与肝癌诊疗相关的7种血清外泌体miRNAs及其应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 108103202 A(43)申请公布日 2018.06.01

(21)申请号 201810181705.6(22)申请日 2018.03.06

(71)申请人 苏州吉玛基因股份有限公司

地址 215123 江苏省苏州市工业园区东平

街199号

申请人 上海吉玛制药技术有限公司(72)发明人 胡荣宽　赵毓斌　王晓娜　薛小峰　

张佩琢　(74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限

公司 11245

代理人 关畅　何叶喧(51)Int.Cl.

C12Q 1/6886(2018.01)A61K 31/7105(2006.01)A61P 35/00(2006.01)

()发明名称

与肝癌诊疗相关的7种血清外泌体miRNAs及其应用(57)摘要

本发明公开了与肝癌诊疗相关的7种血清外

本发明首次发现了血清外泌体miRNAs及其应用。

泌体中的hsa-miR-122、hsa-miR-125b、hsa-miR-145、hsa-miR-192、hsa-miR-194、hsa-miR-29a和hsa-miR-106a可作为肝癌的生物标志物，具有较高诊断价值，为临床提供快速准确的诊断方式，使肝癌的诊断更加方便易行。本发明还进一步发现抑制特异miRNA，可以抑制肝癌细胞增殖/生长，为临床治疗肝癌奠定了基础。

C12N 15/11(2006.01)

权利要求书5页 说明书10页

序列表6页 附图3页

CN 108103202 ACN 108103202 A

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1/5页

1.抑制特异miRNA的物质在制备产品中的应用；

所述特异miRNA为如下(a1)和/或(a2)和/或(a3)和/或(a4)和/或(a5)和/或(a6)和/或(a7)：

(a1)hsa-miR-106a；(a2)hsa-miR-192；(a3)hsa-miR-122；(a4)hsa-miR-194；(a5)hsa-miR-29a；(a6)hsa-miR-125b；(a7)hsa-miR-145；

所述产品的功能为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：(b1)抑制肝癌细胞增殖；(b2)抑制肝癌细胞生长；(b3)抑制肝癌细胞侵袭；(b4)治疗肝癌。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：抑制hsa-miR-106a的物质为序列表的序列31所示的单链RNA。

3.包裹有抑制特异miRNA的物质的外泌体在制备产品中的应用；

所述特异miRNA为如下(a1)和/或(a2)和/或(a3)和/或(a4)和/或(a5)和/或(a6)和/或(a7)：

(a1)hsa-miR-106a；(a2)hsa-miR-192；(a3)hsa-miR-122；(a4)hsa-miR-194；(a5)hsa-miR-29a；(a6)hsa-miR-125b；(a7)hsa-miR-145；

所述产品的功能为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：(b1)抑制肝癌细胞增殖；(b2)抑制肝癌细胞生长；(b3)抑制肝癌细胞侵袭；(b4)治疗肝癌。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：抑制hsa-miR-106a的物质为序列表的序列31所示的单链RNA。

5.序列表的序列31所示的单链RNA。

6.包裹有序列表的序列31所示的单链RNA的外泌体。7.特异miRNA在制备产品中的应用；

所述特异miRNA为如下(a1)和/或(a2)和/或(a3)和/或(a4)和/或(a5)和/或(a6)和/或(a7)：

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(a1)hsa-miR-106a；(a2)hsa-miR-192；(a3)hsa-miR-122；(a4)hsa-miR-194；(a5)hsa-miR-29a；(a6)hsa-miR-125b；(a7)hsa-miR-145；

所述产品的功能为如下(c1)、(c2)、(c3)或(c4)：(c1)促进肝癌细胞增殖；(c2)促进肝癌细胞生长；(c3)促进肝癌细胞侵袭；(c4)制作肝癌动物模型。

