海带多糖的分离纯化及活性研究

海带多糖的分离纯化及活性研究

姓名：刘海光申请学位级别：硕士专业：生化与分子生物学指导教师：曲爱琴

20070520

原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：童』盏纽日期：塑Ｚ：＝』：垒关于学位论文使用授权的声明本人同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的印刷件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。论文作者签名：壹龃导师签名鸺日（保密论文在解密后应遵守此规定）期：丞盟』主！山东大学硕士学位论文摘要传统的海带多糖的提取方法包括：热水提取法、酶提取法、碱提取法，而这些提取方法都存在一定的缺陷．热水提取的方法采用的温度是７０～８０℃，耗能多，提取时间长。酶提取的方法提取的时间长，工业生产需要使用的酶量大，不经济．碱提取法是现在工业提取海带多糖的主要方法，但是碱提取方法会造成多糖生物活性的降低。因此寻找合适的提取方法来降低能耗，提高海带多糖的提取率以及活性变得越来越重要．为达到这一目的，我们现采用超声波方法来提取海带多糖，随后对其理化性质和生物学活性进行检测，并与传统方法进行比较，以期得到海带多糖提取的最佳方法．首先采用了传统方法来提取海带多糖，获得的多糖测定其理化性质．随后对影响超声波提取多糖的５个因素进行研究，即：超声频率、物料比、时间、温度以及ｐＨ。通过对单因素的研究获得正交试验的基本信息，最终选定物料比、时间、温度和ｐＨ作为正交试验Ｌ．（３‘）的四个因子，进行这些因予３个水平上的研究。获得九种多糖后，测定他们的糖含量、硫酸基含量以及糖醛酸的含量，同时测定它们粘度以及分子量分布情况．通过研究计算获得超声波提取多糖的最佳方法，即：屯Ｂ。ｃｓＤｔ．使用该方法重新提取多糖，检测其各项理化指标，并与传统方法比较显示，超声波提取海带多糖在多糖提取能力上与水和酶的提取能力相当，超过５４５ｍｇ，远远高于碱提取法；从粘度和分子量分布看，超声波提取的海带多糖的小分子量多糖高于传统方法提取的海带多糖，在使用ＭＷｌ０００００的超滤膜时，多糖的透过滤接近４０％；经硫酸基含量分析得知该提取方法获得的海带多糖的硫酸基含量最高，达到９％，高于传统提取方法，而硫酸基含量的高低以及硫酸基在糖链上的位置与海带多糖的生物活性密切相关，可得知超声波提取海带多糖的生物活性理论上应该高于传统方法．气相色谱分析结果表明，４种提取方法获得的组成海带多糖的单１ｌ山东大学硕士学位论文糖的成分相同，含量也基本相同。４种海带多糖经ＤＥＡＥ一２３离子交换纤维素分离纯化，结果显示分离结果也基本相同。使用高效液相色谱对四种多糖分析发现，结果发现四种多糖的分子量相差不大。对超声波提取的海带多糖以及传统方法提取的海带多糖进行清除自由基的试验表明，超声波提取的海带多糖对自由基的清除作用高于传统方法提取的海带多糖。使用４种方法提取的海带多糖进行抗肿瘤试验研究，结果显示除碱提取外，其余多糖对大鼠胶质瘤ｃ６细胞均有良好的抑制作用。关键词：海带硫酸多糖，超声波。分离纯化，理化性质，生物学功能山东大学硕士学位论文ＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｔｈｏｄｓｔｏｅｘｔｒａｃｔ１ａｍｉｎａｒｉａｐ０１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｕｌｐｈａｔｅｆｒｏｍＬａｍｉｎａｒｉａＪａｐｏｎｉｃａｉｎｃｌｕｄｅｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｕｓｉｎｇｈｏｔｗａｔｅｒ，ｅｎｚｙｍｅａｎｄａｌｋａｌｉ，ｂｕｔａｌＩｔｈｅｔｈｒｅｅｍｅｔｈｏｄｓｔｏｈａｖｅｔｈｅｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ．Ｕｓｉｎｇｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｍｏｒｅｈｏｔｗａｔｅｒ。ｗｅｈａｖｅｃｏｎｔｒｏｌｔｈｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｔｏｇｅｔｔｏａｔｈａｎ７０ｃｅｎｔｉｇｒａｄｅ，ｗｈｉｃｈｔａｋｅｓｌｏｎｇｔｉｍｅａｎｄｗａｓｔｅｓｍｕｃｈｐｏｗｅｒ．Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓａｌｓｏａｎｅｅｄｓｌｏｎｇｔｉｍｅ，ａｎｄａｉｆｗｅａｐｐｌｙｉｔｔｏｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｉｎｔｈｅｉｎｄｕｓｔｒｙ，ｉｔｗｉｌｌｎｅｅｄＭｏｓｔｏｆｔｈｅｇｒｅａｔｄｅａｌｏｆｅｎｚｙｍｅ，ｗｈｉｃｈｉｓａｒｅｄｉｓｅｃｏｎｏｍｙ．Ｉａｍｉｎａｒｉａｒｅｄｕｃｅｔｈｅｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓｓｕｌｐｈａｔｅｂｙｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｂｕｔｔｈｉｓｔｈｅｗｉｌｌｉｓｐ０１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｔｏａｌｋａｌｉ，ｆｕｎｃｔｉｏｎｎｅｗｏｆｔｈｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ．Ｎｏｗｉｔｅｘｔｒａｃｔｔｏｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｉｎｄａｍｅｔｈｏｄｔｏｗｅｔｈｅｕｓｅ１ａｍｉｎａｒｉａｐ０１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｎｌｔｒａｓｏｎｉｃｔｏｅｘｔｒａｃｔｓｕｌｐｈａｔｅ，ｓｏｄｅｃｉｄｅｄｐ０１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ．Ｆｉｒｓｔｌｙ。ｍｅｔｈｏｄｓ，ｗｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｓｔｕｄｉｅｄｔｈｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｐｈｙｓｉｃａｌｂｙａｎｄｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄｔｈｅｉｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｎｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｆｉｖｅｋｉｎｄｓｏｆｆａｃｔｏｒｓ。ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｔｈｅｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｃｔｆｒｅｑｕｅｎｃｙ，ｔｏｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓｏｌｕｔｅｒａｔｉｏａｃｔｄｕｒａｔｉｏｎ，ｐＨ，ｗｅｒｅｔｏｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｔｉｍｅ，ｓｏｌｖｅｎｔｒｅｓｕｌｔｏｆａｎｄｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅｅａｃｈｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｗａｓａｐｐｌｉｅｄａｎａｌｙｚｅｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｏｆｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎ（Ｌ．（３‘））．Ｎｉｎｅｐｈｙｓｉｃａｌａｎｄｋｉｎｄｓｅｘｔｒａｃｔｅｄ，ｔｈｅｗｅｒｅｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｗｈｉｃｈｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆａｌ１ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｆｏｒｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｗａｓＡ２ＢＩＣ３Ｄ２ｔｈａｔｗａｓ１：３０ｓｏｌｖｅｎｔｔｏｓｏｌｕｔｅｒａｔｉｏ，３０ｍｉｎｕｔｅｓａｃｔｉｏｎｄｕｒａｔｉｏｎ。６０℃ａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｎａｔｕｒａｌｐＨ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｔｈｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｔｈｅｂｅｓｔｍｅｔｈｏｄｏｆ１３山东大学硕士学位论文Ｕ１ｔｒａｓｏｎｉＣ＿ｉｔｈｃｏｎｔｅｎｔｓａｍｅｔｈｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｔｈｏｄｓ。ｗｅｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅｏｆｐ０１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｔｈｅｈｏｔｗａｔｅｒｕｌｔｒａｓｏｎｉＣａｎｄｗａｓａＩｍｏｓｔｗａｓｔｏｔｈａｔｅｎｚｙｍｅ，ｗｈｉｃｈｍｕｃｈｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｅａｌｋａｌｉ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆｔｈｅｖｉｓｅｉｄｉｔｙＳｔｕｄｙｔｈａｔｍ０１ｅｃｕｌａｒｕｌｔｒａｓｏｎｉＣｗｅｉｇｈｔｗａｓｓｈｏｗｅｄｏｆｍｏｓｔｏｆｔｈｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｗｈｉｃｈｗａｓｓｍａｌｌｅｒｔｈａｎｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｔｈｏｄｓ，ｐｒｏｖｅｄｂｙｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｏｆｕｌｔｒａ—ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ．ＷｈｅｎｔｈｅｏｆＭＷｌ０００００ｗａｓｍｅｍｂｒａｎｅｕｓｅｄ，ａｂｏｕｔ４０ｐｅｒｃｅｎｔｏｆｔｈｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙＵ１ｔｒａｓｏｎｉＣｐａｓｓｅｄｔｈｅｍｅｍｂｒａｎｅ，ｗｈｉｃｈｉｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｔｈｏｄｓ．Ｇａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔａ１１ｔｈｅｐ０１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｃｏｎｔａｉｎｅｄｆｕｃ，ｘｙｌ，ｍａｎ，ｎｏｇａｌａｎｄｇａｌａａｉｄ，ａｎｄｈａｄｂｙＨＰＬＣｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｃｈａｎｇｅ．１４０ｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｅｓｔｉｍａｔｅｄ１ｉｔｔｌｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎａ１１ｔｈｅｗａｓｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｘｔｒａｃｔｅｄｍｅｔｈｏｄｓ．ＡｆｔｅｒｓｔｕｄｙｉｎｇｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＳＯ。２。ｉｎｔｈｅｐ０１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ｗｅｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＳ０４２一ｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｗａｓａｌｓｏｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｂｙｔｈｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｔｈｏｄｓ。ｗｈｉｃｈｒｅａｃｈｅｄ９％．ＷｈｉｌｅｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｗｅｏｆＳＯ。”ｗａｓｃｏｎｎｅｃｔｅｄｗｉｔｈｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎ，ＳＯｃｏｎｆｅｒｒｅｄｔｈａｔｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｔｈｅｎｅｗｍｅｔｈｏｄｓｈｏｕｌｄｂｅｔｈｅｆｒｅｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｅｔｔｅｒｔｈａｎｔｈｅｐ０１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｔｈｏｄｓ．ｃｏｕｌｄｔｈａｔｓｃａｖｅｎｇｅＡｌ１ｈｙｄｒｏｘｙｌｔｈｅｒａｄｉｃａｌ．Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｗａｓｔｈｅｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｈｙｄｒｏｘｙｌｆｒｅｅｒａｔｅｏｆｐ０１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙＵ１ｔｒａｓｏｎｉｃｔｏｒａｄｉｃａｌｗａｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｅｏｔｈｅｒｓ．Ａ１１ｔｈｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｅｘｃｅｐｔａｌｋａｌｉｃｏｕｌｄｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＣ６ｃｅｌＩｓ．ｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙＫｅｙｗｏｒｄｓ：ＬａｍｉｎａｒｉａｉＳＯｌａｔｉｏｎａｎｄｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅＳＵｌｐｈａｔｅ：Ｕ１ｔｒａｓｏｎｉｃ：ａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｐｈｙｓｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎ．