土壤中具抗肿瘤活性微生物的筛选与分离

土壤中具抗肿瘤活性微生物的筛选与分离

湖南师范大学生命科学学院2012级基地2班肖蓉

摘要：随着癌症发病率的日益增高，如何快速有效地找到癌症的治疗方法迫在眉睫。通过微生物发酵技术生产抗肿瘤活性物是一种简单易行的方法。土壤中放线菌种类与数量位居第二，在这之中有许多具有抗肿瘤活性的类别仍待被发现，因此，通过在土壤中筛选具有这种特性的菌株具有必要性。

关键词：放线菌 抗肿瘤 鉴定与筛选

目录 （一）土样采集

（二）富集

（三）分离培养

（四）筛选

（五）产物分析

（六）文献引用

（一）土样采集

土壤是环境微生物学研究中最具挑战性的环境,土壤也是各种微生物最集中的地方，在土壤中，微生物总数依次是细菌、放线菌、真菌（霉菌和酵母）、原生动物等。土壤中放线菌的孢子含量多，有利于从中筛选出符合实验研究要求的放线菌种类。但是随着土壤中的养分、通气、酸碱度及其所处的季节和地理条件的不同，微生物的分布也会不同，因此，广泛采集各地的土壤样品进行微生物的筛选，增大了野生菌株新类型的概率，因为地球上微生物种类与数量远不止现如今所发现的这些。偏碱性土壤中放线菌的含量较多，因此试验中应尽量采集偏碱性、干燥的土壤样品。且土壤中略带土腥味时，含有放线菌的孢子数会更多。

采集土壤时，使用干净的铲子、透气的塑料袋，先刮去表层5厘米左右的土，然后进行采样，采集完土样后，在塑料袋上标明采样的地址、采集人以及采集的时间，作为菌种来源的说明，以便更好的对筛选出的菌种生活习性的描述与分析。采样时随机选取五个样本地，20*20平方米的面积，随即采取100-200克的土样。

对土壤的处理： 高有机质土样经过适度微波处理可显著增加土壤放线菌总数、链霉菌数。微波预处理土样对可培养放线菌的种类有明显影响，微波处理新鲜土样对土壤微生物数量有一定影响。不同粒级土壤中放线菌的种类和数量不同。土壤粒径越小，放线菌数量越多。此外，新鲜采集的土样都要经过晾干然后收集到无菌透气的袋子并贴好采集时的标记，保存在阴凉干燥的地方。

（二）富集

富集培养是指当样品中微生物含量较少时，根据该微生物的生理特点，人为创建一种培养条件，使样品中的微生物在最适合的环境条件下生长繁殖，相对数量快速增加，以利于菌株分离的手段。任何一种微生物的正常生长都有其特定要求的生理及环境条件，包括

碳源、氮源、酸碱度、温度、空气等要求，富集培养就是通过控制这些条件达到目的。由于本实验是要筛选放线菌，故使用最经典的高氏一号培养基对土壤中的放线菌进行富集培养。此外，放线菌的生长条件偏碱性，因此，加入氢氧化钠调节pH为碱性：7.2-8.5，以利于放线菌形成优势菌落而抑制其它微生物的生长。此外，在培养基中加入10%的苯酚抑制霉菌的生长，以及增强放线菌的抗逆性。在实验过程中，高氏一号培养基倒完平板后通常需要将培养基表面风干，以创造出一个适合放线菌生长而不利于大多数细菌生长的干燥环境。此外，在倒培养基时，应在倒平板时留出足够的空间，以利于放线菌的生长，因为其生长周期较长、好氧，初次筛选时生长周期更长，一般需要5-8天的时间，因此，应留出足够空间，保证空气含量，并做到无菌操作，以避免让其他生长周期短的菌株先形成优势菌落。将土样做成浓度梯度稀释后接种。放入28-32摄氏度培养箱中恒温培养5天左右。

高氏一号培养基（1L）：可溶性淀粉20克；三水磷酸氢二钾5克；七水硫酸镁5克；硝酸钾10克；琼脂20克；氯化钠5克，七水硫酸亚铁1克；蒸馏水1000ml；pH：7.2-7.5；灭菌121摄氏度20分钟。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到100ml，调pH。高温灭菌后，倒平皿前加入10%酚2滴至100ml培养基中混匀，将培养基倒入平皿内约15ml/皿

（三）分离培养

样品经富集后的培养液，仍然是多种微生物混合在一起，为了获得纯种，就必须采用特定有效的技术方法，把我们需要的菌株从中分离出来。这种方法是分离单个微生物细胞，经分裂繁殖在固体培养基上形成肉眼可见的单菌落，通过在肉眼条件下获取该单菌落而获

得该微生物的纯培养。现在多采用稀释涂布平板法、平板划线法等，此外，还可以结合特定的生理生化试验进行扩展，如透明圈法、变色圈法、生长圈法和抑制圈法。

具有抗肿瘤活性的放线菌多产生一些抗生素等，因此会在菌落周围形成一个透明抑制圈，用来抑制其他种类微生物的生长。放线菌的菌落形态特征为小而干燥，菌落致密，且菌落不透明，边缘有树枝状菌丝或光滑或粉状不均匀，菌落有时能形成各种颜色的色素，且具有特殊的土腥味。挑取单菌落，继续接种到新的高氏一号培养基上纯化培养，多采用划线分离的方法，以便更好地分理出单菌落。连续纯化2-3次可以减少菌落的混杂程度，避免菌株因为覆盖和毗邻而重叠生长造成的菌落不纯。挑取单菌落进行革兰氏染色后镜检，放线菌是革兰氏阳性菌，细胞壁厚呈紫色且菌落呈树枝状等各种典型特征。对这些菌落可以进行标记区分，比如可以记下它们分别的来源，或者挑选时的序号。

