1所述的快速培育牛黄的方法，其特征在于：将制备好的球状沉淀物放入低温冷冻箱中，－5℃至－10℃冷冻20分钟，之后转入真空干燥箱中，抽真空到0.085Mpa，干燥24小时。
8.根据权利要求1－7中任一项所述的快速培育牛黄的方法，其特征在于：所述温育温度为37±3℃。
9.根据权利要求1所述的快速培育牛黄的方法，其特征在于：所述将缓冲液加入反应
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权 利 要 求 书
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器皿中调节pH值为7.30±0.05。
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说 明 书快速培育牛黄的方法
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技术领域
本发明涉及一种名贵中药原料的制备方法，特别涉及一种天然牛黄的体外替代品－培育牛黄的制备方法。
[0001]
背景技术
天然牛黄是干燥的牛色素性胆结石。自古以来，天然牛黄就是一种名贵的中药材
和原料药。其有清热解毒、凉肝息风和清心开窍之效。主用于治疗高热神昏、癫痫抽搐、中风迷痰、口舌生疮等症。其既可直接施用于患者，也能以之为原料，使用于超过600种的中成药。其中最重要的包括安宫牛黄丸，安神丸，片仔癀等名贵药品。但是天然牛黄因其稀缺性和品质不一致性，在使用范围上受到严重限制。另外，加上国家政策对天然牛黄进口的限制，天然牛黄数量严重供不应求，价格节节攀升。目前，天然牛黄价格已超过等量黄金。寻找体外形成牛黄的方法已成为医学工作者长期的工作目标。[0003] 天然牛黄的体外替代品包括如下的人工牛黄、培植牛黄和培育牛黄：[0004] 1)人工牛黄是价格最低廉的牛黄替代品。其制作方法是把牛黄中的部分成分(胆酸，脱氧胆酸，少量胆红素)和淀粉混合而成。无论其成分、含量、理化性质和医学效果都与天然牛黄相去甚远，因而其使用受到严格限制。根据国家中药局相关规定，人工牛黄严禁使用于各类急救药物。
[0005] 2)培植牛黄是我国医学工作者根据胆结石形成的机制，改造活牛胆囊的解剖结构，人工植入能加速促成胆结石的细菌和其他成分，形成有利于胆结石形成的微观条件，从而诱导生成胆结石。该方法的不足之处在于生成周期长达2-3年，产石率低，产品质量不一致，且需杀牛取石。因此，培植牛黄无法规模化生产而不具备经济可行性。此外，该法也因长期使用活体动物而受到动物保护人士的非议。[0006] 3)培育牛黄是世界上唯一经济上可行，技术上成熟的制造牛黄的方法。如：申请号为：201110430982.4，名称为：“一种制备牛胆结石的方法”的发明专利，其公开了如下技术方案(流程如图1所示)：
[0007] “一种制备牛胆结石的方法，其特征在于，包括如下步骤：[0008] 一、制备发酵牛胆汁
[0009] (1)调节天然牛胆汁中的牛磺酸含量至3－7％(g/ml)；[0010] (2)牛胆汁入罐后利用蒸汽进行灭菌处理，然后按每10000ml牛胆汁接种100－500ml菌液的比例，将大肠杆菌、变形杆菌或肠球菌的单一菌液或其组合菌液接种到牛胆汁中，进行发酵处理；
[0011] (3)发酵完成后利用蒸汽对发酵液进行灭活处理；[0012] 二、利用发酵牛胆汁制备复合胆红素钙
[0002]
(1)取1000－4000ml纯化水加入20－40g氧化钙，搅拌，即得饱和氧化钙溶液；[0014] (2)取出定量的发酵牛胆汁，每1000ml加入1000－4000ml饱和氧化钙溶液以及5－15g焦亚硫酸钠，对其进行搅拌、加热至沸腾，滤取棕红色沉淀物；
[0013]
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说 明 书