１４缩略词表ＬＡＳＬａｍｉｎａｒｉａｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅＳＵｌｆａｔｅＦｕｃｆｕｃｏｓｅＧａｌｇａｌａｃｔｏｓａｎＧａｌａｃｉｄｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃａｃｉｄＧｌｕｇｌｕｃｏｓｅＭａｎｍａｎｎｏｓｏＸｙｌｘｙｌｏｓｅＲｈａｒｈａｍｎｏｓｅＡｒａａｒａｂｉｎｏｓｅＭＴＴ３－【４，５－ｄｉｍｃｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ一２－ｙ１］一２，５－Ｄｉｐｈｅｎｙｌ—ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍＰＢＳｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎＤＤＷｄｏｕｂ】ｅｄｉＳｔｉｌｌｅｄｗａｔｅｒＤＭＳＯｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ海带硫酸多糖岩藻糖半乳糖半乳糖醛酸葡萄糖甘露糖木糖鼠李糖阿拉伯糖磷酸缓冲液双蒸水二甲基亚砜四甲基偶氮唑盐前言海带被誉为天然的保健食品，在我国有悠久的食用历史，这与海带的医用价值密切相关，而海带的药用价值主要体现在海带多糖中。近年来，随着科技的发展和医药界的需求，多糖的研究越来越深入，海带多糖的研究也倍受关注．药理和临床研究表明，海带大部分生物活性与其主要成分多糖密切相关。目前，从海带中发现３种多糖：褐藻胶（ａｌｇｉｎ）、褐藻糖胶（ｆｕｃｏｉｄａｎ）、褐藻淀粉（１ａｍｉｎａｒａｎ）。褐藻胶和褐藻糖胶是细胞壁的填充物，褐藻淀粉存于细胞质中．褐藻胶在海带中相对含量最丰富，约为１９．１７％，它是由ａ—ｌ，４一Ｌ一古罗糖醛酸（Ｇ）和Ｂ—ｌ，４一Ｄ一甘露糖醛酸（Ｍ）为单体构成的嵌段二共聚物．褐藻糖胶，即褐藻多糖硫酸酯（ＦＰＳ），是褐藻具有的一类硫酸化多糖，褐藻多糖硫酸酯组成很复杂，在不同褐藻中变化很大，既存在简单的岩藻多糖硫酸酯，也有由多种单糖组成的结构复杂的杂多糖。褐藻淀粉又称昆布糖，有水溶性和水不溶性两种，主要由葡萄糖的多聚物组成。海带多糖经证明有很多的生物活性，其中褐藻糖胶医药上有很大的利用价值。但是传统的提取方法所得到海带多糖的结构复杂，分子量过大，这给海带多糖的研究和应用带来的了很多的困难．因此寻找合适的提取方法以及采用新方法得到的多糖的活性的研究具有重要意义。１．１海带硫酸多糖结构及其生物学功能概述褐藻糖胶（ｆｕｃｏｉｄａｎ）又名褐藻多糖硫酸酯（ｓｕｌｆａｔｅｄｆｕｃａｎｓ），也称为岩藻糖胶或岩藻聚糖硫酸酯，是一种水溶性的硫酸杂多糖，普遍存在于褐藻和一些棘皮动物中。褐藻糖胶的组成和结构十分复杂，单糖组分以Ｌ一岩藻糖为主，还含有少量的半乳糖、木糖、甘露糖和糖醛酸等成分“‘”．Ｌ一岩藻糖通过。一（１—２），Ｑ一（１—３）或ａ一（１—４）连接构成主山东大学磺士学位论文链，在Ｃ２或Ｃ４位上结合有复杂的硫酸基团，平均每两个岩藻糖基带有１个硫酸基ｎ１’．ＦＰＳ的分子量变化较大，具有种族差异性。并且受海藻生长时间、地点和提取方法的影响．典型分子结构式如图所示：已经证明褐藻糖胶具有抗氧化、抗肿瘤、调节血脂、提高免疫力、抗血栓等多种生物学功能。１．１．１清除自由基和抗氧化作用抗氧化剂活性的发现提高了海藻作为食品和添加剂的价值¨１．海带热水提取物（标记为ＳＰｈ）和冷水提取物（标记为ＳＰｃ）对超氧化物自由基和羟基自由基的清除有显著作用，且呈量效关系，前者的效果比后者好．在次黄嘌岭／黄嘌呤氧化酶体系中只用３９／Ｌ的ＳＰｈ就完全清除氧自由基。３０９／Ｌ的ＳＰｃ可清除６８．９％的超氧化物自由基，１５９／Ｌ的ＳＰｈ和３０９／Ｌ的ＳＰｃ对羟基自由基的清除分别为７７．７％和６８．７％¨１．褐藻糖胶（ＦＰＳ）治疗慢性肾衰，对中早期肾衰效果好，无毒副作用，特别对改善肾功能，提高肾脏对肌酐清除率效果尤为显著，现已按国家二类新药获准进入临床研究＂“１．有学者研究表明海带粗提物和褐藻糖胶可对自由基攻击肾时产生保护作用¨１”．在海带中加入褐藻糖胶会增１７加某些抗氧化酶的活性，减少自由基的产生，从而减轻自由基对肾的攻击。而采用生化检测的方法，研究海带提取物的抗氧化作用。小鼠经口给予海带提取物１个月后，血浆中超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）明显高于对照组（尸＜Ｏ．０１），丙二醛（ＭＤＡ）明显低于对照组（尸＜０．０５），而全血谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ２ＰＸ）含量无明显变化。表明海带提取物可使小鼠血，中ＳＯＤ活性明显增高，ｔｉＩ）Ａ明显降低，且在一定浓度范围内呈较好的量效关系．李德远“引研究褐藻海带中的岩藻糖胶（ＦＤ）对四氧嘧啶引起小鼠体内外脂质过氧化及小鼠组织匀浆自发脂质过氧化的影响。结果，预先给予ＦＤ的各组，注射四氧嘧啶后，血清、肝及脾中脂质过氧化物明显低于阳性对照组，以５０ｍｇ／ｋｇ作用较强，分别降低３２．７％（尸＜Ｏ．０１），２２．７％及２０．６％（以Ｏ．０１），糖尿病小鼠给予ＦＤ５０ｍｇ／ｋｇ后，血清、肝及脾组织中过氧化脂质（ＬＰＯ）分别降低３４．１％、２９．３％及３０．３％，小鼠组织匀浆中加入ＦＤ，或同时加入ＦＤ及半胱氨酸、硫酸亚铁，各组ＬＰＯ无统计学差异。结果显示，ＦＤ对四氧嘧啶损伤引起的ＬＰＯ升高有一定预防作用，对降低四氧嘧啶糖尿病小鼠ＬＰＯ水平有较好作用，但对正常小鼠肝、脾组织匀浆脂质体外自氧化及受激发过氧化，均无明显抑制作用。“钉１．１．２抗肿瘤作用褐藻糖胶能够有效杀伤肿瘤细胞，而这种作用是通过直接或间接途径起作用的．在海带褐藻糖胶对体夕Ｊ－ＱＧＹ７７０３肝癌细胞的抑制实验中发现，褐藻糖胶抑制了癌细胞进入对数生长期，从而遏制肿瘤的增长：同一实验中，褐藻糖胶的不同浓度对肝癌细胞的杀伤效果不同，呈剂量依赖性，即剂量增大，杀伤效果更明显“”。由于体外培养的细胞系统基本上排除了免疫作用，说明褐藻糖胶抗肿瘤效应包括直接杀伤肿瘤细胞的途径。此外，实验发现，小鼠腹腔注射从海带中提取的褐藻糖胶后，提高了腹腔巨噬细胞中的过氧化物酶活性及细胞的吞噬功能，使细胞毒作用增强；实验还发现腹腔巨噬细胞的数量亦有明显增加，且这些作用里剂量依赖性“”。对巨噬细胞和小鼠Ｓ１８０肿瘤细胞的影响实验中，发现褐藻糖胶能明显促进小鼠腹腔巨噬细胞的细胞毒活性，并有效杀伤１８山东大学硬士学位论文Ｓ１８０肿瘤细胞，最佳剂量为４０ｍｇ·ｋ９１·ｄ１“‘川．这说明，褐藻糖胶还能够通过促进巨噬细胞的功能，增强细胞毒活性，从而破坏和清除肿瘤细胞。另一方面，褐藻糖胶能够通过抑制肿瘤细胞的增殖和转移而达到抗肿瘤目的．恶性肿瘤的增殖、浸润和转移与肿瘤诱导的新生血管生成密切相关“‘’川，对褐藻糖胶的研究证明其具有抑制血管生成的作用．从小泡墨角藻提取的褐藻糖胶能阻止血管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）中的亚型ＶＥＧＦｌ６５与细胞表面受体ＶＥＧＦＲ２２的结合，抑制ＶＥＧＦｌ６５介导的人脐静脉内皮细胞增殖和迁移：整体实验还发现褐藻糖胶显著抑制小鼠ｓ１８０肉瘤细胞、Ｌｅｎｉｓ肺癌细胞和Ｂ１６黑瘤细胞诱导的新血管形成ｎ”．另外的研究发现，经过硫酸化修饰的褐藻糖胶能抑制人脐静脉内皮细胞迁移和血管生成，在ｌＯｍｇ／Ｌ和ｌ叽ｇ／ｍＬ浓度时抑制率分别达６８％和３１％：同时能引起碱性成纤维细胞生长因子诱导的纤溶酶原激活物抑制剂ｌ的释放，在１～ｌＯＯｍｇ／Ｌ（１～１０叻ｇ／ｍＬ）浓度呈剂量依赖性Ⅲ’．以上结果表明，褐藻糖胶可能通过抑制ＶＥＧＦ¨．介导的信号转导及促进碱性成纤维细胞生长因子诱导的纤溶酶原激活物抑制剂１释放而抑制血管的生成。此外，肿瘤细胞在转移过程中能分泌多种酶降解细胞外基质，肝素酶是唯一能裂解细胞外基质中蛋白多糖的内源性糖苷内切酶，抑制肝素酶后可明显减少肿瘤细胞的转移与扩散¨‘圳．实验发现，小鼠皮下注射从海带中提取的褐藻糖胶后再静脉注入黑色素瘤细胞或乳腺癌细胞，发现对肺扩散转移的抑制率达８０％～９０％：同时，在体外实验中褐藻糖胶可有效抑制肝素酶对细胞外基质中蛋白多糖的降解，０．２～ｌｇ／Ｌ（０．２～ｌｍｇ／ｍＬ）浓度即可抑制５０％的活性ｎ”．这说明，褐藻糖胶的抗肿瘤转移作用与其对肝素酶活性的抑制有关．１．１．３抗高血脂作用近年来，海带多糖的降血脂作用受到国内外的广泛关注．研究表明，从海带多糖中分离出的３个多糖组分都可以显著降低高脂血症大鼠血脂中的甘油三酯水平，提高高密度脂蛋白与总胆固醇的比值，且山东大学硕士学位论文能克服降脂药物的一些副作用。青岛海洋大学曾以海带硫酸多糖对实验性高脂血症大鼠进行实验，结果表明海带多糖在体外能直接清除过氧阴离子自由基和羟基自由基，在体内也有显著增强血清和组织中ＳＯＤ活力。因此，ＬＭＳＦ在降血脂和预防动脉粥样硬化形成方面具有较大的潜在应用价值。于瑞蓉等也曾以海藻多糖制成降脂饼干，供高血脂者食用，显示降血清胆固醇临床有效率为８２％，降血清甘油三酯为６７．７％。据ｈａｎｇ一１４０ｋ报告，海带褐藻糖胶可使小鼠血浆中胆固醇的含量显著减少，低密度脂蛋白含量降低而高密度脂蛋白含量增加，动脉粥样硬化指数减少，血浆中脂质氧化物浓度降低。１．１．３．１对脂酶活性的影响海带多糖可提高脂酶活性，在褐藻糖胶中发现了引起脂蛋白脂酶释放的物质，静脉注射后伴随着刺激脂肪裂解的效果。但药效的强弱并不依赖于多糖大分子硫酸化的程度“”。１．１．３．２对脂质代谢的影响海带多糖可以降低胆固醇，防治动脉粥样硬化，多次灌胃，可明显抑制高脂血鸡血清总胆固醇、甘油三酯含量的上升，并能减少鸡主动脉内膜粥样斑块的形成和发展。邓槐春ｎ”研究了在雄性小鼠ＩＣＲ中含４％海带提取物的食物以及在前者基础上另外加入褐藻糖胶分别对脂质代谢的作用。与对照组相比，褐藻糖胶组可使血浆中胆固醇的含量显著减少１３％－１７％，低密度脂蛋白降低２０％－２５％，高密度脂蛋白含量增加１６％，使动脉粥样硬化指数减少，血浆中脂质氧化物浓度降低…】。海带褐藻糖胶１５０ｍｇ／ｋｇ可显著降低高胆固醇小鼠血清中的总胆固醇水平，可有效预防小鼠高胆固醇血症的形成。海带淀粉硫酸酯也可降低胆固醇量并抑制冠状动脉粥样硬化病变幢“圳．所以，褐藻糖胶和海带提取物可以通过改善血脂代谢，防治动脉粥样硬化的发生．１．１．４调节免疫力多糖能在多个层面、多条途径对免疫系统发挥调节作用．包括对各类免疫细胞的调节、对细胞因子的调节、对补体的调节等。１．１．４．１细胞和细胞因子的调节海带租多糖（１００ｍｇ／ｋｇ）¨们和海带硫酸多塘（５～ｌＯｍｇ／ｋｇ）ｎ“能恢复由环磷酰胺引起的免疫低下小鼠的免疫功能．海带淀粉和海带淀粉硫酸酯“钉可促进淋巴细胞的转化，促进３Ｈ－ＴｄＲ和３Ｈ－ＵＲ掺入淋巴细胞，并表现出与植物血凝素（ＰＨＡ）的协同作用，在Ｃ３Ｈ／ＨｅＪｄ、鼠中海带多糖导致腹膜巨噬细胞分泌细胞因子白介素－１ａ和释放肿瘤坏死因子“”；以上表明海带多糖具有增强细胞免疫的功能；可增加免疫低下小鼠血清和脾细胞溶血素的含量，对体液免疫也有促进作用；在Ｃ３Ｈ／ｉｔｅＪ小鼠中海带多糖对脾细胞ＤＮＡ合成有促进作用；海带多糖部分还可提高脾细胞中多克隆抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ）的产生．海带多糖是一种免疫调节剂，其作用强度与香菇多糖和枸杞多糖相近ｎ“，证明它是一种对巨噬细胞、Ｔ细胞有直接作用的免疫调节剂．其中海带淀粉和海带淀粉硫酸酯对机体的免疫功能有促进作用，后者是前者人工磺化而成，对机体免疫功能的作用较前者弱，这可能是海带淀粉经磺化后，降低了对网状内皮系统的刺激而减弱腹腔巨噬细胞的吞噬功能Ｈ”．薛静波¨们研究了海带多糖对Ｃ５７ＢＬ／６ｄ、鼠腹腔巨噬细胞的激活作用，结果表明腹腔注射海带多糖４０ｍｇ／ｋｇ能明显激活小鼠腹腔巨噬细胞，增强其细胞溶解作用，并且在第１４天达到高峰，其活性随效应细胞／靶细胞比值的增大而增强，在有ｌＯｎｇ／ｍＬＬＰＳ的存在下，能在体外分泌肿瘤坏死因子．因此，海带多糖是机体免疫功能的调节剂，对于改善和增强机体免疫功能具有重要意义．１．１．４．２对补体系统的作用补体过度激活，不仅会消耗大量的补体成分，使机体抗感染的能力下降，而且在激活过程中产生大量的具有生物活性的物质。会导致机体２１山东大学硕士学位论文发生过度的炎症反应而引起自身细胞和组织的损伤。”．研究Ｈ“海带水溶性多糖对补体旁路（ＡＰＥ）的作用，发现２０９／Ｌ的褐藻糖胶可对红细胞溶解产生５０％的抑制，但褐藻糖胶硫酸化的程度并不影响其对ＡＰＥ的作用。１．１．５抗血栓作用及其可能机制大量研究表明褐藻糖胶具有明显的抗血栓活性，抑制凝血酶原的激活及凝血酶活性是其主要的作用机制。从枯墨角藻中提取的褐藻糖胶在体内外实验中均显著延长了血凝时间，并表现剂量依赖性：同时，实验还显示褐藻糖胶的抗血凝作用与血浆抗凝血酶Ⅲ介导的凝血酶抑制有关ｎ”。另外的研究表明，褐藻糖胶与肝素一样能以１：１的比例和抗凝血酶相结合，不过这种结合并不牢固ｍ’。这提示，褐藻糖胶可能通过与抗凝血酶的相互作用来抑制凝血酶的活性。此外，褐藻糖胶能有效抑制内源途径中凝血因子Ｘａ产生，浓度为５ｍｇ／Ｌ时抑制率达５０％，表明褐藻糖胶能有效抑制凝血酶原酶的形成；同一研究还发现褐藻糖胶在内源和外源凝血途径中，均能明显抑制凝血酶的产生，最高抑制率分别达９５％和６０％Ｈ”。因此，褐藻糖胶在内、外源途径中均可能通过阻止凝血酶原酶的形成而抑制凝血酶的生成。其次，褐藻糖胶的抗血栓作用与抑制血小板聚集有关。血小板活化因子在血栓形成的病理变化中起着关键作用，可引起血小板粘附、聚集从而导致微血栓形成“““，。从海带中提取的褐藻糖胶能够延长小鼠实验性出血时间并增加出血量，对体外诱导的血小板聚集具有抑制作用，并显著抑制大鼠实验性动、静脉血栓的形成，呈剂量依赖性“”。进一步的研究表明，褐藻糖胶对血小板活化因子引起的血小板聚集具有浓度依赖性的抑制作用，最大抑制率达９３．０４％“”。褐藻糖胶还对纤溶系统有明显的作用，能促进纤溶酶原向纤溶酶转化，从而具有溶栓作用。全血浆凝块溶解试验表明，从海带中提取的褐藻糖胶能明显缩短血浆凝块溶解时间：并能显著提高组织型纤溶酶原活化剂的活性，但对纤溶酶原激活物抑制剂１不起作用““．从昆布中提纯的褐藻糖胶，能有效促进高分子量尿激酶型纤溶酶原活化剂对纤溶酶原的激活，也能在一定程度上促进组织型纤溶酶原活化剂对纤溶酶原的激活¨”．另外，实验证明，褐藻糖胶的生物活性与硫酸基的含量之间存在密切的联系．褐藻塘胶的抗凝血活性随着硫酸化程度增加而增加，脱硫处理则活性降低，硫酸根含量减少２０％就完全失去抗凝活性¨３·“·”·“１。１．２海带多糖的提取１．２．１水提法水提法为海带多糖的传统提取方法．邢杰等“”采用固定因素法对海带多糖的水提条件进行优化，以多糖提取率为指标得最佳工艺：提取温度为ｌＯＯ℃，提取时间为６ｈ，加水量为９０ｍＬ／ｇ。张彦民等¨们采用单因素分析法对硫酸酯化多糖的提取工艺条件进行了优选，得出提取时间为２ｈ，提取温度为９０＂（２，加水量为干净海藻质量的２５倍。该工艺多糖产率达到１．９９％，其主要理化指标“硫酸根＋多糖”质量分数为６１．２６％．１．２．２碱处理法刘秀河等¨”以于海带为原料，采用二次浸泡和碱处理工艺．以褐藻酸的提取率作为多糖提取率的评价指标（７０＂Ｃ二次水浸提后，采用２０倍１．５％Ｎａ。ＣＯ，，６０℃碱提ｌｈ），提取率达到７６．８８％，高于其它方法．并指出，用Ｎａ：ｃ０。溶液作为浸提介质较ＮａＯＨ效果好，其浓度应控制在ｌ％～２％．１．２．３分类提取法李林等¨钉根据海带多糖中的褐藻胶不溶于稀酸溶液而其钠盐溶于水的性质，以０．１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ水溶液从海带粉末中提取褐藻糖胶和褐藻淀粉（根据溶解度的差异，用不同浓度的乙醇沉淀分离），而使含量很高的褐藻胶留存于滤渣中，然后以１％Ｎａ：ｃ０。溶液使其生成褐藻酸钠来提取。１．２．４超声法１．２．