（四）筛选

⑴初筛

初筛是指从大量分离到的微生物中将具有合成目的产物能力的微生物筛选出来的过程。一般采用平板筛选和摇瓶筛选的办法，高通量筛选技术的兴起使得筛选过程自动化，更快速、便捷。由于先前在分离培养过程中菌落已经进行过多次纯化，所以接下来就是进行摇瓶发酵的筛选。配置高氏一号的液体培养基，分装成几瓶，40ml/250ml锥形瓶，调好pH值后灭菌，冷却后接入已经纯化好的单菌落的菌株，放入摇床，270rpm、32摄氏度进行摇瓶发酵，5天后菌液出现浑浊或者小球状的菌落团，无菌条件下取出适量的菌液进行相差显微镜的镜检，观察菌落生长状况以及是否染菌，一般在此时菌落进入对数期生长，对于生长状况好、未染菌的菌株可以制成菌保液放入-80摄氏度冰箱保存以备今后使用。在发酵第八天左右，菌落进入稳定期生长，此时，是各种发酵产物含量最多的时期，

也是收获产物的最佳时期。停止发酵，取出菌液，分装到小的EP管中，作为实验用。每种菌分装3-4支。

发酵完成后，就可以进行初筛了。将用于试验的肿瘤细胞复苏解冻后传代培养，接下来就可以对生长状况良好的肿瘤细胞进行实验。将肿瘤细胞铺板后，加入菌种发酵液做初筛，初筛要求对生物活性检测既快速又准确，为特异性药理活性物质提供一个有效的筛选方式。体外初筛最常用的模型为小鼠体内的L1210和P338淋巴细胞，最小火性标准为50%延滞存活。每个菌株只做1至2块板的生测实验，记录结果比较好的菌种，做好标记并记录肿瘤细胞的对应实验结果。每个菌种选取几种不同的肿瘤细胞做生测实验，然后综合分析菌种的抗肿瘤效果，对该菌种做出一个初步评估

⑵复筛

通过初筛工作，一般可以淘汰85%-90%不合要求的微生物。余下的菌株继续进行摇瓶培养，步骤与初筛同，然后取菌液做更加精细的细胞生测实验。此次每个菌株做2-3次重复实验，且用于试验的肿瘤细胞株种类应更多。对于此次结果好的菌株，可以再做一个菌液的浓度梯度的实验，以探索不同浓度下菌株发酵产物的抗肿瘤活性的强弱。经过这一系列的筛选工作，具有较好的抗肿瘤活性的菌株就已经基本上分离出来了，当然，除了单独培养外，也可以做不同菌株之间相互混合培养对其活性的影响。由于复筛的重复试验组数多，工作量很大，因此，也可以结合一些高通量筛选的方法，比如一些机械自动化仪器的使用与检测仪器的结合使用。

（五）产物分析

进行复筛后，对于抗肿瘤活性表现好的菌株，就要对其抗肿瘤活性物进行产物分析。用于检测多种抗肿瘤实际的指纹法，省去了对已知抗生素的频繁的重复检测，提高了对抗肿瘤活性物的筛选的工作效率。主要是避免了用在已知的抗肿瘤活性物的分离上的体力和时间。指纹法包括：抗微生物活性、纸层析、菌种鉴定、薄层层析、紫外吸收光谱、高效液相色谱。以下选取几个方法进行试验。

1，抗微生物活性：通常用于抗微生物活性分析的菌株有鼠伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌等致病菌，对他们做一个抑菌实验分析，可以初步得出待测菌株的抗菌活性。这一版还可以通过分离培养过程中透明抑菌圈的大小初步判断待测菌株的抑菌能力。试验中，把待检菌株菌液制成浓度梯度，然后通过滤纸片接种在上述几种致病菌的生长平板上，然后测量和记录抑菌圈的大小。

2，菌种鉴定：将待检菌株进行预处理，即将菌种从培养基中分离出来。通常是离心分离、溶菌酶处理破壁、蒸馏水洗、再离心等步骤，得到菌株。然后通过16srRNA分析，包括pcr扩增、热转、连接等步骤后送去专门测序的公司如Life Tech、上海生工，测序后在NCBI官方网站进行BLAST比对，得到近似菌及G+C的%值，最后构建系统发育树，对筛选出的有抗肿瘤活性的菌种进行一个分类。

（六）文献引用

1，海洋放线菌抗肿瘤活性菌株的筛选及菌株N350抗肿瘤活性物质的研究。【作者】

曾伟 【导师】 苏文金；【作者基本信息】 厦门大学， 动物学， 2001， 博士

2，微生物工程 陈必链主编，科学出版社

3，工业微生物资源开发应用与保护 诸葛健编著，化学工业出版社

4，工业微生物育种学（第四版） 施巧琴 吴松刚 主编，科学出版社

5，微生物实验指导 全桂静 雷晓燕 李辉编，化学工业出版社