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(3)在棕红色沉淀物中，加入适量的水进行搅拌、洗涤，静置后滤去上清液，以除去水溶性杂质，再向沉淀中加入总重量35－55％的胆红素、5－15％的胆酸、2.5－7.5％的去氧胆酸、0.3－0.6％的硫酸锌、0.3－0.6％的硫酸镁后，搅拌混匀；[0016] (4)冷冻后低温真空干燥；[0017] 三、在15℃－37℃条件下，利用发酵牛胆汁和复合胆红素钙在牛体外培育牛胆结石
[0018] (1)制备成石胆汁[0019] 在15－37℃下，每千克干燥的复合胆红素钙中添加500－1500ml发酵牛胆汁、0.4g－1.2g焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠或硫代硫酸钠的单一组份或其混合物作为抗氧剂，再按发酵牛胆汁：纯化水＝(1－3)：1的体积比例加入适量的纯化水，充分搅拌后，静置，制成成石胆汁；
[0020] (2)培育牛胆结石
[0021] 对成石胆汁用酸液进行pH调节，使其pH值在6.8以下，然后对成石胆汁进行偏心定向旋转，待其类球形结石形成后，停止旋转，静置培育，取出结石；[0022] (3)牛胆结石的整形
[0023] (4)牛胆结石的低温真空干燥”。
[0024] 按照该技术方案制备的产品的理化结构、成分、含量和药效均与天然牛黄一致，完全满足最新版《中国药典》的要求。国家中药局授予其可完全等量于天然牛黄使用的资质。[0025] 但是，该技术方案仍存有如下不足：[0026] 1)生产周期长。通常，该技术从胆汁发酵到成品出炉需要7天左右。
[0027] 2)在制备过程中所加入的发酵菌(例如大肠杆菌)会不可避免地消耗掉新鲜牛胆汁中一些有益药效的成分，产生作用不明的物质，所产生的不明物质包括细菌毒素、致敏物质和发热源。
[0028] 3)细菌(即上述大肠杆菌)的引入是潜在的生物危险因素。[0029] 4)在制备过程中所加入的复合胆红素钙是一种弱酸强碱盐，在pH＜6.8的条件下，很容易与H+反应生成游离胆红素，过高的游离胆红素被空气中的O2氧化生成胆绿素，其在牛黄中的含量需严格控制，若其浓度过高则会对人体产生不良作用，如对机体细胞产生毒性作用。发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种成本低、制备周期短、性能稳定且副作用小
的快速培育牛黄的方法。
[0031] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：[0032] 本发明的快速培育牛黄的方法，包括获取天然牛胆汁的步骤，还包括以下步骤：[0033] 1)制备含纤维蛋白原和其它凝血因子的基本原液；[0034] 2)依据药用要求，按重量百分比配制如下混合物备用：
[0030] [0035]
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3)依据药用要求，配制如下混合液备用：[0037] 牛磺酸：2－10％；[0038] 按需加入微量FeSO4、MgSO4和ZnSO4；
[0039] 4)按常规方法取得与所述混合物用量成比例的新鲜牛胆汁备用；[0040] 5)按以下四种流程中的任意一种流程制备牛胆结石沉淀物：[0041] 流程一：
[0042] a.将备用的基本原液、新鲜牛胆汁和混合物加入反应器皿中；[0043] b.再将缓冲液加入所述反应器皿中，调节pH至7.3±0.3；[0044] c.然后向所述反应器皿中加入凝血酶，所述凝血酶与纤维蛋白原的比例为0.05－10IU/mg；
[0045] d.采用水浴或气浴对反应器皿进行升温，在30±10℃的环境中温育，温育期间，持续混匀时间不低于10秒钟；[0046] 流程二：