４．１超声波介绍超声波是一种机械振动在媒质中的传播过程，其频率一般在２０ｋＨｚ以上．超声波具有以下特性：方向性好、功率大、穿透力强、引起空化作用、引起许多特殊反应ｍ１．超声技术在工业、国防、医药卫生和环境保护等部门得到了广泛应用，在工业方面如超声工业检测、超声工业测量、超声焊接、超声加工及超声金属成型等：在医学方面如超声诊断和超声治疗：在环保方面，如超声杀菌、超声化学处理和超声除尘等¨“。近年来，超声技术在农产品加工中也得到了应用与发展。１．２．４．２超声提取超声提取又名超声萃取，即从原料中提取有用物质或者成分。超声强化动植物细胞中内含成分的萃取目前已有广泛的研究，并有一定的应用。郭孝武等人研究了超声对中草药成分萃取的应用”“”１。包括：１．黄连根茎中萃取黄连素。一般用浸泡渗漉法，但速度慢，时间长，提取率低。超声处理可大大缩短提取时间，提高黄连素的提取率，节约了药材。２．益母草总碱的提取。用超声和常规回流两种方法。从益母草中提取益母草总生物碱，通过比色法测定，比较两法所提取的生物碱产率。实验证明，超声法大大缩短了提取时间。３．从槐米中提取芸香甙。用超声法从槐米中提取芸香甙，与热碱提取一酸沉淀法相比。此法无需加热，用频率为２０ｋｔｌｚ的超声波处理３０ｍｉｎ，其提取率可提高４７．５％，且工艺简单，速度快．超声对萃取的影响与组织细胞的破碎有关．它能使细胞中可溶性成分更好地释放出来，并使溶剂分子渗透到组织细胞中去。超声的破碎作用还可用于一些细胞壁坚固的植物细胞上。对花粉细胞壁的研究表明，超声法的破碎作用要明显好于研磨法。２４山东大学硕士学位论文１．２．４．３超声波提取海带多糖超声波法提取多糖是一种很有希望的多糖提取新方法。将超声波应用于对中药苷类成分的提取中可以提高苷类的提出率并缩短提取时间。取适量干海带粉，加入蒸馏水适量，然后用超声波发生器处理一定的时间，提取液经过滤、浓缩、去蛋白、乙醇沉淀等处理后可得粗品多糖。廖建民等“”以海带多糖得率为指标，提得租提物中糖含量为２８．１９％，大分子的杂质含量为０．９７％．而酸提法得到的多糖含量为１９．８％，大分子的杂质为１．９２％．二者差别显著（Ｐ＜Ｏ．０１），且抗肿瘤实验表明两种提取方法效果相当，提出该方法为一种有希望的多糖提取新方法．王谦等¨”采用气升式反应器超声破碎海带提取硫酸酯多糖，提取率高达１．８６％，比传统的水提法高．超声波法提取海带多糖时，超声时间不易过长．超声处理时间的延长。可能是由于超声波具有较强的机械剪切作用，长时间的作用会使大分子的多糖断裂，从而在后处理的过程中的损失增大而影响多糖的提出率．实验过程中还应注意控制ｐＨ值和海带与溶剂水的质量比，以保证提取率最高。１．２．５酶解法本实验室王琪琳¨”采用酶解法从海带中提取制备海带硫酸多糖（ＬＰＳ），即海带浆加入纤维素酶、果胶酶和蛋白酶，５０℃水解４ｈ，而后升温至９０℃，使酶失活，冷至室温进行过滤，取滤液加入氯化钙，离心去除海藻酸钙；上清液加入十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）与ＬＰＳ结合沉淀，离心收集ＣＴＡＢ—ＬＰＳ沉淀物；加入氯化钙溶液进行盐解，游离出ＬＰＳ后加入乙醇使其析出，经离心烘干得ＬＰＳ．与水煮提取法比较，该提取工艺得到的ＬＰＳ产率是前者的２倍．这些提取方法中水提取法，酸碱提取法以及酶提取法都属于传统的提取方法，这些方法都存在各自的优缺点．水提取的温度要控制在ｌＯＯ℃，需要大量的能量消耗以及较长的提取时间，不适用于工业生产；酸提取的方法存在很大的污染，同时消化海带时需要大量的酸，因而山东大学硕士学位论文这种提取方法只是适用于实验室级别的提取研究；酶提取可以获得质量比较好的海带硫酸多糖，据研究这种方法提取的海带多糖的生物活性也比较高。碱提取法是现在工业提取海带多糖的主要方法，该方法的好处是操作简单，消化彻底，相同质量的海带可以提取得到较多的海带多糖，但是这种提取方法存在很大的污染，因而工业生产受到一定的限制，并且这种处理方法处理的海带后期的提取难度比较大．超声波方法提取海带多糖已有所报道，这种方法相对于以上的各种方法的优点是：多糖的提取时阃大幅度减少，相同质量的海带获得的海带多糖相对较多，不存在污染，同时研究显示这种方法提取的海带多糖的生物活性并没有降低。所以我们实验的主要目的就是筛选超声波提取海带多糖的方法，得到提取海带多糖的最佳方法，并与传统的方法进行比较，评价这种提取方法与传统方法提取的海带多糖的差别，后期研究超声波提取海带多糖的生物活性作好准备。１．３褐藻糖胶的纯化按上述方法提取的糖胶多不纯，通常含有水溶性褐藻胶、蛋白质、色素等，因此，提取后应进一步纯化¨”。纯化方法包括：乙醇重沉淀法：许多资料表明，对粗海带多糖的纯化可以用适当浓度的ＭｇＣｌ：、ＣａＣｌ。溶液和一定浓度的乙醇共存时，产生沉淀的方法除去作为杂质的水溶性褐藻胶．季胺盐类沉淀法：利用阳离子表面活性剂如ＣＰＣ或ＣＴＡＢ能与高分子电解质产生沉淀的性质，使褐藻糖胶沉淀下来。在提取和纯化过程中，还可以用透析法除去溶液中的离子和小分子物质，可以用酶消化法来除去混杂在提取液中的蛋白质。海带多糖的化学结构复杂，因此人们逐渐用分级法将混杂的糖胶成分分成不同等级。１．３．１乙醇分级法可以与ＣＰＣ分级配合使用。刘晓蕙等¨”将海带的水提液经２０％的乙醇醇析得粗糖胶，将此粗糖胶经氯代烷毗啶分级，并结合用乙醇分级得Ｆｌ、Ｆ２、Ｆ３与Ｐ１、Ｐ２、Ｆ３、Ｐ４、Ｐ５共８个级分。山东丈学硕士学位论文１．３．２色谱法利用凝胶过滤柱色谱和离子交换色谱进行分级。离子交换色谱可将多糖分为荷电性不同的级分，凝胶过滤色谱法则按分子量大小进行分级．由于海带多糖的带电性，因此本实验室主要采用离子交换柱进行分离．称取一定量海带硫酸多糖粗品，加水溶解，上处理好的ＤＥＡＥ－２３ＣＬ一型柱子进行离予交换层析．开始用蒸馏水洗脱，然后分别用０．５和Ｉ．Ｏｍｏｌ／ＬＮａＣＩ溶液进行洗脱，流速ｌＯＯｍＬ／ｈ。利用苯酚一硫酸法检测洗出液的糖含量。得到Ｆｌ、Ｆ２、Ｆ３三个组分．将蒸馏水洗脱得到的样品后再上ＤＥＡＥ一４１柱，先用蒸馏水洗脱，再用０．５ＮＮａＣＩ溶液洗脱。可分为两个组分．将峰区洗脱液透析，冷冻干燥得纯化的海带硫酸多糖．第二部分海带硫酸多糖的提取２．１材料与仪器２．１．１材料海带果胶酶９５％医用乙醇其他药品均分析纯２．１．２仪器高速粉碎机天津泰斯特公司济宁金百特公司济宁金百特公司上海安亭科学仪器厂郑州长城科工贸有限公司鄄城光明仪器公司上海亚荣生化仪器厂北京普析通用仪器有限公司北京博医康技术公司上海沪西分析仪器厂上海市实验仪器厂上海天平仪器厂山东荣城鸿洋实业总公司天津市利华酶制剂厂超声波药品处理机中试多功能超声波提取机组ＬＸＪ—ＩＩＢ型离心机循环水真空泵调温电热套ＲＥ一５２＾旋转蒸发仪ＴＶ一１８００Ｓ紫外一可见分光光度计ＦＤ－１冷冻干燥仪ＢＳ一１００Ａ自动部分收集器超级恒温器电子天平２．２实验方法２．２．１制备海带粉购买海带后，用自来水将其洗净，晒干。随后使用６０目一８０目的粉碎机将干海带粉碎，收集备用。２．２．２热水法提取称取制备好的海带粉２００９，倒入２．４Ｌ水中，搅拌均匀，放入７０山东大学硬士学位论文℃水浴锅中水浴６ｈ，并不断搅拌（由于水分的蒸发，定时将水补足）进行水解．冷却至室温，于５０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，保留上清液．用适量水将离心后的海带渣搅拌均匀，再次离心后，合并上清液．按体积比平均分成两份，一份上清液经减压浓缩（４０℃）后，加入三倍体积９５％乙醇，沉淀过夜．离心后获得海带粗多糖Ａ．另一份上清液中加入氯化钙（２９／ｌＯＯｍＬ），静置，５０００ｒ／ｍｉｎ离心去除褐藻酸钙。上清液经减压浓缩（４０℃）后，加入三倍体积９５％乙醇，沉淀过夜．离心后获得海带硫酸多糖Ｂ．将以上所得沉淀Ａ、Ｂ各重新溶于水，离心除去不溶物．上清液再加三倍体积９５％乙醇，静置沉淀．生成沉淀经无水乙醇、乙醚洗涤，重新溶于蒸馏水，置于－２０１２冰箱冷冻过夜，冷冻干燥得到海带杂多糖Ａ。以及海带硫酸多糖粗品Ｂ。。２．２．３酶提取法称取制备好的２００９海带粉，置于不锈钢桶中，加入蒸馏水２．４Ｌ，按万分之二的比例加果胶酶Ｏ．４８克（可适当增加果胶酶用量，使海带碎叶消化更完全）．调ｐＨ值为４．５－５．０，盖上盖子，于４５—５０１３水浴锅中水浴４到６小时，随时搅拌．然后升温至９０℃，对酶进行灭活，持续１５分钟．冷却至室温后，于５０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，保留上清液．残渣中再加入适量水，搅拌，重复离心．合并两次上清液．按体积比平均分成两份，一份上清液经减压浓缩（４０℃）后，加入三倍体积９５％乙醇，沉淀过夜．离心后获得海带粗多糖Ｃ。另一份上清液中加入氯化钙（２９／ｌＯＯｍＬ），静置，５０００ｒ／ｍｉｎ离心去除褐藻酸钙．上清液经减压浓缩（６０℃）后，加入三倍体积９５％Ｚ，醇，沉淀过夜．离心后获得海带硫酸多糖Ｄ．将以上所得沉淀Ｃ、Ｄ各重新溶于水，离心除去不溶物。上清液再加三倍体积９５５乙醇，静置沉淀．生成沉淀经无水乙醇、乙醚洗涤，重新溶于蒸馏水，置于－２０１３冰箱冷冻过夜。冷冻干燥得到海带杂多糖Ｃ。以及海带硫酸多糖粗品Ｄ。．２．２．４碱提取法２９配制１％的碳酸钠溶液：称取１５９无水碳酸钠加入１５００ｍＬ水称取制备好的２００９海带粉，置于不锈钢桶中，加入配好的碳酸钠溶液２．８Ｌ。在５０℃水浴５ｈ，趁热用棉纶网进行吊滤，并不断用热水冲洗保持温度，获得的吊滤液于５０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，保留上清液。按体积比平均分成两份，一份上清液经减压浓缩（４０℃）后，加入三倍体积９５％乙醇，沉淀过夜。离心后获得海带粗多糖Ｅ。另一份上清液中加入氯化钙（２９／ｌＯＯｍＬ），静置，５０００ｒ／ｍｉｎ离心去除褐藻酸钙。上清液经减压浓缩（４０℃）后，加入三倍体积９５％乙醇，沉淀过夜．离心后获得海带硫酸多糖Ｆ。将以上所得沉淀Ｅ、Ｆ各重新溶于水，离心除去不溶物。上清液再加三倍体积９５％乙醇，静置沉淀。生成沉淀经无水乙醇、乙醚洗涤，重新溶于蒸馏水，置于一２０１２冰箱冷冻过夜，冷冻干燥得到海带杂多糖Ｅ。以及海带硫酸多糖粗品Ｆ。。２．２．５超声波提取法单因素考察试验条件的确定：实验选取ｐＨ、作用时间、固液比、温度、频率五个因素对提取的海带多糖的影响作为研究对象。２．２．５．１作用时间对海带多糖提取率的影响向超声波提取器中加入４８０９海带粉，按照固液比为ｌＯＯｇ海带粉加入２．５Ｌ水的比例加入１２Ｌ水，调整超声波提取器的超声波频率为２６．９ＭＨＺ，ｐＨ设定为７，于室温条件下使用半管提取方式进行提取，以时间为标准取样测试，取样时间分别为：３０ｍｉｎ、４０ｍｉｎ、５０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、７０ｍｉｎ，取样量为１Ｌ／次。随后于５０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，残渣水洗后重复离心一次，合并上清液，经减压浓缩（６０１２）后，加入三倍体积９５％乙醇，沉淀过夜。将所得沉淀重新溶于水，离心除去不溶物。上清液再加三倍体积９５％７，醇，静置沉淀。生成沉淀经无水乙醇、乙醚洗涤，重新溶于蒸馏山东大学硕士学位论文水，置于一２０℃冰箱冷冻过夜。冷冻干燥得到海带粗多糖．２．２．５．２固液比对海带多糖提取率的影响固定提取时间为３０ｍｉｎ，ｐＨ设定为７，超声波采用低频，温度为室温，固液质量比分别为１：２０～ｌ：４０进行提取。随后于５０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，残渣水洗后重复离心一次，合并上清液，经减压浓缩（６０℃）后，加入三倍体积９５％乙醇，沉淀过夜。将所得沉淀重新溶于水，离心除去不溶物．上清液再加三倍体积９５％乙醇，静置沉淀．生成沉淀经无水乙醇、乙醚洗涤，重新溶于蒸馏水，置于一２０℃冰箱冷冻过夜，冷冻干燥得到海带粗多糖．２．２．５．３ｐＨ对海带多糖提取率的影响固定提取时间为３０ｍｉｎ，超声波采用低频，温度为室温，固液质量比为１：２５，提取时采用的ｐＨ值分别为：３，５，７，９．随后于５０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ。残渣水洗后重复离心一次，合并上清液，经减压浓缩（６０℃）后，加入三倍体积９５％乙醇，沉淀过夜．将所得沉淀重新溶于水，离心除去不溶物。上清液再加三倍体积９５％乙醇，静置沉淀．生成沉淀经无水乙醇、乙醚洗涤，重新溶于蒸馏水，置于一２０℃冰箱冷冻过夜，冷冻干燥得到海带粗多糖．２．２．５．４温度对海带多糖提取率的影响固定提取时间为３０ｍｉｎ，ｐＨ设定为７，超声波使用低频，固液质量比为１：２５，提取温度分别为：３０℃，４０℃，５０℃，６０℃．随后于５０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，残渣水洗后重复离心一次，合并上清液，经减压浓缩（６０℃）后，加入三倍体积９５％乙醇，沉淀过夜．将所得沉淀重新溶于水，离心除去不溶物．上清液再加三倍体积９５％乙醇，静置沉淀．生成沉淀经无水乙醇、乙醚洗涤，重新溶于蒸馏水，置于一２０℃冰箱冷冻过夜，冷冻干燥得到海带粗多糖。２．２．５．６频率对海带多糖提取率的影响固定提取时间为３０ｍｉｎ，ｐＨ设定为７，固液质量比为１：２５，温度为室温，提取频率分别为低、中、高三个频率．２．２．６各因素对海带多糖提取率的影响山东丈学硕士学位论文在单因素实验的基础上，对各因素进行评估，对影响提取率的主要因素（时间，物料比，ｐＨ以及温度）进行Ｌ。（３４）正交实验，不考虑各因子的交互作用，设计见表２—１。表２—１正交试验安排Ｔａｂ．２—１Ｄｅｓｉｇｎｏｆｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｏｆｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎ２．３结果与分析２．３．１传统方法提取多糖由水、酶、碱三种方法提取海带多糖，其中热水法采用了三个温度进行研究，提取结果如表２—２。表２－２传统方法提取多糖的糖重量Ｔａｂ．２－２Ｗｅｉｇｈｔｏｆｔｈｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｍｅｔｈｏｄｓｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ组别杂多糖提取量（ｇ）５０℃７０℃９．０８１１．３６１６．９３多糖提取量（ｇ）５０℃０．７９９０℃１４．０１７０℃１．１５１．２５１．２７９０℃１．４７水３．８４酶碱山东大学硕士学位论文由表２—２中可以看出，在热水提取多糖的过程中，随着温度的升高，多糖的提取量在大幅度的增高；在比较三种传统的提取方法后，我们可以看到，稀碱对海带杂多糖的提取能力最高，达到了１６．９３％，其次为９０℃的热水提取，最低为酶的提取能力．这里所指的多糖是杂多唐，含有的成分多，其中主要成分是褐藻酸钠，在加入ＣａＣＩ。处理海带杂多糖后，ＣａＣｌ。与褐藻酸钠反应生成不溶于水的褐藻酸钙后，连续处理两次后，完全去除了褐藻酸钠，在这种情况下提取的海带多糖主要是海带硫酸多糖。海带硫酸多糖是海带多糖生物活性的主要体现者，经过处理后，我们可以看到对于海带硫酸多糖提取能力最高的是９０℃的热水提取方法．提取能力由高到低依次为：９０℃的热水提取法，碱提取法，酶提取法，７０℃的热水提取法以及５０＂Ｃ的热水提取法．２．３．２单因素试验结果２．３．２．１作用时间对海带多糖提取率的影响固定其余提取条件，使用超声波提取多糖的时闻分别定为２０，３０，４０，５０，６０ｍｉｎ，提取结果如图２一ｌ。Ｏ·２Ｖ毒ｏ·鬻螭０．Ｏ２０３０４０５０６０提取时问（ｍｉｎ）图２—１．作用时间对多糖提取的影响ｔｏｔｈｅＦｉｇ．