8.特异miRNA的模拟物在制备产品中的应用；

所述特异miRNA为如下(a1)和/或(a2)和/或(a3)和/或(a4)和/或(a5)和/或(a6)和/或(a7)：

(a1)hsa-miR-106a；(a2)hsa-miR-192；(a3)hsa-miR-122；(a4)hsa-miR-194；(a5)hsa-miR-29a；(a6)hsa-miR-125b；(a7)hsa-miR-145；

所述产品的功能为如下(c1)、(c2)、(c3)或(c4)：(c1)促进肝癌细胞增殖；(c2)促进肝癌细胞生长；(c3)促进肝癌细胞侵袭；(c4)制作肝癌动物模型。

9.用于检测特异miRNA的物质在制备产品中的应用；

所述特异miRNA为如下(a1)和/或(a2)和/或(a3)和/或(a4)和/或(a5)和/或(a6)和/或(a7)：

(a1)hsa-miR-106a；(a2)hsa-miR-192；(a3)hsa-miR-122；(a4)hsa-miR-194；(a5)hsa-miR-29a；(a6)hsa-miR-125b；(a7)hsa-miR-145；

所述产品的功能为如下(d1)或(d2)：(d1)鉴定或辅助鉴定肝癌细胞；

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(d2)诊断或辅助诊断肝癌。10.一种引物组合，为引物组A和/或引物组B和/或引物组C和/或引物组D和/或引物组E和/或引物组F和/或引物组G；