[0047] a.将按凝血酶与所述基本原液中的纤维蛋白原的比值为0.05－10IU/mg的比例获取的凝血酶、所述备用的新鲜牛胆汁和混合物加入反应器皿中；[0048] b.将缓冲液加入所述反应器皿中，调节pH至7.3±0.3；[0049] c.再将备用的基本原液加入所述的反应器皿中；[0050] d.采用水浴或气浴对反应器皿进行升温，在30±10℃的环境中温育，温育期间，持续混匀时间不低于10秒钟；
[0036]
流程三：
[0052] a.将所述备用的基本原液和混合物加入反应器皿中；[0053] b.将缓冲液加入所述反应器皿中，调节pH至7.3±0.3；
[0054] c.再按凝血酶与所述基本原液中的纤维蛋白原的比值为0.05－10IU/mg的比例向所述反应器皿中加入凝血酶；
[0055] d.再将备用的新鲜牛胆汁加入该反应器皿中；[0056] e.最后，采用水浴或气浴对反应器皿进行升温，在30±10℃的环境中温育，温育期间，持续混匀时间不低于10秒钟；[0057] 流程四：
[0058] a.按凝血酶与所述基本原液中的纤维蛋白原的比值为0.05－10IU/mg的比例获
[0051]
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取的凝血酶和所述备用的混合物加入反应器皿中；[0059] b.将缓冲液加入所述反应器皿中，调节pH至7.3±0.3；[0060] c.再将备用的基本原液加入所述的反应器皿中；[0061] d.再将备用的新鲜牛胆汁加入该反应器皿中；[0062] e.采用水浴或气浴对反应器皿进行升温，在30±10℃的环境中温育，温育期间，持续混匀时间不低于10秒钟；
[0063] 6)将获得的牛胆结石沉淀物分离之后去掉上清液，再加入备用的混合液，静置；[0064] 7)之后，再对上述牛胆结石沉淀物偏心旋转形成球状牛胆结石沉淀物；[0065] 8)球状牛胆结石沉淀物的整形；
[0066] 9)冷冻后低温真空干燥形成牛胆结石。[0067] 所述基本原液按以下方法获取：[0068] 1)在动物全血中加入抗凝剂；
[0069] 2)从含有抗凝剂的动物全血中分离出动物血浆；[0070] 3)将动物血浆置于0℃以下保存；
[0071] 4)将冷冻后的动物血浆置于0－10℃的环境中解冻；
[0072] 5)从解冻后的血浆中分离出含有纤维蛋白原和其它凝血因子的血浆解冻沉淀物。[0073] 所述血浆解冻沉淀物按以下步骤获取：
[0074] 1)取浓度为3.2％的柠檬酸钠作为抗凝剂，抗凝剂与动物血液的体积比值为1：9；
[0075] 2)以1500g的离心力，离心15－20分钟制成血浆；
[0076] 3)将上述血浆置于－5℃以下冷冻不少于30分钟的时间，再置于0－10℃解冻；[0077] 4)再以1000g的离心力对解冻的血浆进行离心分离出血浆解冻沉淀物；[0078] 5)用双蒸馏水或生理盐水调节纤维蛋白原的浓度至0.01－0.02％即可。[0079] 所述凝血酶为牛凝血酶。[0080] 所述动物血浆是牛血浆。
[0081] 所述球状牛胆结石沉淀物的整形是在整形机中，以转速300－500转/分钟，温度在18－26℃的条件下整形15－30分钟。
[0082] 将制备好的球状沉淀物放入低温冷冻箱中，－5℃至－10℃冷冻20分钟，之后转入真空干燥箱中，抽真空到0.085Mpa，干燥24小时。[0083] 所述温育温度为37±3℃。
[0084] 所述将缓冲液加入反应器皿中调节pH值为7.30±0.05。[0085] 与现有技术相比，采用本发明的方法培育牛黄具有以下优势：[0086] 1)生产周期短。一个制备周期仅需8－24小时即可完成，比现有技术提高效率达7倍以上。
[0087] 2)安全副作用小。在整个制备过程中，本发明无需使用类似现有技术中的大肠杆菌或变形杆菌；也没有如现有技术中起杀菌作用的后续的高温过程。从而也避免了因高温杀菌产生的危险。