２－ｌＥｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｔｉｍｅａｃｔｉｏｎｄｕｒａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ由图２—１可以看出，随着提取时间的延长，海带多糖的提取率出现了先高后低的情况．最高点提取的海带多糖的重大约是最低点的１．４６倍．提取率先提高的主要原因是超声波对海带细胞壁的破坏，从而释山东大学硕士学位论文放更多的多糖；后期出现降低的主要原因可能是由于超声波本身对多糖的降解作用造成的。２．３．２．２固液比对海带多糖提取率的影响固定其余提取条件，以每ｌＯＯｇ海带粉加水量分别为：２Ｌ、２．５Ｌ、３Ｌ、３．５Ｌ、４Ｌ，分别进行提取，结果如图２—２。１．２，、０．９一Ｏ．６奢蚺Ｏ．３０２０２５３０３５４０加水量（ＩＬ／ｇ海带）图２—２．物料比对多糖提取的影响Ｆｉｇ．２－２Ｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｓｏｌｖｅｎｔｔｏｓｏｌｕｔｅｒａｔｉｏｔｏｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ由图２－２可以看出，随着用水量的增加，提取率出现逐渐增加，随后保持大致不变的情况，说明在固液比未达到３０倍之前，海带粉与水的混合物过于粘稠，虽然超声波提取器本身具有搅拌作用，但粘稠的混合物本身对超声波的阻断作用，使超声波不能充分作用于海带粉。随着水量的增加，海带粉和水的混合物粘稠度降低，超声波作用充分，因而提取率逐渐提高；在固液比达到３０倍以后，超声波已经可以充分的作用于混合物中的海带粉，因而提取率在固液比超过３０倍以后就基本保持不变了。２．３．２．３ｐＨ对海带多糖提取率的影响保持其它提取条件不变，仅改变提取条件中的ｐＨ，分别取ｐＨ值为：５、６、７、８、９进行提取试验，结果如图２—３。ｌ２Ｏ９Ｏ６一一鬻螭Ｏ３Ｏ６７８硼图２－３．ｐＨ对多糖提取的影响Ｆｉｇ．２－３ＥｆｆｅｃｔｏｆｐＨｔｏｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ由图２－３可以看出，随ｐＨ增加，提取率出现先增后迅速减少的情况，在ｐＨ接近中性的情况下提取率最高．提取率先高后低的主要原因在于海带多糖在酸性提取过程中，提取出来的褐藻酸钠本身是溶于水的，但是在酸性条件下，褐藻酸钠转变为褐藻酸，褐藻酸本身不溶于水，这就出现了沉淀．褐藻酸的沉淀降低了超声波作用于海带粉的能力，这是造成提取能力降低的主要原因之一；在中性之后，随着ｐＨ的升高，海带多糖的提取率也下降，而且下降的情况越来越明显，这主要在于碱本身对海带多糖具有水解作用．据报道在４５℃，０．０５ＮＮａＯＨ作用１６小时进行Ｂ一消除反应，即可以使糖苷键断裂．而在超声波作用下，这种降解作用可能会更明显．２．３．２．４温度对海带多糖提取率的影响在温度分别为３０、４０、５０、６０１３条件下的提取结果如图２－４．山东大学硕士学位论文Ｉ·２。。·９Ｖ看０６慵。．３。４０６０ＯＯ量度（℃）图２－４．温度对多糖提取的影响Ｆｉｇ．２－４Ｅｆｆｅｃｔｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｃｔｉｏｎｄｕｒａｔｉｏｎｔｏｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ由图２－４可以看出，随着温度的升高，海带硫酸多糖的提取率逐渐提高。从传统的热水提取方法中我们可以看到，在提取５小时的情况下，水浴提取温度达到９０＂Ｃ之前，随着温度的上升，多糖的提取率都在上升，但是由于超声波提取器本身的制约，提取温度最高只能达到６０℃。２．３．２．５频率对海带多糖提取率的影响该超声波提取器的频率为低、中、高三档，我们使用这三种基本频率，调节到超声波充分作用的频率进行提取，结果如图２—５。０．９２０．８８盏ｏ．８４馨椎Ｏ．８０．７６低中超声波频率高图２－５．Ｆｉｇ．２－５Ｅｆｆｅｃｔ超声频率对多糖提取的影响ｆｒｅｑｕｅｎｃｙｔｏｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｏｆＵ１ｔｒａｓｏｎｉＣｐ０１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ３６山东大学硕士擘位论文由图２—５可以看出，在使用超声波提取器的三个频率进行提取海带多糖的过程中，随着频率变改变，海带多糖的提取率也出现变化，三种频率下，低频率获得的海带多糖最多，其后依次使中频率和高频率，证明该超声波提取器的在低频率提取条件下，也就是在２７ＭＨｚ左右，提取能力最佳，这与仪器公司最初建议使用的频率的相同．该试验仅能说明超声波在这三种频率下的提取能力的差别，我们不能确定在这三种频率之间的频率是否均符合频率越高提取率越低的规律．２．３．３超声波提取条件的确定根据以上单因素试验的结果，我们得到了单因素的水平变化对超声波提取海带硫酸多糖的影响，鉴于以上试验分析，我们决定采取在单因素试验过程中提取多糖量最高的水平及其左右的水平选取正交试验的水平进行正交试验．最终采取的正交试验因素水平如表２—３．表２－３超声波提取海带多糖正交实验Ｌ９（３‘）Ｔａｂ．２—３ＬｅｖｅＩｓｏｆｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｏｆｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎＬ９（３‘）．＿２．３．４正交试验获得的多糖按照正交试验表２－１的试验顺序及试验条件安排表２－３的试验数据，并进行表２－１中的９组试验，提取获得海带硫酸多糖，提取结果及计算分析如表２－４．山东大学硕士学位论文表２—４超声波提取海带多糖正交实验结果Ｔａｂ．２－４Ｒｅｓｕｌｔｏｆｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｏｆｏｆｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎｆｏｒｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐ０１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｌ２３４５６７８９ｌ１１２２２３３３１．９３６２．３０４２．２９１２３１２３１２３２．７８８１．６５８２．０８４０．９２９０．５５３０．６９５０．３７６１２３２３ｌ３ｌ２１．９２８２．１０１２．５０１０．６４３０．７０００．８３４０．１９１ｌ２３３１２２３１２．３２０２．７１３１．４９７０．７７３０．９０４０．４９９０．４０５Ｏ．８１４０．６２６０．４９６０．７２００．７５ｌ０．８３３１．２５４０．２８ｌＯ．７５６ＩＩＩＪＪＩｌｌＪＩＪ平均０．６４５ⅡＪ平均０．７６８Ⅲ。平均０．７６３Ｒ０．１２３１．１Ｉ，Ⅲ分别曩不吾因于帕１、２，３水平教括Ｚ祁·ｊ震示第几因子，Ｒ表示极茬由表２－４结果可以看出，在九次正交试验提取的多糖中，各次结果差别较大，这主要是由于不同因素的不同水平间的组合情况造成的。通过计算各因子三个水平提取多糖重量之和：ＩＪ、ⅡＪ、ⅢＪ，以及三水平提取多糖重量的平均值：Ｉ，平均、ＩＩ，平均、Ⅲ．平均。由此获得的极差结果分析表明影响海带多糖超声波提取的各因子对提取结果影响的大小排序为：Ｄ＞Ｂ＞Ｃ＞Ａ，即ｐＨ＞时间＞温度＞物料比。方差分析表明超声波提取时间以及ｐＨ对海带多糖的提取具有显著性影响，而温度和３８山东大学硬士学位论文物料比的影响不显著．随着超声波作用时间的增加，多糖的提取率在４５ｍｉｎ和６０ｍｉｎ均比３０ｍｉｎ有所增加，但在这两个水平上提取率基本相同，说明在物科比达到ｌ：３０时，超声波对海带粉的作用基本充分。超声波作用时间的变化，海带多糖的提取率出现在第二水平减少，而在第三水平又出现一定的增加，这种情况发生的主要原因可能与超声波对海带多糖的提取和降解的双重作用造成的．随着作用时间的延长，海带多糖的提取率逐渐增加，这与热水法提取多糖的情况相符，但变化情况不明显，这与超声波提取器的所能控制的温度变化能力过小有关．ｐＨ变化对多糖提取率的影响趋势和单因素研究的结果相符，低ｐＨ产生的褐藻酸沉淀以及高ｐＨ的降解作用造成提取率的降低．因此，该试验获得的超声波提取海带多糖的最佳条件是Ａ２Ｂ。Ｃ。Ｄ。，即：物料比为１：３０，提取时间为３０ｍｉｎ，温度为６０℃，ｐＨ为７．第三部分海带多糖理化性质分析３．１材料与仪器３．１．１材料海带多糖标准单糖（ｆｕｃ，ｇａｌ，ｘｙｌ，ｒｈａ，ｇｌｕ，ｍａｎ，ｇａｌａｃｉｄ）自制Ｓｉｇｍａ肌醇六乙酸酯Ｄｅｘｔｒａｎ葡聚糖（Ｔ一１０，Ｔ一４０，Ｔ一７０，Ｔ一５００，Ｔ一２０００）ｐｈａｒｍａｃｉａ超滤膜（ＭＷ５０００，１００００，３００００，５００００，１０００００）３．１．２仪器ＭＩＬＬＩＰＯＲＥＴＶ－１８００Ｓ紫外一可见分光光度计粘度计ＮＤ３－ｔ超滤仪冷冻干燥机ＧＣｌ２２一气相色谱仪ＧＨ一３００高纯氢发生器ＷＹ５．２－Ｃ微型空气压缩机北京普析通用仪器有限公司上海精密仪器公司ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ北京博医康技术公司上海精密科学仪器有限公司北京汇佳精仪工贸有限公司浙江萧山亚达微型空气压缩机厂ＳａｖａｎｔＳａｖａｎｔ真空浓缩仪Ｔｈｅｒｍｏ多功能真空系统ＴｈｅｒｍｏＦＪ一２０００－ｉｎｄｏｗｓ色谱工作站ＬＣ－ＩＯＡ高效液相色谱仪高速台式离心机３．２上海以泰信息工程有限公司岛津公司上海医疗器械厂实验方法将多糖分别配制成１０吮ｇ／ｍＬ溶液。３．２．１糖含量的测定测定多糖的糖含量，利用多糖中的己糖能与苯酚一硫酸试剂发生显色反应，采用苯酚一硫酸法哺”。分别取各种多糖溶液适量，用蒸馏水稀释至２．ＯｍＬ，向其中加入山东大学硕士学位论文１．ＯｒａＬ６％的苯酚溶液，振荡器混匀，再加入浓硫酸５．ＯｍＬ，振荡混匀．静置５分钟，沸水浴１５分钟，冷却至室温后于４９０ｎｍ比色测定吸光度．用ｆｕｃ／ｇａｌ（３：１）作为标准糖，配制成１０吮ｇ／ｍＬ溶液，梯度稀释，重复上面操作．根据Ａ值，制作糖含量标准曲线，对比自制多糖的＾值，求得糖含量。３．２．２硫酸根含量的测定测定多糖中硫酸根的含量，利用了多糖中释放的硫酸基与Ｂａ”生成硫酸钡的反应，采用比浊法测量¨”。分别取各多糖溶液（降解和未降解），加入等体积的２ｍｏｌ／ＬＨＣｌ混合后，转移至安焙瓶中，酒精喷灯密封．安焙瓶于１００＂Ｃ水解８小时．冷却后开启安焙瓶，内容物于６０１２减压蒸干，残渣用水溶解．取水解液０．４ｍＬ于检测试管中，加蒸馏水到１．６ｍＬ，再加入１．４ｍＬ８％的三氯乙酸和ｌｍＬ氯化钡一明胶，振荡混匀。静置１５—２０分钟，在３６０ｈｍ下测定比浊度．另一份水解溶液按同样的方法处理，只是用１．４ｍＬ明胶溶液代替氯化钡一明胶试剂．有氯化钡存在时的吸光度减去无氯化钡时的吸光度，消除水解液中所含紫外吸收位置物质的影响，差值即表示硫酸根含量．用１０蛳ｇ／ｍＬ硫酸盐作为标准品，梯度稀释，重复以上操作．根据差值绘制硫酸根含量标准曲线．对比自制多糖的Ａ值，求得多糖中的硫酸基含量。Ｓ０。’％＝（ＳＯ。’浓度／样品浓度）＊１００％３．２．３糖醛酸含量的测定多糖中糖醛酸含量的测定，采用咔唑一硫酸法“”。在具塞试管中加入硼砂硫酸液５ｍＬ，置冰浴中冷至０℃，然后再加入稀释多糖样品液１．ＯｍＬ，先轻轻振摇，再剧烈振摇，并不断用冰浴冷却．将试管加到沸水浴中加热ｌＯｍｉｎ，冷却至室温，加入０．２ｍＬ咔唑试液，摇匀。用沸水浴再加热１５ｍｉｎ，冷却至室温，于５３０ｎｍ处测光吸收山东大学硕士学位论文值。以１０吮ｇ／ｍＬ葡萄糖醛酸作为标准品，梯度稀释，重复上述操作，绘制标准曲线。样品糖醛酸含量＝糖醛酸浓度／样品浓度３．２．４多糖粘度的测定称取粗多糖各５９，溶于５００ｍＬ纯水中，在２１℃恒温条件下，使用旋转粘度计测定各粗多糖粘度。３．２．５超滤法划分分子量取配制多糖溶液１００ｍＬ进行超滤，操作压为０．７ａｔｍ，收集５０ｍＬ滤过液。检测并比较超滤前及超滤后的糖含量滤过百分比。３．２．６最佳方法提取海带多糖以上实验获得的数据进行分析，获得最佳提取方案后，以最佳方案进行超声波提取海带多糖，并进行以上方法的研究分析。３．２．７多糖对自由基的清除羟自由基的清除采用利用Ｆｅｎｔｏｎ反应取５支１０ｍＬ比色管，分别依次加入１．０ｍＬ７．５ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸亚铁铵溶液，１．０ｍＬ７．５ｍｍｏｌ／Ｌ水杨酸溶液，１．０ｍＬ７．５ｍｍｏｌ／Ｌ过氧化氢溶液，在２号一５号比色管中依次加入１．０ｍＬ的被测糖液，用去离子水定容至刻度，水浴加热１ｈ后。在５１０ｎｍ波长下测吸光度值（备注：粗多糖本身有颜色，在测定时，必须先扣除背景．按相应体积的被测物扣除背景），再计算清除率。清除率公式：清除率（％）＝（Ａ。——Ａｓ）／Ａ。｝１００％式中：＾．一未加被测物吸光度值；Ａｓ一加入被测物后吸光度值３．２．８气相色谱分析单糖含量１．多糖样品的水解多糖样品的水解同硫酸基含量的测定。２．衍生物的制各采用糖腈乙酯法。山东大学硕士学位论文水解蒸干的残渣加盐酸羟胺ｌＯｍｇ，内标肌醇六乙酸酯７ｍｇ，加入０．５ｍＬ毗啶，振荡溶解，９０＂Ｃ水浴３０ｍｉｎ并振荡，使糖转化成糖肟．取出后冷却至室温，再加入０．５ｍＬ乙酸酐，９０℃水浴３０ｍｉｎ，继续反应生成具有挥发性的糖腈乙酸酯衍生物。冷却至室温，高速离心，上清液进行气相色谱分析．标准单糖同样进行衍生处理。３．气相色谱分析条件：色谱柱：３ｍｍ＊２ｍ玻璃柱，担体：ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ．－．ＡＷ日，固定液：１０％０Ｖ－２２５ＤＭＣＳ８０—１００氢火焰检测器检测柱温：初始温度２００℃，初始时间２ｍｉｎ，程序升温速率７℃／ｍｉｎ，终止温度２４０℃，终止时间１０ｍｉｎ，２２０℃汽化室２５０℃离子室２５０℃．内标：肌醇六乙酸酯氮气流速４０ｍＬ／ｍｉｎ，氢气流速４０ｍＬ／ｍｉｎ，空气流速４００ｍＬ／ｍｉｎ３．２．９高效液相色谱法标准Ｄｅｘｔｒａｎ葡聚糖（Ｔ－ＩＯ，Ｔ－４０，Ｔ－７０，Ｔ－５００，Ｔ－２０００）配成一定浓度溶液，与多糖样品进行高效液相色谱分析．液相分析条件：色谱柱：ＴＳＫ—ＧＥＬＧ４０００ＰＷ柱示差折光检测器柱温：７０℃流动相：双蒸水进样量：２蛳Ｌ，流速：０．１５ｍＬ／ｍｉｎ在上述实验条件下，对标准Ｄｅｘｔｒａｎ葡聚糖进行液相色谱分析，根据洗脱时间对应分子量的对数值作出标准曲线．多糖溶液同样操作，根据洗脱时间对分子量的对数值做标准曲线求算多糖的分子量．４３山东大学硕士学位论文３．２．１０多糖的分离纯化称取ＤＥＡＥ－２３纤维素，依次用０．５ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ一０．５ｍ０１／ＵＨＣｌ，０．５ｍ０１／ＬＮａＣｌ，０．５ｍｏｌ几Ｈｃｌ浸泡处理成ｃｌ’型，大量水洗至中性，抽气，装５．５０ｃｍ柱，蒸馏水１．５ｍＬ／ｍｉｌｌ平衡。称取一定量海带硫酸多糖租品，加水溶解，上处理好的ＤＥＡＥ－２３Ｃ１一型柱子进行离子交换层析。开始用蒸馏水洗脱，然后分别用０．５和１．Ｏｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液进行洗脱，流速ｌＯＯｍＬ／ｈ．利用苯酚一硫酸法检测洗出液的糖含量。３．３结果分析３．３．１糖含量的测定采用苯酚一硫酸法测定传统方法以及超声波方法提取多糖的糖含量，以１００／ｚｇ／ｍＬｆｕｃ／ｇａｌ（３：１）为标准糖制作标准曲线，如图３一ｌ。捌菩鬃Ｏ２０４０６０８０硫酸基浓度（ｕｇ／ｍＬ）图３－１．Ｆｉｇ．３－１．Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ糖含量测定标准曲线ｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｕｇａｒｃｕｒｖｅ传统方法以及超声波方法提取多糖比色后与标准曲线比对，得到糖含量值，见表３—１．