1 原理
沙门氏菌的检测需要四个连续的阶段见下图：
1.1 用非选择性液体培养基预增菌
将试料接种到缓冲蛋白胨水（BPW），在36℃±1℃下培养16~20h。（样品中可能存在少量的沙门氏菌却含大量的肠杆菌科的其他菌，所以选择性增菌是必须的；为了检测受伤的沙门氏菌，常须进行预增菌。） 1.2 在选择性液体培养基上增菌
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2012-XX-XX 定稿 GB4789.4—2010 食品微生物学检验沙门氏菌检验 审核人 批准人 编制人 将1.1中的培养物接种到四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液和亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液中。于TTB增菌液内42℃±1℃培养18h～24h；SC 增菌液内36℃±1℃培养18h～24h。 1.3 初步筛选
将1.2的培养物接种到以下两个选择性培养基：亚硫酸铋（BS）琼脂、木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂，于36℃±1℃分别培养40h～48h（BS 琼脂平板）或18h～24h（XLD 琼脂平板），根据菌落特性，辨别可疑沙门氏菌菌落。 1.4 再次筛选
挑出1.3中的可疑沙门氏菌菌落，在沙门氏菌显色培养基中培养再次筛选，再用合适的生化和血清学试剂进行鉴定。
2 试剂与仪器
2.1所用器具
三角烧瓶、玻璃珠、具塞试管、培养皿、1000μL枪头、5mL枪头、称量勺、接种环、接种针
2.2 仪器：分析天平、恒温培养箱、微型振荡器、超净工作台、高压灭菌锅 2.3 所用试剂和培养基
2.3.1 缓冲蛋白胨水培养基（BPW）
称取BPW培养基20.1g，加入蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，以90mL/瓶分装到各锥形瓶，并于121℃灭菌15 min，冷至常温。 2.3.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液
取TTB增菌液基础93.6g，加入蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装于锥形瓶中，每瓶100mL。
将锥形瓶放入灭菌锅中，121℃灭菌20min；冷至30℃，每100mL基础培养基中加入TTB配套试剂碘液和煌绿各一支（开启前用75%酒精棉消毒西林瓶表面），混合均匀。 2.3.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液
取SC培养基23g，加入蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装锥形瓶，冷至常温备用。
2.3.4 亚硫酸铋（BS）琼脂
称取BS基础培养基39.3g，加入蒸馏水950mL，搅拌加热煮沸至完全溶解。 称取亚硫酸铋指示剂8g，加入蒸馏水50mL，隔水加热至50℃左右溶解。
在无菌环境中，将5mL亚硫酸铋指示剂溶液加入已冷至50℃左右的95mLBS基础培养
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2012-XX-XX 定稿 GB4789.4—2010 食品微生物学检验沙门氏菌检验 审核人 批准人 编制人 基中，混合均匀，倾注平板，备用。（为验证培养基无菌，可将空白平板在烘箱中培养24h） 2.3.5 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂
称取XLD培养基56.93g，加入蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，待冷至50℃倾注平板，备用。（为验证培养基无菌，可将空白平板在烘箱中培养24h）
2.3.6 沙门氏菌属显色培养基、三糖铁琼脂培养基（TSI）、 蛋白胨水、靛基质试剂、尿素琼脂（pH 7.2）、氰化钾（KCN）培养基、赖氨酸脱羧酶试验培养基、糖发酵管、邻硝基酚β-D半乳糖苷（ONPG）培养基
3、操作步骤
3.1 配制BPW培养基（第一天）
3.2 培养基冷却至室温后，对培养基和整个房间进行紫外灭菌15分钟, 关灯60 min后使用。（第一天） 3.3 预增菌（第一天）
称量样品10g至含BPW培养基的锥形瓶，并及时盖上盖子，150rpm下振荡10min，于36℃±1℃培养18h左右。
3.4 配制TTB 和SC增菌液（第一天） 3.5 增菌（第二天） 3.5.1 接种和培养
轻轻摇动培养过的样品混合物，移取 1mL，转种于10mL TTB增菌液内，于42℃±1℃培养18h～24h。同时，另取1mL，转种于10mL SC 增菌液内，于36℃±1℃培养18h～24h。 3.5.2 培养现象 菌名 菌号 伤寒沙门氏菌 CMCC(B)50071 鼠伤寒沙门氏菌 CMCC(B)50115 大肠埃希氏菌 ATCC25922 生长状况 良好 良好 不生长 TTB培养特征 静置后浑浊 静置后浑浊 静置后清亮 SC培养特征 变红，混浊 变红，混浊 不变 3.6 配制BS和XLD琼脂平板（第二天） 3.7 分离培养（第三天）
分别用接种环取增菌液 1 环，划线接种于一个BS 琼脂平板和一个XLD 琼脂平板。于36℃±1℃分别培养40h～48h（BS 琼脂平板）或18h～24h（XLD 琼脂平板），观察各平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表1。
表 1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征
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2012-XX-XX 定稿 GB4789.4—2010 食品微生物学检验沙门氏菌检验 审核人 批准人 编制人 沙门氏菌 菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈BS 琼脂 黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。 蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为HE 琼脂 黄色，中心黑色或几乎全黑色。 XLD 琼脂 菌落黑心，培养基变黄色或不变色。 沙门氏菌属显色培养基 按照显色培养基的说明进行判定。 选择性琼脂平板 3.8 再分离（第四天）
对于在BS和XLD平板上的疑似菌落，可以接种至沙门氏菌显色培养基上进行再鉴定。如果还是疑似菌落，则进行生化试验。 3.9 生化试验（生化试验管可以直接购买）
3.9.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2 个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。
表2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果 赖氨酸脱羧酶初步判断 斜底层 产气 硫化氢 实验培养基 面 K A ＋（－） ＋（－） ＋ 可疑沙门氏菌属 K A ＋（－） ＋（－） － 可疑沙门氏菌属 A A ＋（－） ＋（－） ＋ 可疑沙门氏菌属 A A ＋/－ ＋/－ － 非沙门氏菌 K K ＋/－ ＋/－ ＋/－ 非沙门氏菌 注：K：产碱，A：产酸；＋：阳性，－：阴性； ＋（－）：多数阳性，少数阴性；＋/－：阳性或阴性。 三糖铁琼脂
3.9.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂 （pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h，按表3 判定结果。将已挑菌落的平板储存于2℃～5℃或室温至少保留24h，以备必要时复查。
表3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 反应序号 硫化氢（H2S） 靛基质 pH 7.2尿素 氰化钾（KCN） 赖氨酸脱羧酶 A1 ＋ － － － ＋ A2 ＋ ＋ － － ＋ 4
2012-XX-XX 定稿 GB4789.4—2010 食品微生物学检验沙门氏菌检验 审核人 批准人 编制人 A3 － － － 注：＋阳性；－阴性；＋/－阳性或阴性。 － ＋/－
3.9.3 反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶3 项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌。 如有2项异常为非沙门氏菌。
表4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
pH 7.2 尿素 氰化钾（KCN） 赖氨酸脱羧酶 判 定 结 果 － － － 甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果） － ＋ ＋ 沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特性） ＋ － ＋ 沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果） 注：＋表示阳性；＋表示阴性。 3.9.4 反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。
3.9.5 反应序号A3：补做ONPG。ONPG 阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。 3.10 权威性确认
对于疑似沙门氏菌，可进一步进行血清学鉴定或者送专门菌种鉴定中心进行鉴定
4、结果表示
根据分析结果，10克样品中存在或者不存在沙门氏菌。
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