3)由于本发明中的方法是在pH≥7.0的情况下进行的，其中的胆红素钙不会转化
为游离胆红素。因此，游离胆红素浓度更易受到控制。
[0088]
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4)因其无须进行细菌发酵和高温蒸汽灭活处理，使其具有更加完整、有效的成分和生物活性。
[0090] 本发明从制备原理、反应条件和反应过程都与培育牛黄不同，其产品质量与培育牛黄相似，而与天然牛黄相比则有质量稳定的优势。附图说明
图1为现有技术中培育牛黄的方法流程图。[0092] 图2为本发明的培育牛黄的流程图之一。[0093] 图3为本发明的培育牛黄的流程图之二。
[0091]
具体实施方式
[0094] 本发明的快速培育牛黄的方法，包括以下步骤：[0095] 1)制备含纤维蛋白原和其它凝血因子的基本原液；[0096] 2)依据药用要求，按重量百分比配制如下混合物备用：
[0097]
3)依据药用要求，配制如下混合液备用：[0099] 牛磺酸：2－10％；[0100] 按需加入微量FeSO4、MgSO4和ZnSO4；[0101] 4)取新鲜牛胆汁备用。
[0102] 5)按以下四种流程中的任意一种流程制备牛胆结石沉淀物：[0103] 流程一：
[0104] a.将备用的基本原液、新鲜牛胆汁和混合物加入反应器皿中，其中，混合物与新鲜牛胆汁配比为1000g：(1000－5000ml)；混合物与基本原液中的纤维蛋白原的配比为1000g：(1－10g)；
[0105] b.将缓冲液(优选PBS缓冲液，下同)加入所述反应器皿中，调节pH至7.3±0.3(注：PBS，全称Phosphate Buffered Saline。在医学词汇中表示磷酸盐缓冲液，用于分子克隆及细胞培养，pH＝7.4，与人体血液等值，主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠以及氯化钾)；
[0106] c.再按所述凝血酶与纤维蛋白原的比值为0.05－10IU/mg的比例向所述的反应
[0098]
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器皿中加入该凝血酶(所述凝血酶优选牛凝血酶)；
[0107] d.采用水浴或气浴对所述反应器皿中的物质进行升温，在30±10℃的环境中温育，温育期间，持续混匀时间不低于10秒钟，混匀采用颠倒或水平摇晃方式，生成牛胆结石沉淀物，之后将备用的混合液加入该反应器皿中；[0108] 流程二：
[0109] a.将按所述凝血酶与纤维蛋白原的比值为0.05－10IU/mg的比例获取的凝血酶、所述备用的新鲜牛胆汁和混合物加入反应器皿中，其中，新鲜牛胆汁与混合物配比同流程一；
[0110] b.将缓冲液加入所述反应器皿中，调节pH至7.3±0.3；[0111] c.再将备用的基本原液加入所述的反应器皿中，其中，基本原液中的纤维蛋白原与混合物配比同流程一；
[0112] d.采用水浴或气浴对所述反应器皿中的物质进行升温，在30±10℃的环境中温育，温育期间，持续混匀时间不低于10秒钟，混匀采用颠倒或水平摇晃方式，生成牛胆结石沉淀物，之后将备用的混合液加入该反应器皿中；[0113] 流程三：
[0114] a.将备用的基本原液和混合物加入反应器皿中，其中，基本原液中的纤维蛋白原与混合物配比同流程一；
[0115] b.将缓冲液加入所述反应器皿中，调节pH至7.3±0.3；
[0116] c.再按所述凝血酶与纤维蛋白原的比值为0.05－10IU/mg的比例向所述的反应器皿中加入该凝血酶；
[0117] d.再将备用的新鲜牛胆汁加入该反应器皿中，其中，新鲜牛胆汁与混合物配比同流程一；
[0118] e.采用水浴或气浴对所述反应器皿中的物质进行升温，在30±10℃的环境中温育，温育期间，持续混匀时间不低于10秒钟，混匀采用颠倒或水平摇晃方式，生成牛胆结石沉淀物，之后将备用的混合液加入该反应器皿中；[0119] 流程四：