山东大学颈士学位论文表３一ｌ各种提取方法获得多糖的糖含量ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ该试验结果中的超声波方法提取的多糖的糖含量应用于正交试验表格２—４中进行分析，得出在试验过程中各因子的水平变化对糖含量的影响情况，影响结果如图３—２所示。５５０５００４５０ｂｏ气，名ｅ絮４００ｏ／／＼ｒ一＼趔３５０３００２５０２００×，／／＼—≥≮ｊ—＼／／＼２ｙ３实验因子水平图３－２．Ｆｉｇ．３－２．Ｃｈａｎｇｅｏｆｔｈｅ各因子各水平下糖含量的变化ｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｈｅｓｕｇａｒｉｎｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｋｉｎｄｓｏｆｌｅｖｅｌｓ由图３－２可以看出，随着提取过程中水量的增加，提取多糖的糖含量逐渐增加，但增加的效果不是很明显；随着提取时间的延长，糖含量出现先减后增的情况，这与试验初始设想相悖，分析结果产生的山东丈学硬士学位论文原因可能是正交试验的其它某个因子与提取时间之间存在一定的交互作用造成的：随着温度的升高提取多糖的糖含量逐渐增加，增加趋势较为明显；随着ｐＨ的变化，多糖含量有先增后减的情况发生，说明在过酸性或者过碱性的条件下对糖提取都是不利的。由此得到的提取糖含量的最佳的提取条件为：＾。Ｂ。Ｃ。Ｄ：。３．３．２硫酸根含量的测定采用比浊法，以标准硫酸盐制得标准曲线，见图３—３。Ｏ２Ｏ１５０ｌ基ｇ蔡ＯＯ５Ｏｉ夕硫酸根榷度（ｕｉＩＩＬ）ｃｕｒｖｅＯＯ５图３－３．Ｓ０４２－含量测定标准曲线Ｆｉｇ．３－３．ＣａｌｉｂｒａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＳ０４２一传统方法以及超声波方法提取的多糖按照同样方法于３６０ｎｍ处比色测定，结果与标准曲线进行比对，得到各样品ＳＯ。”含量如表３—２。表３－２不同提取方法获得的多糖中ＳＯ．”含量Ｔａｂ．３—２ＣｏｎｔｅｎｔｏｆｔｈｅＳＯ．２。ｉｎｔｈｅｐ０１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｋｉｎｄｓｏｆ同样将超声波方法提取的多糖的硫酸基含量的试验结果应用于正交试验表２—１中进行分析，得出在试验过程中各因子的水平变化对硫“山东大学硕士学位论文酸基含量的影响情况，影响结果如图３－４所示。８Ｏ６０＾Ｖ警；４Ｏ恻２Ｏ∥，≮’’７。ｆ≥≮７＼，，硝？醐锱●ＯＯ／八。／爻榛８０＼／＼６Ｏ１２３实验因子水平图３－４．各因子水平下Ｓ０。２。含量的变化Ｆｉｇ．３－４．ＣｏｎｔｅｎｔｏｆＳＯ‘２一ｉｎｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｋｉｎｄｓｏｆｌｅｖｅｌｓ由图３－４可以看出，随着各因子水平的变化，硫酸基含量的变化与糖含量的变化情况基本相似。海带多糖生物活性是由硫酸基引起的，因而多糖中硫酸基的含量与生物活性密切相关。由此得到的提取硫酸基的最佳条件是：Ａ。Ｂ。Ｃ。Ｄ：。３．３．３糖醛酸含量的测定采用咔唑一硫酸法测定多糖中糖醛酸含量，所得标准曲线见图３－５。ｎ５Ｏ４ｎ３０２培娶整米ｎｌＯｎｌ糖醛酸浓度（ｕｇ／ｍＬ）图３－５．糖醛酸含量测定标准曲线Ｆｉｇ．３－５．Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｇａｌａｃｉｄ４７山东大学硕士学位论文传统方法以及超声波方法提取的多糖按照同样方法测得结果与标准曲线进行比对，得到各样品糖醛酸量，见表３—３。表３－３不同提取方法获得的多糖中糖醛酸的含量Ｔａｂ．３—３Ｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｈｅｇａｌａｃｉｄｉｎｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｋｉｎｄｓｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ同样将超声波方法提取的多糖的糖醛酸含量的试验结果应用于正交试验表格２－１中进行分析，得出在试验过程中各因子的水平变化对糖醛酸含量的影响情况，影响结果如图３－６所示。舳∞柏务＜二３一，∥二～。？、，。。∥７＼～·槲程链梁、加ＹＯ２３试验因子水平图３－６．各因子水平下糖醛酸含量的变化Ｆｉｇ．３－６．ＣｏｎｔｅｎｔｏｆｔｈｅｇａｌａｃｉｄｉｎｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｋｉｎｄｓｏｆｌｅｖｅｌＳ由表３－６可以看出，与糖含量和硫酸基不同，随着时间的增加，糖醛酸的提取量逐渐减少；物料比在１：３０后提取量保持稳定；随提取温度的增加，糖醛酸的提取量先基本保持不变后又增加，这说明糖醛酸４８含量对低温不免感．由此得到的提取糖醛酸的最佳条件是：Ａ：Ｂ。Ｃ；Ｄ，。但是糖醛酸主要存在与海带多糖的褐藻胶中，而不是褐藻糖胶中，因而该提取试验结果对于最终确定最佳提取方法的影响不大。３．３．４粘废测定结果使用旋转粘度计ＮＤＪ一１，恒温２１℃情况下测定各多糖粘度情况如下：表３—４不同提取方法获得的多糖的粘度Ｔａｂ．３－４Ｖｉｓｃｉｄｉｔｙｏｆｔｈｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｋｉｎｄｓｏｆｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓ粘度是多糖分析的重要指标，可以粗略的指示出多糖的组分及分子量情况。粘度的大小是由褐藻酸含量多少以及提取多糖分子量大小共同决定的，褐藻酸含量高、提取多糖分子量大就会造成粘度偏高，反之就会偏低．由表３－４可以看出，超声波和碱提取的海带多糖的粘度普遍比传统方法中的水提取法和酶提取法低。这与超声波以及碱对海带多塘的降解作用有关。超声波提取的多糖的粘度的平均值与碱提取多糖的粘度比较，可以发现超声波提取多糖的总体粘度要低于碱提取的海带多糖，这说明超声波对多糖的降解作用更明显，或者碱提取法对藻酸的提取能力高于超声波．３．３．５超虑法进行分子量分级利用ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ超滤膜（ＭＷｌ００００、５００００、１０００００）迸行超滤，在依次使用截留分子量为１００００和５００００时，各种方法提取的多糖均全被截留，说明各种方法提取的多糖的分子量均大于５万．在使用ＭＷｌ０００００的超滤膜超滤之后，各种方法提取的多糖的截流情况如表３—５所示。表３－５不同提取方法获得的多糖的滤过率（ＭＷｌ０００００）Ｔａｂ．３－５Ｐｅｒｃｅｎｔｏｆｔｈｅｐ０１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｐａｓｓｉｎｇｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｍｅｍｂｒａｎｅ（ＭＷ１０００００）从表中我们可以看出来，除了超声波提取法的１、２外，滤过比例最大的是水提取方法，这主要的原因在于：在水提取的过程中，温度一直保持在９０１２，长时间的高温导致部分海带多糖水解。与粘度的测定结果比较，可以发现粘度高的多糖的滤过率相对就少，粘度低的多糖的滤过率相对就多，二者结果间存在着一定的对应性。３．３．６最佳提取条件据以上各组数据分析显示，最佳的提取方法应该是：Ａ３Ｂ。Ｃ。Ｄ。。但是物料比的提取结果显示，提取多糖的用水量达到３０倍和达到３５倍的结果基本持平，说明在使用超声波提取海带多糖时，水量达到３０倍时，超声波基本可以作用完全。在不浪费过多的水的情况下，优先使用３０倍水量。因此，我们最终采用的超声波提取海带多糖的方法是：Ａ２ＢＩＣ３Ｄ２。由该方法提取获得的多糖的测定理化性质并与水、酶、碱提取的多糖进行比较，结果如表３－６。山东大学硕士学位论文表３－６四种方法提取多糖的理化性质Ｔａｂ．３—６Ｐｈｙｓｉｃａｌａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａ１１ｔｈｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ超声波提取糖重（ｇ）塘含量（％）硫酸基含量（％）糖醛酸含量（％）粘度（ｋＰａ·Ｓ）超滤滤过量（％）１．２２４４．９９．Ｏ３．４３６．７３９水１．１５４７．７８．６３．６４３．４３５酶１．２５４４．６８．７３．８４１．８２６碱１．２７４０．９７．４２．８３５．２１８超声波最佳提取方法获得的多糖的理化性质与传统方法提取的多糖的理化性质的比较如图３—７，３－８，３－９，３－１０，３－１Ｉ．图３－７．四种方法提取多糖的糖重４ｋｉｎｄｓｏｆＦｉｇ．３－７．Ｗｅｉｇｈｔｏｆｔｈｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｍｅｔｈｏｄｓ由图中可以看出，提取多糖能力大小顺序依次为：碱、酶、超声波和水。但是水提取使用的温度是７０＂Ｃ，如果将温度升为９０＂Ｃ时，其对多糖的提取能力达到１．４４９，超过了其余三种方法提取的多糖重量。图中显示的结果说明；超声波提取海带多糖的能力与传统方法比较不具有优势．但这只是粗糖的提取能力，而具体情况要比较粗糖的糖含量５１来确定。图３－８．四种方法提取多糖的糖含量Ｆｉｇ．３－８．Ｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｈｅｐ０１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙ４ｋｉｎｄｓｏｆｍｅｔｈｏｄｓ由图中可以看出，在糖含量的测定结果中，多糖含量的先后顺序为：酶、水、超声波以及碱。总体看来，超声波和７０℃水的提取能力相当，而碱提取的租多糖的糖含量远远低于其余三种提取方法。图３－９．四种方法提取多糖的Ｓ０。”含量Ｆｉｇ．３—９．ＣｏｎｔｅｎｔｏｆＳＯ‘２’ｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙ４ｋｉｎｄｓｏｆｍｅｔｈｏｄｓ由图中可以看出，４种方法提取的海带多糖中硫酸基的含量大小顺序为：超声波、酶、水和碱。硫酸基含量与多糖的生物活性密切相关，从这方面看来超声波提取多糖的优势有一定的体现，而该方法保留硫酸基的能力与酶提取方法相当。图３—１０．Ｆｉｇ．３－１０．Ｃｏａｔｅｎｔｏｆ四种方法提取多糖的糖醛酸含量ｇａｌａｃｉｄｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙ４ｋｉｎｄｓｏｆｍｅｔｈｏｄｓ糖醛酸的含量主要与褐藻酸的含量有关，因而该图反应的是在海带硫酸多糖中褐藻酸的含量情况，酶提取方法所含的糖醛酸的含量最大，超声波和水提取的多糖中糖醛酸的含量相当，碱提取法所得到的多糖中糖醛酸含量最低．图３－１１．Ｐｉｇ．３－１１．Ｐｅｒｃｅｎｔ四种方法提取多糖的滤过率（ＭＷｌ０００００）ｏｆｔｈｅｐｏｌｙｓ８ｃｃｈａｒｉｄｅｓｐａｓｓｉｎｇｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｍｅｍｂｒａｎｅ（ＭＷｌ０００００）由图中可以看出，在经过截流分子量为１０００００的超滤膜后，我们发现超声波、水、酶以及碱提取方法获得的多糖的透过能力依次降低，说明这四种方法获得的多塘中的小分子量多糖含量依次降低．３．３．７羟自由基清除结果利用Ｆｅｎｔｏｎ反应发生的颜色变化，计算四种方法获得的多糖清除羟自由基的能力如表３－７．表３－７四种多糖清除自由基能力Ｔａｂ．３—７Ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｒａｔｅｏｆｔｈｅｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｂｙｔｈｅｐ０１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ由表中的结果可以看出，由超声波提取法获得的多糖的清除能力最强，远远高于其余三种方法获得多糖，传统方法中的碱提取方法清除能力最弱，尚未达到２０％。３．３．８液相分析分子量分布标准Ｄｅｘｔｒａｎ葡聚糖（Ｔ－ＩＯ，Ｔ－４０，Ｔ－７０，Ｔ－５００，Ｔ－２０００）配成一定浓度溶液，进行高效液相色谱分析，根据洗脱时间对应分子量的对数值做出标准曲线。见图３—１２。６·５６—５·５兽等５４·５４３．５１５２０２５３０洗脱时间（ｍｉｎ）图３—１２．ＨＰＬＣ测定分子量的标准曲线Ｆｉｇ．３—１２．ＣａｌｉｂｒａｔｉＯｉｌｃｕｒｖｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉＯｉｌＨＰＬＣｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｏｎ超声波提取即传统提取方法获得的多糖处理后，经液相色谱分析，图谱如图３－１３，３－１４，３－１５，３－１６。Ｐ●ｔＭ＇ｌ■ｍ＾“‘。Ｔ嘶是．．Ｎ吨ｎ卜一芎ｊｌ§ｌ～蒿，上』一一一１’。ｌ＿～～ｏ纠９．岫竹一ｒ—１—’’＇—’’—’］—‘——１—＋’’———ｒ——’———’’———１——一ａ∞舯４０——要ｊ。一，、一～一—～’，ｍ——ｒ——’１１’——Ｔ’’——ｒ—’１１—‘’—ｒ’＋—１—’——’’’＿Ｔ＇ｏ幻∞柏髫图３－１３．水挺取多糖的咿Ｌｃ曲线Ｆｉｇ．３－１３．ＨＰＬｃｇｒａｐｈｏｆｔｈｅｐｏｌｙｓｓｃｃｈａｒｉｄｅ图３一“．碱提取多糖的ＨＰＬＣ曲线Ｆｉｇ．３－１４．ＨＰＬＣｇｒａｐｈｏｆｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｂＴｈｏｔｗａｔｅｒｐａｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙａｌｋａｌｉ■Ｉ岫ｎＴｍｌｅｄｍ＇－＿㈨●Ｈ口．竹∞。烈㈠㈡㈠Ｏ＇５Ｌ一２０锚ｑ≈处２‘３０，Ｊ８一竺且＼一一ｇｒａｐｈｏｆｔｈｅｂｙｕｌｔｒａｓｏｎｉ＜———＿—’———Ｔ—’—’————Ｔ———’１—’—１—————’——１—１—＇—一１■—■Ｆ１—ｉ—ｒ＿：——１圈３－１５．超声波攫取多糖的ＨＰＬＣ曲线Ｆｉｇ．３－１５．ＨＰＬＣ图３－１５．酶提取多糖的ＨＰＬＣ曲线Ｆｉｇ．３－１５．ＨＰＬＣｇｒａｐｈｏｆｔｈｅｐ０１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｅＢｚｙｌｅｐＯｌｙ５ａｃｃｈａｒｉｄｅｅｘｔｒａｃｔｅｄ由以上四图分析，通过使用标准曲线计算各种多糖的分子量分布情况如表３－－８。表３－－８ＨＰＬＣ测定的多糖的分子量Ｔａｂ．３－８ＭｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｏｆｔｈｅｐａｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙＨＰＬＣ由图谱及计算结果可以看出，各种提取方法提取的多糖的分子量分山东大学硕士学位论文布情况有一定的差异，也有一定的相似性．四种方法获得的多糖的最大分子量各不相同，其中以超声波提取的多糖的最大分子量最大，达到４４３万。其余几种提取方法获得的多糖的最大分子量也均超过３００万：提取多糖的最小分子量多糖组分存在于水提取和超声波提取方法中，分子量仅仅超过９００。同时在不同提取方法中存在相似的多糖组分，酶提取法和超声波提取法获得的多糖中均存在分子量在３０７万一３０８万左右的糖组分；酶提取和碱提取方法获得的多糖中均存在２４０万一２５０万左右的糖组分；水提取法和超声波提取法获得的多糖中均存在分子量为９００左右的多糖组分。对不同批次的多糖的进行高效液相色谱分析，结果发现，水提取法、酶提取法以及超声波提取方法获得的不同批次的多糖的组分基本保持不变。而碱提取方法获得的多糖的分子量分布情况前后差别较大，这可能与碱本身对多糖具有降解作用以及降解位点的不同有关。