每个引物组均由逆转录引物、上游引物和下游引物组成；引物组A中，逆转录引物为如下(e1)或(e2)：(e1)序列表的序列26所示的单链DNA分子；

(e2)将序列26经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列26具有相同功能的DNA分子；

引物组A中，上游引物为如下(e3)或(e4)：(e3)序列表的序列27所示的单链DNA分子；

(e4)将序列27经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列27具有相同功能的DNA分子；

引物组A中，下游引物为如下(e5)或(e6)：(e5)序列表的序列28所示的单链DNA分子；

(e6)将序列28经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列28具有相同功能的DNA分子；

引物组B中，逆转录引物为如下(f1)或(f2)：(f1)序列表的序列17所示的单链DNA分子；

(f2)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子；

引物组B中，上游引物为如下(f3)或(f4)：(f3)序列表的序列18所示的单链DNA分子；

(f4)将序列18经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列18具有相同功能的DNA分子；

引物组B中，下游引物为如下(f5)或(f6)：(f5)序列表的序列19所示的单链DNA分子；

(f6)将序列19经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列19具有相同功能的DNA分子；

引物组C中，逆转录引物为如下(g1)或(g2)：(g1)序列表的序列8所示的单链DNA分子；

(g2)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；

引物组C中，上游引物为如下(g3)或(g4)：(g3)序列表的序列9所示的单链DNA分子；

(g4)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子；

引物组C中，下游引物为如下(g5)或(g6)：(g5)序列表的序列10所示的单链DNA分子；

(g6)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相

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同功能的DNA分子；

引物组D中，逆转录引物为如下(h1)或(h2)：(h1)序列表的序列20所示的单链DNA分子；

(h2)将序列20经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列20具有相同功能的DNA分子；

引物组D中，上游引物为如下(h3)或(h4)：(h3)序列表的序列21所示的单链DNA分子；

(h4)将序列21经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列21具有相同功能的DNA分子；

引物组D中，下游引物为如下(h5)或(h6)：(h5)序列表的序列22所示的单链DNA分子；

(h6)将序列22经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列22具有相同功能的DNA分子；

引物组E中，逆转录引物为如下(i1)或(i2)：(i1)序列表的序列23所示的单链DNA分子；

(i2)将序列23经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列23具有相同功能的DNA分子；

引物组E中，上游引物为如下(i3)或(i4)：(i3)序列表的序列24所示的单链DNA分子；

(i4)将序列24经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列24具有相同功能的DNA分子；

引物组E中，下游引物为如下(i5)或(i6)：(i5)序列表的序列25所示的单链DNA分子；

(i6)将序列25经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列25具有相同功能的DNA分子；

引物组F中，逆转录引物为如下(j1)或(j2)：(j1)序列表的序列11所示的单链DNA分子；

(j2)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子；

引物组F中，上游引物为如下(j3)或(j4)：(j3)序列表的序列12所示的单链DNA分子；

(j4)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的DNA分子；

引物组F中，下游引物为如下(j5)或(j6)：(j5)序列表的序列13所示的单链DNA分子；

(j6)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相同功能的DNA分子；

引物组G中，逆转录引物为如下(k1)或(k2)：(k1)序列表的序列14所示的单链DNA分子；

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(k2)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相同功能的DNA分子；

引物组G中，上游引物为如下(k3)或(k4)：(k3)序列表的序列15所示的单链DNA分子；

(k4)将序列15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相同功能的DNA分子；

引物组G中，下游引物为如下(k5)或(k6)：(k5)序列表的序列16所示的单链DNA分子；

(k6)将序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具有相同功能的DNA分子。

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说　明　书

与肝癌诊疗相关的7种血清外泌体miRNAs及其应用

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技术领域

[0001]本发明属于生物技术和诊断领域，具体涉及与肝癌诊疗相关的7种血清外泌体miRNAs及其应用，7种血清外泌体miRNAs具体为hsa-miR-122、hsa-miR-125b、hsa-miR-145、hsa-miR-192、hsa-miR-194、hsa-miR-29a和hsa-miR-106a。背景技术

[0002]肝癌是发生率居全球第四，死亡率第二的恶性肿瘤。因为饮食、酒精性肝病尤其是肝硬化、乙肝的关系，肝癌在中国具有高发性及高危性。很多肝癌通常被发现时已经是在临床上呈现晚期，使得我国肝癌的5年生存率低于10％。因此，早期的肝硬化和肝癌的诊断至关重要。目前用于肝癌诊断的血液标志物主要是甲胎蛋白(AFP)，但是其准确度欠佳，灵敏度和特异性不足以满足肝癌的早期检测。

[0003]外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的、直径在40-100nm的盘状囊泡。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液(包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁)中。[0004]随着液态活检领域的发展，外泌体来源的生物标志物越来越被大家所重视。外泌体在血液循环中的稳定性及便利性，是一类非常好的循环肿瘤标志物，是无创且有效的诊断标志物。miRNA是一种内源性的、长度在22nt左右的非编码RNA，它可以通过结合靶基因的3’UTR区来基因的表达和功能。大量研究表明，miRNA可以作为肿瘤及其他疾病的诊断标志物。

发明内容

[0005]本发明的目的是提供与肝癌诊疗相关的7种血清外泌体miRNAs及其应用。[0006]本发明保护抑制特异miRNA的物质在制备产品中的应用；[0007]所述产品的功能为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：[0008](b1)抑制肝癌细胞增殖；[0009](b2)抑制肝癌细胞生长；[0010](b3)抑制肝癌细胞侵袭；[0011](b4)治疗肝癌。

[0012]抑制hsa-miR-106a的物质为序列表的序列31所示的单链RNA。

[0013]本发明还保护包裹有抑制特异miRNA的物质的外泌体在制备产品中的应用；[0014]所述产品的功能为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：[0015](b1)抑制肝癌细胞增殖；[0016](b2)抑制肝癌细胞生长；[0017](b3)抑制肝癌细胞侵袭；[0018](b4)治疗肝癌。

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抑制hsa-miR-106a的物质为序列表的序列31所示的单链RNA。

[0020]外泌体和抑制特异miRNA的物质的配比可为：10μg外泌体(以蛋白量计)：20-2000pmol抑制特异miRNA的物质。外泌体和抑制特异miRNA的物质的配比可为：10μg外泌体(以蛋白量计)：200pmol抑制特异miRNA的物质。