[0120] a.将按所述凝血酶与纤维蛋白原的比值为0.05－10IU/mg的比例获取的凝血酶和所述备用的混合物加入反应器皿中，其中，纤维蛋白原与混合物配比同流程一；[0121] b.将缓冲液加入所述反应器皿中，调节pH至7.3±0.3；[0122] c.再将备用的基本原液加入所述的反应器皿中；[0123] d.再将备用的新鲜牛胆汁加入该反应器皿中，其中，新鲜牛胆汁与混合物配比同流程一；
[0124] e.采用水浴或气浴对所述反应器皿中的物质进行升温，在30±10℃的环境中温育，温育期间，持续混匀时间不低于10秒钟，混匀采用颠倒或水平摇晃方式，生成牛胆结石沉淀物，之后将备用的混合液加入该反应器皿中；
[0125] 6)对生成的牛胆结石沉淀物偏心旋转形成球状牛胆结石沉淀物；
7)球状牛胆结石沉淀物的整形：
[0127] 将球状牛胆结石沉淀物置于整形机中，以转速300－500转/分钟，温度在18－26℃的条件下整形15－30分钟形成含有一定水分的牛胆结石。
[0126]
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8)冷冻后低温真空干燥形成牛胆结石(即牛黄)。[0129] 将整形好的牛胆结石放入低温冷冻箱中，－5℃至－10℃冷冻20分钟，之后转入真空干燥箱中，抽真空到0.085Mpa，干燥24小时。[0130] 本发明的进一步改进是：所述基本原液按以下方法获取：[0131] 1)在动物全血中加入抗凝剂；
[0132] 2)从含有抗凝剂的动物全血中分离出动物血浆；[0133] 3)将动物血浆置于0℃以下保存；
[0134] 4)将冷冻后的动物血浆置于0－10℃的环境中解冻；
[0135] 5)从解冻后的血浆中分离出含有纤维蛋白原和其它凝血因子的血浆解冻沉淀物。[0136] 本发明优选动物血浆为牛血浆。
[0137] 本发明的所述的血浆解冻沉淀物按以下优选步骤获取：[0138] 1)取浓度为3.2％的柠檬酸钠作为抗凝剂，抗凝剂与动物血液的体积比值为1：9；
[0139] 2)以1500g的离心力，离心15－20分钟制成血浆；
[0140] 3)将上述血浆置于－5℃以下冷冻不少于30分钟的时间，再置于0－10℃解冻；[0141] 4)再以1000g的离心力对解冻的血浆进行离心分离出血浆解冻沉淀物；[0142] 5)用双蒸馏水或生理盐水调节纤维蛋白原的浓度至0.01－0.02％即可。[0143] 本发明的原理是：
[0144] 基本原液或者所述的血浆解冻沉淀物，其主要成分为纤维蛋白原和其它凝血因子。纤维蛋白原在30±10℃，pH7.3±0.3条件下，被凝血酶催化，在钙离子其他凝血因子存在条件下，形成具有网状结构的凝胶物质——交联纤维蛋白。胆红素钙，胆酸，脱氧胆酸等牛黄主要成分物质能在胆汁中与该凝胶物质相互吸引，缠绕，包裹，并以胆汁和凝胶为基质，发生机制复杂的生物矿化作用，形成不溶于胆汁和水的结石样物质，将该结石样物质偏心旋转、整形、低温真空干燥即可获得牛胆结石。[0145] 实施例1(如图2所示)：[0146] 步骤1：以无菌操作技术获取新鲜牛胆汁1000ml置于无菌罐中；在盛有1000ml蒸馏水的其它无菌器皿中加入以下物质配制混合液备用：
[0147]
[0148] [0149] [0150] [0151] [0152] 步骤2：按以下方法获取血浆解冻沉淀物备用：
1)取浓度为3.2％的柠檬酸钠溶液100毫升放入新鲜牛血900毫升，混匀；2)以1500g的离心力，离心上述抗凝全血15－20分钟制成血浆；3)将上述血浆置于－5℃冷冻，时间＞30分钟，再置于4℃解冻；4)解冻完毕，立即以1000g的离心力对解冻的血浆进行离心，分离出含纤维蛋白
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原的血浆解冻沉淀物；