３．３．９海带多糖的分离将超声波提取的多糖粗品进行分离纯化，经ＤＥＡＥ一２３Ｃ１。型柱子分离得到四个峰形组分，如图３－－１６。第一个峰是蒸馏水洗脱得到的，第二、三个峰是０．５ｍｏＩ／ＬＮａＣＩ溶液洗脱得到的。第四个峰是１．ＯｍｏＩ／ＬＮａＣＩ溶液洗脱得到的。１．６１．４１．２ｌ０．８Ｏ．６冒袁３趔蚤果Ｏ．４Ｏ．２０－ｏ．２洗脱体积（ｍＬ）图３－１６．超声波提取多糖经ＤＥＡＥ一２３纤维索进行离子交换柱层析Ｆｉｇ．２－１６．ＩｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅＤＥＡＥ－Ｃｅｌ１ｕ１０Ｓｅ２３ｏｎｔｈｅ５６山东大学硕士学位论文与传统提取方法获得的多糖经过ＤＥ＾Ｅ一２３Ｃ１。型柱子分离得到的峰形组分比较，该峰形组分的第二个峰比较明显，而在传统方法提取多糖该峰不明显．３．３．１０气相色谱分析标准单糖的气相色谱分析见图３一１７．１２３４５６７８图３－１７．标准单糖气相色谱Ｆｉｇ．３—１７．１．Ｒｈａ２．ＦｕｃＧａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｏｆ４．Ｘｙｌ５．Ｍａｎｓｔａｎｄａｒｄ７．Ｇａｌｓｕｇａｒｓ３．Ａｒａ６．Ｇｌｕ８．内标在同样的条件下，对各种提取的多糖进行气相分析，气相分析情况如图３一１８，３一１９，３—２０，３—２１所示．■···，…····，，’‘…，，…………’，·’ｏ。，·Ｐ·…’，，ｔ＿··…’·，···‘‘…；ｉ圈３－１８．酶提取多糖气相色谱Ｆｉ玉３—１８．田３－１９．水提取多糖气相色落ｔｈｅＦｉｇ．３—１９．Ｇａｓｃｈｒｏ－ａｔｏｇｒ＾ｐｈｒｏｆｔｈｅ“５ｃｈｒｏ－ａｔｏｇｒａｐｈｙｏｆｐｏｌｙ８ａｃｃｈａｒｉｄｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙ＠ａｚｙｌｅｐ０１ｙｓａｃｃｈ８ｒｉｄｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｈｏｔｗａｔｅｒ图３－２０．超声波提取多糖气相色谱Ｆｉｇ．３－２０．Ｇａｓｃｈｒｏ－ａｔｏｇｒａｐｈｙｏｆｔｈｅ圈３—２１．碱提取多糖气相色谱Ｆｉｇ．３—２１．Ｇａｓｃｈｒｏ＿ａｔｏｇｒａｐｈｙｏｆｔｈｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙａｌｋａｌｉ由以上各气相结果分析发现，４种方法提取的海带多糖的单糖组成以及含量基本相同，含有的单糖主要为鼠李糖，岩藻糖，阿拉伯糖，木糖，甘露糖以及半乳糖，它们的比例为：１３：１１：１０：９：８，这说明不同提取方法不会改变多糖的单糖组成，也不会改变单糖的结构。第四部分生物活性研究４．１材料４．１．１器材Ｃ０：培养箱超低温冰箱ＳＡＮＹ０德国西门子公司ＳＷ－ＣＪ－２Ａ水平流超净工作台ＳＺ一９３自动双重纯水蒸馏器ＦＡｌｌ０４电子天平吴江市净化设备厂上海象华化工有限公司上海天平仪器厂黄骅市综合电器厂Ｂｉ０一ＴｅｋＩｎ８ｔｒｕｍｅｎｔｓ电子恒温水浴锅酶标仪血球计数板倒置显微镜４．１．２材料上海精密仪器仪表有限公司０１ｙｍｐｕｓ大鼠胶质瘤Ｃ６细胞９６孔培养板一次性培养皿ＤＭＥＭ培养粉新生牛血清胰酶５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ实验室提供ＣｏｓｔａｒＢＥＣＴＯＮＤＩＣＫＩＮＳＯＮ，ＵＳＡＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ杭州四季青生物工程材料有限公司ＡＭＲＥＳＣＯ分装实验室提供二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）ＭＴＴ粉ＡＭＲＥＳＣＯ分装ａｍｒｅｓｃｏ硫酸庆大霉素注射液（８万单位／支）山东鲁抗医药股份有限公司４．１．３试剂４．１．３．１ＰＢＳ的配制ＮａＣＩ８０．ＯｇＫＣｌ２．ＯｇｌＯ×ＰＢＳ储存液：山东大学硕士学位论文Ｎａ２ＨＰ０４·１２Ｈｚ０２８．９９ＮａＨ２ＰＯ·２．Ｏｇ加ＤＤＷ定容至１０００ｍｌ。１×ＰＢＳ应用液：将ｌＯ×ＰＢＳ储存液稀释１０倍，高压灭菌。（培养细胞用）４．１．３．２细胞培养液ＤＭＥＭ原液：取ＤＭＥＭ粉一袋１０．４９，加入８００ｍＬ三蒸水，在磁力搅拌器上搅拌约４ｈ，待其充分溶解后，加入２９ＮａｌｔＣＯ。，继续搅拌约ｌｈ，量筒定容至１０００ｍＬ，用１ＭＨＣＬ调ＰＨ值。加入约２６滴ＨＣＬ，用ＰＨ试纸测约７．１～７．２即可（颜色呈枣红色）。加庆大霉素（按ｌｍＬ培养液加２ｕＬ庆大霉素）．抽虑灭菌，并移取３ｍＬ于小瓶中，３７℃温箱培养做无菌试验。原液放在４１２保存．ＤＭＥＭ应用液：先将灭活的小牛血清在４℃水浴中融化，取１６４０原液，加入１０％的小牛血清，做无菌试验。于４℃保存。４．１．３．３０．２５％胰酶消化液（５０ｍＬ）取出０．５％胰酶原液和０．５ｍ０１／ＬＥＤＴＡ在室温下解冻，０．５％胰酶原液ｌ×ＰＢＳ２５ｍＬ２４ｍＬ混匀后做取２ｍＬ做无菌试验。于４℃保存。４．１．３．４ＭＴＴ液（５ｍｇ／ｍＬ）称取４５ｍｇＭＴＴ（四甲基偶氮唑盐）粉，置于ｌＯｍＬ离心管中，在超净台中加入９ｍＬ无菌ＰＢＳ溶解，由于ＭＴＴ粉容易沾在称量纸上，所以在超净台中要用ＰＢＳ冲洗称量纸中剩余的ＭＴＴ粉，待ＳＴＴ粉全部溶解后，推虑灭菌。用铝薄包好于４℃避光保存。４．１．３．５小牛血清应用液取出新生牛血清原液于４＂Ｃ水浴融化，５６＂（２恒温水浴０．５ｈ灭活，分装至小瓶，一２０℃冰冻保存。４．２方法４．２．１细胞传代待细胞处于指数生长期且长满培养皿底壁时，即可传代．弃掉原来的培养液，吸取ＰＢＳ反复冲洗细胞２～３次，将死细胞和血清去除（血清可以抑制胰酶的作用）。加入０．２５％的胰酶消化，使细胞间的连接和细胞外基质都断裂，在倒置相差显微镜下观察至细胞从铺展开的梭形收缩为圆形时，移去消化液，加入１６４０应用液中止消化．用移液管吹打细胞，制成细胞悬液（倒置相差显微镜下观察），取２ｍＬ细胞悬液加入ｌＯｍＬ培养皿中，补足培养液。置３７１２培养箱中培养．４．２．２细胞培养液的更换为了保证细胞生长所需的营养，一般隔两天可以对细胞更换一次培养液用移液管将旧液全部吸出，用新管吸取１６４０应用液加入皿中。置３７１２培养箱中培养．４．２．３ｉｌＴＴ比色法测定细胞相对存活率４．２．３．Ｉ多糖溶液的配制称取超声波及传统方法提取的海带多糖溶解在双蒸水中制成ｌＯｍｇ／ｍＬ的贮液，然后再用培养液稀释到所需浓度．４．２．３．２实验步骤（１）接种细胞至９６孔板中：胰酶消化细胞，用培养基配成单个细胞悬液，以每孔２０００个左右细胞／孔接种于９６孔板，每孔培养液体积１０咄Ｌ。（２）细胞培养２４小时后（大约长至５０－６０％融合状态），加入合适浓度的多糖处理，培养２４小时后，每孔避光加入ＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）２蛳Ｌ，继续培养４小时．（３）终止培养，小心吸弃孔内培养上清夜．每孔加入１０雎ＬＤＭｓＯ，震荡１５分钟．·（４）测ＯＤ值：５７１ｎｍ波长，酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收山东大学硕士学位论文值，用以下公式计算细胞存活率：抑制细胞％＝（ＯＤ对照一０Ｄ实验一０Ｄ空白）／（ＯＤ对照一０Ｄ空白）×１００％４．３数据分析海带多糖对大鼠胶质瘤ｃ６细胞的影响情况见表４一ｌ。多糖的ＭＴＴ数据用平均数±ＳＥ表示，试验组与对照组间的差异使用Ｏｒｉｇｉｎ６．Ｏ软件分析获得。表４－Ｉ四种多糖对癌细胞的杀伤能力Ｔａｂ．４—１Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐ０１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｔｏｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＣ６ｃｅｌｌｓ·表示Ｐ＜０．０５，有显著性差异ｌ··衰示Ｐ＜ｏ．０１，有极显著性差异Ｏ．８Ｏ·６一重龟ｏ．·口ｏ０．２空白１００２００５００１００２００５００１００２００５００１００２００５００水奠碱超声波●襄示Ｐ（Ｏ·０５，有量看性差异Ｉ●●曩布Ｐ（Ｏ·Ｏｌ·有扳曼看性差异图４－－１．多糖对大鼠胶质瘤Ｃ６细胞的杀伤能力Ｆｉｇ．４－１．ＡｂｉｌｉｔｙｏｆｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｔｏｔｈｅＣ６ｃｅｌｌｓ可见提取的四种多糖中，碱提取法获得的多糖的三个浓度剃度对大鼠胶质瘤Ｃ６细胞杀伤能力均不具有显著性差异，在２００９９／ｍＬ浓度下超声波提取法的杀伤能力具有显著性差异，而酶提取法具有极显著性差异。同时除碱提取法外的三种方法获得的多糖在５０蛳ｇ／ｍＬ浓度对大鼠胶质瘤ｃ６细胞的杀伤能力均具有极显著性差异，其中以酶提取方法获得的多糖的杀伤能力最强．参考文献［１］Ｍａｒｉｅ—Ｆｒａｎｃｅｍ，Ｊｅａｎ—ＰａｕｌａＡｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍＪ．Ａｆｕｃｏｉｄａｎｆｒａｃｔｉｏｎｆｒｏｍｎｏｄｏｓｕｍ［Ｊ］．ＣａｒｂｏｈｙｄｒＲｅｓ，２００１，３３６（２）：１５５－１５９．ＡＡ，ＵｓｔｕｚｈａｎＮａＮｅ，ｅｔａ１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａ［２］Ｂｉｌａｎｍｉ，ＧｒａｃｈｅｖｆｕｃｏｉｄａｎｆｒｏｍｔｈｅｂｒｏｗｎｓｅａｗｅｅｄＦｕｃｕｓｅｖａｎｅｓｃｅｎｓ［Ｊ］．ＣａｒｂｏｈｙｄｒＲｅｓ，２００２，３３７（８）：７１９－７３０．［３］Ｄｕａｒｔｅｍｅｒ。Ｃａｒｄｏｓｏｍａ，Ｎｏｓｅｄａｍｄ，ｅｔｏｎａ１．ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌｓｔｕｄｉｅｓｆｕｃｏｉｄａｎｓｆｒｏｍｔｈｅｂｒｏｗｎｓｅａｗｅｅｄＳａｒｇａｓｓｕｍｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌｕｍ［Ｊ］．ＣａｒｂｏｈｙｄｒＲｅｓ，２００１，３３３（４）：２８１—２９３．Ｆ，Ｅ１ｌｏｕａｌｉｍ，Ｓｉｎｑｕｉｎｃ，ｅｔａ１．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ［４］ＨａｒｏｕｎＢｏｕｈｅｄｊａｂｅｔｗｅｅｎｓｕｌｆａｔｅｇｒｏｕｐＴｈｒｏｍｂａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｆｕｃａｎｓＥＪ］．Ｒｅｓ，２０００，１００（５）：４５３—４５９．Ｙａｎ．Ｆｕｃｏｘａｎｔｈｉｎｃｏｍｍｅｎａｓ［５］ＸｉａｏｊｕｎｔｈｅＭａｊｏｒｈｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｉｎＨｉＪｉｋｉａｆｕｓｉｆｏｒｍｉＳ，ａＥｄｉｂｌｅＳｅａｗｅｅｄＥＪ］．ＢｉｏｓｃｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｃｈｅｍ，１９９９。６３（３）：６０５．［６］田晓华，丛建波．褐藻硫多糖清除活性氧自由基作用及动力学的ＥＳＲ研究［Ｊ］．营养学报，１９９７，１９（１）：３２．［７】ＩｔｏｈＨ，ＮｏｄａＨ．Ａｎｔｉｔｕｍｏｒａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｍａｒｉｎｅａｌｇａｅｐ０１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｆｕｃｏｉｄａｎ，ｐｒｅｐａｒｅｄｆｒｏｍＳａｒｇａｓｓｕｍｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉｏｆｐｈａｅｏｐｈｙｃｅａｅ［Ｊ］．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒｇｅｓ，１９９３，１３：２０４５．［８］关美君，林文翰，丁源．海洋药物一一二十一世纪中国药学研究的新热点［Ｊ］．中国海洋药物，２００１，２０（１）：１．［９］Ｃｈｏｉ，ＪｆｕｃｏｉｄａｎＨ，Ｅｆｆｅｃｔｓｏｎｏｆｓｅａｔａｎｇｌｅ（Ｌａｍｉｎａｒｉａｊａｐｏｎｉｃａ）ａｎｄｏｆｏｘｙｇｅｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｔｈｅｔｈｅａｔｔａｃｋｓＫｏｒｅａｎｒａｄｉｃａｌＳｉｎｋｉｄｎｅｙ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｉｓｈｅｒｉｅｓＳｏｃｉｅｔｙ，１９９９，３２（６）：７５８．［１０］Ｃｈｏｉ，ＪＨ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｅａｔａｎｇｌｅ（Ｌａｍｉｎａｒｉａｊａｐｏｎｉｃａ）山东大学硬士学位论文ｅｘｔｒａｃｔａｎｄｆｕｃｏｉｄａｎｉｎｄｒｉｎｋｓｏｎｏｘｙｇｅｎｒａｄｉｃａｌｓａｎｄｔｈｅｉｒｓｃａｖｅｎｇｅｒｅｎｚｙｍｅｓｓｔｒｅｓｓｅｄｍｏｕｓｅ［３３．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＫｏｒｅａｎＦｉｓｈｅｒｉｅｓＳｏｃｉｅｔｙ，１９９９。３２（６）：７６４．［１１］ＣｈａｎｇｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓＨｕｏｆＸｕｅ．ＣｈｅｍｉｃａｌｓｕｌｆａｔｅｄｃｈａｒａｃｔｅｒｓａｎｄａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅＬａｍｉｎａｒｉａｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｆｒｏｍｊａｐｏｎｉｃａ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｐｐｌｉｅｄＰｈｙｃｏ］ｏｇｙ，２００１。１３：６７．［１２］李德远，许如意，周韫珍，等．褐藻岩藻糖胶对小鼠脂质过氧化的影响．营养学报，２００２，２４（４）：３８９［１３］李厚勇，王蕊，高晓奇，等．海带提取物对脂质过氧化和血液流变学的影响［Ｊ］．中国公共卫生，２００２，１８（３）：２６３．［１４］旅志仪，郭亚贞．海带褐藻糖胶的药理活性［Ｊ］．上海水产大学学报，２０００，９（３）：２６８—２７１．［１Ｓ］宋剑秋，徐誉泰，张华坤，等．海带硫酸多糖对小鼠腹腔巨噬细胞的免疫调节作用［Ｊ］．中国免疫学杂志，２０００，１６（２）：７０．［１６］王琪琳，赵子鹏．海带硫酸多糖对小鼠腹腔巨噬细胞激活及细胞毒作用的影响［Ｊ］．聊城大学学报，２００４，１７（２）：５６—５８．。一Ｃ１７］张英慧，曲爱琴，宋剑秋等．海带多糖ＦＧＳ对小鼠巨噬细胞细胞毒活性的影响［Ｊ］．免疫学杂志，２００２，１８（５）：４０３—４０５．［１８］ＳＣＡＰＰＡＴＩＣＣＩＦＡ，ＣＯＮＴＲＢＲＡＳ＾’ＢＯＳＷＥＬＬＣＡ，ｅｔａ１．ＰｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｂｌｏｃｋｓｕｐｐｏｒｔｏｆｔｕｍｏｒｇｒｏｗｔｈｉｎｍｉｃｅＣＪ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００３，２１（１９－２０）：２６６７—２６７７．［１９］ＳｃａｐｐａｔｉｃｃｉａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎａｎｄａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃｌｅｕｋｅｍｉａａｎｄＦＡ，ＳｍｉｔｈｅｎｄｏｓｔａｔｉｎａｃｔｉｖｉｔｙｓｏｌｉｄｉｎＲ，ＰａｔｈａｋｇｏｎｅＡＪｅｔａ』．ＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｔｒａｎｓｆｅｒａｎｄｉｎｄｕｃｅｓｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃｅｆｆｉｃａｃｙｉｎｖｉｔｒｏｉｎａｎｔｉｔｕｍｏｒＭｏｌｔｕｍｏｒｓｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｔｈｅｒ，２００１，３（２）：１８６—１９６．［２０］ＫｏｙａｎａｇｉＳ，Ｔａｎｉｇａｗａｎ，ＮａｋａｇａｗａＨ，ｅｔａ１．Ｏｖｅｒｓｕｌｆａｔｉｏｎｏｆｆｕｃｏｉｄａｎｅｎｈａｎｃｅｓｉｔｓａｎｔｉ—ａｎｇｉｏｇｅｎｉｅａｎｄａｎｔｉｔｕｍｏｒａｃｔｉＶｉｔｉｅｓ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｅｍＰｈａｒｍａｃｏｌ。２００３，６５（２）：１７３一１７９．［２１］ＳｏｅｄａｉｎｈｉｂｉｔＳｆｏｒｍａｔｉｏｎＳ，ＫｏｚａｋｏＴ，１ｗａｔａＫ，ｅｔａ１．ＯｖｅｒｓｕｌｆａｔｅｄｂａｓｉＣｈｕｍａｎｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｕｍｂｉｌｉｃａｌｇｒｏｗｔｈｖｅｉｎｆａｃｔｏｒｆｕｃｏｉｄａｎｔｕｂｅｔｈｅｂｙｉｎｄｕｃｅｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌＩｓ：ｉｔＳｐｏｓｓｉｂｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ，２０００，１４９７（１）：１２７－１３４．［２２］ＩＫＵＴＡＭ，ＰＯＤＹＭＡＫＡ，ＭＡＲＵＹＡＭＡＫ，ｅｔａ１．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃａｎｃｅｒｏｆｈｅｐａｒａｎａｓｅｉｎｏｒａｌＯｒａｌｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅｓａｎｄｏｒａｌｔｉｓｓｕｅｓＣＪ］．Ｏｎｃ０１，２００１，３７（２）：１７７—１８４．Ｉ。Ｇｏｌｄｓｈｍｉｄｔｏ，ＺｃｈａｒｉａＥ，ｅｔａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ［２３］Ｙｌｏｄａｖｓｋｙｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄｉｎｖｏｉｖｅｍｅｎｔｏｆｈｅｐａｒａｎａｓｅｉｎａｎｄｎｏｒｍａｌｃａｎｃｅｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，２００１，８３（８）：８３１—８３９．Ｍ，＾ｉｎｇｏｒｎＥ，ｅｔａ１．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｒａｎａｓｅ［２４］ＭｉａｏＨ０，ＥｌｋｉｎａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｔｕｍｏｒｍｅｔａｓｔａｓｉＳｂｙｌａｍｉｎａｒｉｎＳＵｌｆａｔｅａｎｄｓｙｎｔｈｅｔｉＣｐｈｏｓｐｈｒｏｔｈｉｏａｔｅｅｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ［Ｊ］．ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ，１９９９，８３（３）：４２４—４３１．［２５］ＲｏｚｋｉｎＭ．Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔａｎｄｌｉｐｏｌｙｓｉｓ—ｉｎｄｕｃｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｆｒｏｍｂｒｏｗｎｍａｒｉｎｅａｌｇａｅ［Ｊ］．ＦａｒｍａｋｏｌＴｏｋｓｏｋｏｌ，１９９１，５４（５）：４０．［２６］邓槐春．海带多糖的药理作用［Ｊ］．中草药，１９８７，１８（２）：１５．［２７］Ｃｈａｎ９２Ｍｏｋ．Ｅｆｆｅｃｔｓｅｘｔｒａｃｔａｎｄｆｕｃｏｉｄａｎｏｆｓｅａｔａｎｇｌｅ（Ｌａｍｉｎａｒｉａｊａｐｏｎｉｃａ）ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｎ１ｉｐｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆｓｔｒｅｓｓｅｄＦｉｓｈｅｒｉｅｓｍｏｕｓｅ［Ｊ］．］ｏｕｒｎａＩ３３（２）：１２４．ｏｆｔｈｅＫｏｒｅａｎＳｏｃｉｅｔ乃２０００，［２８３李德远．海带岩藻糖胶对小鼠的高胆固醇血症防治作用［Ｊ］．食品科学，１９９９，２０（１）：４５．［２９］Ｒｅｎ，Ｄａｌｉｎ．ＳｔｕｄｙｏｎａｎｔｉｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅａｎｄａｎｔｉｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉＣｅｆｆｅｃｔｓｏｆｍａｒｉｎｅａｌｇａｅ［Ｊ］．ＦｉｓｈＳｃｉ，１９９４，６０（１）：８３．［３０］詹林盛．海带多糖的免疫调节作用［Ｊ］．中国生化药物志，２００１，２２（３）：１１６．［３１］王文涛．海藻硫酸多糖对正常及免疫低下小鼠的免疫调节作用［Ｊ］．中国药理学与毒理学杂志，１９９４，８（３）：１９９．［３２】范曼芳．褐藻淀粉和褐藻淀粉硫酸酯的制取、分析及生物活性比较［Ｊ］．中国药科大学学报，１９８８，１９（１）：３０．［３３］Ｏｋａｉ，Ｙａｓｕｊｉ．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｏｆｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｉｎｅｘｔｒａｃｔｏｆＪａｐａｎｅｓｅｅｄｉｂｌｅｓｅａｗｅｅｄ，Ｌａｍｉｎａｒｉａｊａｐｏｎｉｃａ［Ｊ］．，＆ｉＦｏｏｄＡｇｒｉＧ１９９６。７２（４）：４５５．［３４】薛静波，刘希英，张鸿芬．海带多糖对小鼠腹腔巨噬细胞的激活作用阴．中国海洋杂志，１９９９，７１（３）：２３［３５］王重庆．分子免疫学基础［Ｍ］．北京大学出版社，１９９７：１２７．［３６］Ｚｖｙａｇｉｎｔｓｅｖａ，ＴａｔｉａｎａＮ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｓｏｍｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｆａｒ‘’ｅａｓｔｅｒｎｆ？Ｔｏｘｉｃｏｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎｂｙｗａｔｅｒ—。ｓｏｌｕｂｌｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｏｆｂｒｏｗｎｓｅａｗｅｅｄｓ［Ｊ】．Ｃｏ＝ｐＢＪｏｃｈｅｍＰｈｙｓｉｏＬＰａｒｔＰｈａｒｍａｃｏｌ，２０００，１２６Ｃ（３）：２０９．［３７］ＫＵＺＮＥＴＳＯＶＡａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＯｋｈｏｔｓｋＴＡ，ＢＥＳＥＤＮＯＶＡＮＮ，ＭＡＭＡＥＶＡＮ，ｅｔａ１．ＡｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｅｖａｎｅＢｃｅｎｓｆｕｃｏｉｄａｎｆｒｏｍｂｒｏｗｎａｌｇａｅＦｕｃｕｓＥｘｐｏｆｔｈｅＳｅａ［Ｊ］．ＢｕｌｌＢｉｏＩＭｅｄ，２００３，１３６（５）：４７１—４７３．ｔｈｅ［３８］ＮＩＳＨＩＮＯＴ，ＦＵＫＵＤＡＡ。ＮＡＧＵＭＯＴ，ｅ￡ａ１．ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆａｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｒｏｍｒｉｎａｎｄｆａｃｔｏｒＸａｂｙｓｅａｗｅｅｄ点ｃｋｌｏｎｉａｆｕｃｏｉｄａｎｆｒｏｍｔｈｅｂｒｏｗｎｋｕｒｏｍｅ［Ｊ］．ＴｈｒｏｍｂＲｅｓ，１９９９，９６（１）：３７—４９．［３９］ＶＡＲＥＮＮＥＡ，ＧＡＲＥＩＬＰ，ＣＯＬＬＩＥＣ—ＪＯＵＡＵＬＴＳ，ｅｔａ１．ＣａｐｉｌｌａｒｙｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉＳｂｉｏａｃｔｉｖｅｂｉｎｄｉｎｇａｆｆｉｎｉｔｙｏｆｏｆｔｈｅｓｕｌｆａｔｅｄｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｓｔｕｄｙｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｆｕｅｏｉｄａｎｔｏａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ［Ｊ］．ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ，２００３，３１５（２）：１５２—１５９．［４０］ＧＡＷＡＺＭ．Ｒｏｌｅｏｆｐｌａｔｅｌｅｔｓｉｎｃｏｒｏｎａｒｙｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓａｎｄｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｏｆｉｓｃｈｅｍｉｃｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ［Ｊ］．ＣａｒｄｉｏｖａｓｃＲｅｓ。２００４。６１（３）：４９８—５１１．［４１］ＴＳＥＬＥＰＩＳＡＤ，ＪＯＨＮＣＨＡＰＭＡＮＭ．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ｂｉｏａｃｔｉｒｅｌｉｐｉｄｓａａｎｄａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉＳ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌｒｏｌｅｓｏｆｌｉｐｏｐｒｏｔｅ—ａｓＳＯＣｉａｔｅｄｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅＡ２．Ｐｌａｔｅｌｅｔａｃｔｉｖａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ—ａｃｅｔｙｌｈｙｄｒ０１ａｓｅ［Ｊ］．ＡｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒＳｕｐｐｌ，２００２，３（４）：５７—６８．［４２］彭波，项辉，赵金华，等．褐藻多糖硫酸酯影响血小板聚集及血栓形成［Ｊ］．中山大学学报论丛，２００２，２２（１）：２３６—２４０．［４３］潘家祜，陈阳，常建杰，等．褐藻多糖硫酸酯抗ＰＡＦ作用研究［Ｊ］．中国海洋药物杂志，２００３，９３（３）：７一１０．［４４］彭波，许实波，许东辉，等．褐藻多糖硫酸酯的抗凝和纤溶活性ＣＪ］．中草药，２００１，３２（１１）：１０１５—１０１８．［４５］ＮｏｎＩＳＨＩＮＯＴ。ＹＡＭＡＵＣＮＩＴ，ＨＯＲＩＥＭ，ｅｔａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎｂｙｕ２Ｐｈａｎｄａｆｕｃｏｉｄａｎｔｈｅｔ２ＰＡ［Ｊ］．ＴｈｒｏｍｂＲｅｓ，２０００。９９（６）：６２３—６３４．［４６３ｏｎＤＵＡＲＴＥＭＥＲ。ＣＡＲＤＯＳＯＭＡ，ＮＯＳＥＤＡ如，口￡ａ１．ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌｓｔｕｄｉｅｓｆｕｃｏｉｄａｎｓｆｒｏｍｔｈｅｂｒｏｗｎｓｅａｗｅｅｄＳａｒｇａｓｓｕｍｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌｕｍ［Ｊ］．ＣａｒｂｏｈｙｄｒＲｅｓ，２００１，３３３（４）：２８１—２９３．ＢＯＵＨＥＤＪＡＦ，ＥＬＬＯＵＡＬｓ［４７］ＨＡＲＯＵＮＩＭ，ＳＩＮＱＵＩＮＣ，ｅｔａ１．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｓｕｌｆａｔｅｇｒｏｕｐｏｆａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｆｕｅａｎｓ［Ｊ］．ＴｈｒｏｍｂＲｅｓ，２０００，１００（５）：４５３—４５９．Ｌ，ＦＯＵＣＡＵＬＴＡ，ＣＨＡＵＢＥＴＦ，ｏｔａ１．Ｆｕｒｔｈｅｒｄａｔａｏｆｂｒｏｗｎｓｅａｗｅｅｄｆｕｃａｎｓ：ｒｅｌａｔｉｏｎｓｂｉｐｏｎ［４８］ＣＨＥＶＯＬＯＴｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｗｉｔｂａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．ＣａｒｂｏｈｙｄｒＲｅｓ，１９９９，３１９（１２４）：１５４—１６５．［４９］邢杰，刘守涛，高君，等．海带多糖的提取及组份Ｌ１的分离与鉴定［Ｊ］．抚顺石油学院学报，１９９８，１８（１）：８．［５０］张彦民，李宝才，朱利平．海带中硫酸酯化多糖提取研究［Ｊ］．云南化工，２００３，３０（５）：２８．山东大学硕士学位论文［５１］刘秀河，毕德成．提高海带功能性成分提取率的研究［Ｊ］．食品工业科技，１９９９，２０（３）：２９．［５２］李林，罗琼，张声华．海带多糖的分类提取、鉴定及理化特性研究［Ｊ］．食品科学，２０００，２１（４）：２８．［５３］葛菲．超声波技术的应用现状及发展前景［Ｊ】．郑州牧业工程高等专科学校学报．１９９９．１９（１）：５８－５９．［５４］应崇福等．超声学［Ｍ］．科学出版社，１９９３．［５５］郭孝武，谢国莲．超声提高益母草总碱提出率的实验研究［Ｊ］．中国中药杂志，１９９７，２２（６）：３５３—３５４．［５６］郭孝武，林书玉，王蕊娥．不同频率超声对提芸香甙成分的影响［Ｊ］．陕西师范大学学报（自科版），１９９６，２４（１）：５０—５２．Ｅ５７］廖建民，张瑾，沈子龙．超声波法提取海带多糖的研究［Ｊ】．药物生物技术，２００２，９（３）：１５７．［５８】王谦，黄猛，赵兵．气升式反应器超声破碎海带提取硫酸酯多糖［Ｊ］．过程工程学报，２００１，１（１）：５８．［５９】刘轲，王琪琳，吕辉，等．海带硫酸多糖的提取、纯化及理化分析［Ｊ］．中国生化药物食品与发酵工业杂志，２００２，２３（３）：１－１４．一．【６０］张全斌．镣祖洪．褐藻多糖硫酸酯化学研究的进展［Ｊ］．中国海洋药物１９９６：（４）：３８—４１．［６１］刘晓慧，张翼伸．海带中褐藻糖胶的分析纯化与结构研究［Ｊ］．生物化学与生物物理学报１９９２，２４（４）：２７９～３０．［６２］张惟杰．糖复合物生化研究技术［Ｍ］．第１版．浙江大学出版社，１９９４。１９１．山东大学硕士学位论文致谢衷心感谢我的恩师曲爱琴教授！我的毕业论文是在曲老师的悉心指导下完成的，在这三年的学习中，曲老师无论在学习上还是生活上都给予了我无微不至的关怀和帮助，曲老师平易近人的做人风格，踏踏实实的工作作风以及一丝不苟的研究精神使我受益终身．感谢李守玲老师和张华坤老师，是她们的热情帮助使我的毕业论文顺利的完成，也感谢她们在生活上给予我的关心。还要感谢已经毕业的岳真师姐在学习生活上对我的关心，感谢实验室的毕玉琦、孙静、李婷、靳增明、王磊、李彦纪、翟发涛、葛序宾同学的帮助．同时感谢盂宁和牛文同学在细胞试验中给予我的帮助和指导。最后深深的感谢我的父母家人，我取得的每一点成绩都倾注着他们的心血。已撰写待发表论文１、超声波技术提取海带多糖研究２、超声波及传统方法取海带多糖的活性研究海带多糖的分离纯化及活性研究