[0153] 5)检测纤维蛋白原浓度；
[0154] 6)用双蒸馏水调节纤维蛋白原的浓度至0.05％即可。[0155] 步骤3：按以下重量配制混合物备用：
[0156]
步骤4：取预先分离的含0.05％(W/V)牛纤维蛋白原的备用的血浆解冻沉淀物3000ml置于所述无菌罐中。[0158] 步骤5：再向无菌罐中加入500ml 0.1M的PBS和步骤3中备用的混合物，调节pH＝7.3，搅拌形成悬浊液。并在37℃下预温育5分钟。[0159] 步骤6：再向该悬浊液中加入5个国际单位/毫升的牛凝血酶300ml，37℃水浴中颠倒混匀20分钟，生成牛胆结石沉淀物。[0160] 步骤7：以500g的离心力将步骤6中的沉淀物离心，去掉上清液。[0161] 步骤8：将备用的混合液加入步骤7中的沉淀物中，静置5分钟。[0162] 步骤9：然后进行偏心定向旋转，待其形成类球形结石(又称球状牛胆结石沉淀物)后，停止旋转，静置培育，取出结石。[0163] 步骤10：取出结石，放入整形机中，调整转速至300转/分钟，在温度18℃、相对湿度60％的条件下整形15分钟，取出结石。[0164] 步骤11：将整形后的结石放入低温真空干燥箱中，在温度20℃，真空度0.015MPa的条件下干燥30小时。即得牛胆结石成品。[0165] 上述成品呈均一的球形，直径0.5－3cm，表面光滑，呈黄红色至棕黄色。体轻，质松脆，断面有同心层纹。经紫外分光光度计检测胆红素含量，薄层扫描仪检测胆酸含量，符合《中国药典》2010版P162中体外培育牛黄的标准规定。[0166] 实施例2(如图3所示)：
[0167] 本实施例除实施例1中所述步骤1、3中的混合液和混合物配比与实施例1不同以及步骤4、5、6中内容不同外，其余步骤与实施例1相同。[0168] 本实施例中的混合液的配方如下：
[0157] [0169]
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溶于1000毫升蒸馏水或去离子水中备用。[0171] 本实施例中的混合物配方如下：
[0170] [0172]
[0173]
本实施例中的：
[0175] 步骤4：取10个IU/ml的牛凝血酶100ml置于所述无菌罐中。[0176] 步骤5：再向无菌罐中加入500ml 0.03M的PBS和备用的混合物，调节pH＝7.3，搅拌形成悬浊液，37℃下预温育5分钟。[0177] 步骤6：再向该悬浊液中加入预先分离的含0.06％(W/V)牛纤维蛋白原的备用的血浆解冻沉淀物1700ml，37℃水浴中颠倒混匀15分钟，生成牛胆结石沉淀物。[0178] 按照本发明培育的牛黄，其物质理化性质、成分、含量和现有技术中的培育牛黄相似，比天然牛黄稳定。
[0179] 该成品与天然牛黄和培育牛黄一样呈球状或类球状，表面光滑，呈黄棕色。体轻质松，断面有同心纹。气香，味苦而后甘，有清凉感，嚼之易脆，不粘牙。[0180] 显微观察可见絮状，团絮状胆红素钙颗粒，呈网状结构，网孔7-350U。[0181] 化学分析该成品(胆红素，胆酸，去氧胆酸，牛黄酸，胆固醇，磷脂，无机盐，氨基酸，糖蛋白，灰分，水分)成分含量，该产品与天然牛黄和培育牛黄完全一致。[0182] 指纹图谱(胆红素类，胆酸类，氨基酸及肽类)的对比分析表明，该物质与培育牛黄成分一致，比天然牛黄更稳定。
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图1
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图2
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图3
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