作者：

学位授予单位：

刘海光山东大学

1.学位论文 徐中平 海带多糖的分离纯化、理化性质分析和抗肿瘤活性的研究 1999

该文就海带多糖提取纯化、理化性质、和抗癌活性作用作了初步的研究，海带多糖的种类范围较广，从众多的级分中分离到高活性的物质，仍是今后工作的重点。目前褐藻糖胶（fucoidan）的结构研究，仍未定论，绝大部分药理研究仍处于临床前研究阶段。

2.学位论文 蒋琼 中国对虾血淋巴凝集素的分离纯化及其性质研究 2001

该论文重点研究了一种重要的对虾体液免疫因子-凝集素的各种性质,包括成虾血淋巴中的凝集素对各种动物红细胞的凝集效价以及其随季节、体长等因素的变化.同时研究了对比了不同虾种之间,针对同一种红细胞的凝集效价.通过筛选多种糖类、糖蛋白,最终找到了中国对虾血淋巴凝集素的特异性抑制糖类-海带多糖(FGS).海带多糖是一种有良好应用前景的药用多糖,具有一定免疫调节作用.用两种方法从中国对是的血清中提纯了海带多糖特异性抑制凝集素,一种方法是利用该糖的性质,制备了亲和纤维素树脂柱;另一种方法是利用传统的离子交换柱,将血清进行两次连续过柱得到的.将两种方法得到的凝集素进行了对比,发现性质非常接近,认为是一种物质,命名为中国对虾素(chinesin).对中国对虾素的各种性质时行了研究,与已经提纯的其他虾种的凝集素进行了对比.

3.期刊论文 张英慧.曲爱琴.宋剑秋.王琪琳.徐中平.王海仁 海带多糖FGS对小鼠巨噬细胞细胞毒活性的影响 -免疫学杂志2002,18(5)

海带多糖抗肿瘤活性的研究一直为人们所关注[1,2].我们采用酶解配合多种柱层析的方法从海带中分离纯化出一种岩藻-半乳聚糖硫酸酯(fucoidan-galactosan sulfate,FGS)[3],前期的实验工作表明,FGS对体外培养的肿瘤细胞S180无直接杀伤作用.多糖的药物活性往往与免疫作用机制有关[4,5],本实验利用体外培养的S180细胞检测了FGS对小鼠腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophages, PMΦ)细胞毒活性的影响.

4.期刊论文 王海仁.席振乐 酶法生产海带多糖 -精细与专用化学品2002,10(22)

人直接食用海带摄取的营养物质和海带多糖的量极少.应用酶解技术将纤维质和果胶质水解,提取出细胞质和细胞间液,再经分离纯化可提取海带多糖.山东大学和荣成市水产研究所承担\"应用生物技术对海带及海带多糖综合开发研究\"的国家\"九五\"重点攻关专题,开发了酶法生产海带多糖技术,可以生产不同规格的多种海带多糖,所得产品能提高正常小鼠和荷瘤小鼠巨噬细胞吞噬功能、激活脾淋巴细胞活性、拮抗CY引起小鼠白细胞减少、抑制肿瘤、调节血糖和血脂.

5.期刊论文 刘群 海带硫酸多糖的分离纯化研究 -河北渔业2008(5)

酶解法提取得海带多糖.分别经过季铵盐沉淀法、乙醇沉淀法、离子交换层析、凝胶层析进行纯化后,酶解海带液的回收率达60%,提取率为3.2%.

6.学位论文 陈晓菁 植物与微生物细胞壁糖的荧光辅助糖电泳分析 2005

糖是生物体重要的结构成分和功能成分。寡糖更是许多生物过程的主要参与者。植物和微生物细胞壁是功能性寡糖的重要来源。本文采用碱提法从啤酒酵母细胞壁和干牧草粉中提取出碱溶性细胞壁多糖，采用结晶法从牧草碱提液中分离纯化出木寡聚糖，采用水提法从海带的细胞间质提取出水溶性胞外多糖，并用酸水解法获得碱溶性酵母细胞壁多糖和海带水溶性胞外多糖的水解产物。用荧光辅助糖电泳对上述寡糖或细胞壁多糖的水解产物进行分析，并与淀粉盐酸水解液的糖电泳结果作了比较。 荧光辅助糖电泳(FACE)是一种快捷、花费少的分离糖类方法。寡糖首先经8-氨基萘基-1,3,6-三磺酸(ANTS)胺化还原衍生，此反应过程在所给实验条件下需要16h。然后，ANTS衍生的寡糖在由32％丙烯酰胺-2.4％双丙烯酰胺组成的碱性分离胶上电泳从而得以分离。此方法无需专门的仪器和操作熟练的技术人员。 实验结果表明：1.水溶性淀粉酸水解的寡糖混合物在荧光辅助糖电泳中形成一系列电泳谱带，其中依次含有与葡萄糖和麦芽糖对应的谱带，这一结果表明水溶性淀粉的水解产物的电泳图谱能准确给出寡糖的连续聚合度梯度，因而，可以在本研究工作中作为寡糖分子量标尺。 2.α型多糖的酸水解产物类似淀粉，在荧光辅助糖电泳中形成一系列电泳谱带。具有β(1→3)连接的海带多糖和β(1→4)连接的纤维素可以在一定条件下被酸水解，选择一定种类的酸，控制酸浓度和水解时间，仍能获得一定量的寡糖混合物。碱提取方法也是获得寡糖混合物的重要途径，例如来自酵母菌细胞壁的甘露聚糖和来自植物秸秆细胞壁的α型寡聚糖混合物。 以上结果表明，本文使用的荧光辅助糖电泳是一种值得推广的寡糖类物质分离检测的方法。借助寡糖标尺使用，该方法将促进对多糖水解产物和寡糖混合物的快速分析。

7.学位论文 黎柳君 青稞β-1，3-葡聚糖酶的纯化、性质及抗体制备 2006

β-1,3-葡聚糖酶[EC 3.2.1.39]存在于大多数高等植物中。按植物种类、生理发育期或细胞定位的不同，认为存在一个同功酶家族，可按分子量、等电点、蛋白－级结构、细胞定位、作用方式分为多种类型。β-1，3-葡聚糖酶在细胞分裂，小孢子发生，胚发生等生理发育活动中起作用，且很有可能参与植物抵抗真菌的防御反应，是一类重要的与病程相关的蛋白(PR-2)。青稞是我国青海、西藏地区特有的高原耐寒作物，有报道认为青稞种子中含有较高的β-1，3-葡聚糖酶。 本实验将萌发的青稞种子经醋酸钠缓冲液抽提，50％～85％硫酸铵分级沉淀，DEAE-Cellulose 52，CM-Sephamse(Fast Flow)离子交换层析和SephadexG-75分子筛层析，得到具活性的β-1,3-葡聚糖酶。SDS-PAGE检测显示分子量27 kDa左右的主带(95％)。以海带多糖为底物做酶学性质研究表明：纯化的β-1,3-葡聚糖酶最适反应温度35℃，最适反应pH值范围5.0～5.5之间，Km为0.59mg/mL。β-1,3-葡聚糖酶是一种热敏感蛋白，随温度升高，酶活力下降。外加Ca<'2+>对酶有激活作用，激活作用不明显，这与Manners D.J等报道的一致；Pg<'2+>对酶有抑制作用，且抑制效果明显。蛋白荧光光谱分析也表明金属离子可能与酶分子的侧链基团作用，使酶分子中的Trp和Tyr残基的微环境发生了改变。 本文还将纯化的β-1,3-葡聚糖酶对新西兰兔进行免疫制备抗血清，双向免疫扩散测定效价为1:64。免疫印迹分析表明：制备的兔抗青稞β-1,3-葡聚糖酶抗血清能对青稞和小麦种子粗酶液中的27 kDa β-1,3-葡聚糖酶进行特异性检测；另外，分别在青稞粗酶液67 kDa处检测到1条微弱杂交带，小麦35kDa，67 kDa处检测到2条杂交带，推测可能是粗酶液中存在相应分子量的与此β-1,3-葡聚糖酶氨基酸序列相似的同功酶，从而导致免疫交叉反应。对萌发不同时期的青稞、小麦种子β-1,3-葡聚糖酶活性测定显示粗酶液活性均呈上升趋势，且青稞粗酶液活性远高于小麦，这可能与青稞本身的耐寒性有关。抗血清在青稞种子剖面的原位杂交认为在种子外种皮、珠孔胚乳和胚中β-1,3-葡聚糖酶含量较多，符合先前文献关于酶在种子萌发过程中定位的报道。

8.学位论文 李华 嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilium）热稳定性β-1，3-葡聚糖酶的纯化 特性及cDNA克隆 2008

β-1,3-葡聚糖酶属于水解β-葡聚糖的葡聚糖酶系,在自然界中存在广泛。β-1,3-葡聚糖酶参与生物的生长发育、新陈代谢等生理过程,是植物抗真菌病的重要物质之一。低分子量β-1,3-葡聚糖对异体宿主防御系统具有较强的诱导和活化作用,是一种免疫系统的活化剂。β-1,3-葡聚糖酶可应用于啤酒和葡萄酒酿造工程中酒的澄清、作为饲料添加剂、酵母原生质体制备、多糖的改性增溶、植物有害真菌防治与真菌细胞壁结构分析、医疗保健等方面。 来源于嗜热真菌的各种酶,因为他们的热稳定性,引起了研究者们的高度关注。目前,虽然有部分研究报告报道了一些来源于真菌的β-1,3-葡聚糖酶,但是还未见有关嗜热真菌的热稳定性β-1,3-葡聚糖[酶的报道。嗜热毛壳菌(C. thermophilum)是一种广泛分布的嗜热真菌,是真核生物中生长上限温度很高的一种真菌。本研究分离纯化了嗜热毛壳菌的一种胞外β-1,3-葡聚糖酶,并研究了他的部分生理生化特性,并且对嗜热毛壳菌的β-1,3-葡聚糖酶cDNA进行了克隆。 嗜热毛壳菌 (C. thermophilum)在以麦麸为碳源的培养基中诱导产生的胞外β-1,3-葡聚糖酶粗酶液经80％饱和(NH4)2SO4沉淀、Phenyl-Sepharose疏水层析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析和凝胶层析等步骤获得了凝胶电泳蛋白带单一的β-1,3-葡聚糖酶。所得样品的比活力为45.4 U·mg-1,纯化倍数17.2倍,活力回收率为26.24。SDS-PAGE测得所分离纯化酶蛋白的分子量约为76.3kDa。 分离得嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶的最适反应温度和pH分别为60℃和6.0。在pH6.0条件下,该酶在50℃以下稳定,60℃保温60min后,仍保留90％的酶活性,70℃的半衰期为20min。

在酶与底物反应的条件下,加入不同的12种金属离子,使其终浓度为0.05mol/L,以不加金属离子的酶活为100％,测定其相对酶活。不同金属离子对酶活力的影响测定结果表明,Ca2+、Na+、对酶有激活作用；而一些重金属离子如Co2+、Zn2+、Mg2+、Al3+、Fe2+、Cu2+、Ag+对酶有显著的抑制作用；K+、Mn2+、Ba2+对酶活的影响不大。利用液相色谱分析β-1,3-葡聚糖酶水解海带多糖产物表明分离纯化得到的β-1,3-葡聚糖酶是外切型β-1,3-葡聚糖酶。 采用Edman降解法测定嗜热毛壳菌(C. thermophilum)β-1,3-葡聚糖酶N端8个氨基酸的序列为HWLGDIPH。与Genbank中其他真菌β-1,3-葡聚糖酶的氨基酸序列同源性不高,氨基酸序列中只有WL和D与个别真菌β-1,3-葡聚糖酶氨基酸序列有一定的同源性。 在麦麸诱导培养基上接种嗜热毛壳菌(C. thermophilum),诱导产β-1,3-葡聚糖酶,接种4天后在培养基表面刮取菌丝,提取mRNA经反转录后获得cDNA。根据测得的纯化的C. thermophilum热稳定β-1,3-葡聚糖酶的N-端氨基酸序列和其他微生物β-1,3-葡聚糖酶同源保守序列设计简并引物,通过RT-PCR的方法,克隆了该嗜热毛壳菌

(C.thermophilum)的两个编码β-1,3-葡聚糖酶的cDNA片段glu-N和glu-I,Genbank的登陆号分别为EU744253和EU746500。β-1,3-葡聚糖酶基因glu-I的cDNA序列为1267bp,包含一个1263bp的开放阅读框ORF,编码421个氨基酸的蛋白质,β-1,3-葡聚糖酶基因glu-N的cDNA序列为1273bp,包含一个1269bp的开放阅读框ORF,编码423个氨基酸的蛋白质。两段序列编码区推测出的氨基酸序列与真菌β-1,3-葡聚糖酶氨基酸序列同源性比较,β-1,3-葡聚糖酶基因glu-N编码氨基酸序列与Ampelomyces quisqualis,Coniothyrium minitans β-1,3-葡聚糖酶氨基酸的同源性为52％,β-1,3-葡聚糖酶基因glu-I编码氨基酸序列与Aspergillus fumigatus, Hypocrea lixii, Cochliobolus carbonum β-1,3-葡聚糖酶氨基酸的同源性为47％；且β-1,3-葡聚糖酶基因glu-N和glu-I编码氨基酸序列包含β-1,3-葡聚糖酶的保守序列QQFT-RN、IQTETPY-QP,该区域可能与β-1,3-葡聚糖酶的催化活性相关。本研究克隆得到嗜热毛壳菌(C. thermophilum)的两个β-1,3-葡聚糖酶的新基因。

本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Thesis_Y1065902.aspx

下载时间：2009年11月8日