[0021]本发明还保护序列表的序列31所示的单链RNA。

[0022]本发明还保护包裹有序列表的序列31所示的单链RNA的外泌体。[0023]本发明还保护特异miRNA在制备产品中的应用；[0024]所述产品的功能为如下(c1)、(c2)、(c3)或(c4)：[0025](c1)促进肝癌细胞增殖；[0026](c2)促进肝癌细胞生长；[0027](c3)促进肝癌细胞侵袭；[0028](c4)制作肝癌动物模型。

[0029]本发明还保护特异miRNA的模拟物在制备产品中的应用；[0030]所述产品的功能为如下(c1)、(c2)、(c3)或(c4)：[0031](c1)促进肝癌细胞增殖；[0032](c2)促进肝癌细胞生长；[0033](c3)促进肝癌细胞侵袭；[0034](c4)制作肝癌动物模型。

[0035]hsa-miR-106a的模拟物为由序列表的序列29所示单链RNA和序列表的序列30所示单链RNA形成的双链RNA。

[0036]本发明还保护用于检测特异miRNA的物质在制备产品中的应用；[0037]所述产品的功能为如下(d1)或(d2)：[0038](d1)鉴定或辅助鉴定肝癌细胞；[0039](d2)诊断或辅助诊断肝癌。

[0040]所述用于检测特异miRNA的物质为引物组合。

[0041]所述引物组合为引物组A和/或引物组B和/或引物组C和/或引物组D和/或引物组E和/或引物组F和/或引物组G；

[0042]每个引物组均由逆转录引物、上游引物和下游引物组成；[0043]引物组A中，逆转录引物为如下(e1)或(e2)：[0044](e1)序列表的序列26所示的单链DNA分子；[0045](e2)将序列26经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列26具有相同功能的DNA分子；[0046]引物组A中，上游引物为如下(e3)或(e4)：[0047](e3)序列表的序列27所示的单链DNA分子；[0048](e4)将序列27经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列27具有相同功能的DNA分子；[0049]引物组A中，下游引物为如下(e5)或(e6)：[0050](e5)序列表的序列28所示的单链DNA分子；[0051](e6)将序列28经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列28具

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有相同功能的DNA分子；[0052]引物组B中，逆转录引物为如下(f1)或(f2)：[0053](f1)序列表的序列17所示的单链DNA分子；[00](f2)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子；[0055]引物组B中，上游引物为如下(f3)或(f4)：[0056](f3)序列表的序列18所示的单链DNA分子；[0057](f4)将序列18经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列18具有相同功能的DNA分子；[0058]引物组B中，下游引物为如下(f5)或(f6)：[0059](f5)序列表的序列19所示的单链DNA分子；[0060](f6)将序列19经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列19具有相同功能的DNA分子；[0061]引物组C中，逆转录引物为如下(g1)或(g2)：[0062](g1)序列表的序列8所示的单链DNA分子；[0063](g2)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；[00]引物组C中，上游引物为如下(g3)或(g4)：[0065](g3)序列表的序列9所示的单链DNA分子；[0066](g4)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子；[0067]引物组C中，下游引物为如下(g5)或(g6)：[0068](g5)序列表的序列10所示的单链DNA分子；[0069](g6)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的DNA分子；[0070]引物组D中，逆转录引物为如下(h1)或(h2)：[0071](h1)序列表的序列20所示的单链DNA分子；[0072](h2)将序列20经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列20具有相同功能的DNA分子；[0073]引物组D中，上游引物为如下(h3)或(h4)：[0074](h3)序列表的序列21所示的单链DNA分子；[0075](h4)将序列21经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列21具有相同功能的DNA分子；[0076]引物组D中，下游引物为如下(h5)或(h6)：[0077](h5)序列表的序列22所示的单链DNA分子；[0078](h6)将序列22经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列22具有相同功能的DNA分子；[0079]引物组E中，逆转录引物为如下(i1)或(i2)：[0080](i1)序列表的序列23所示的单链DNA分子；

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(i2)将序列23经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列23具

有相同功能的DNA分子；[0082]引物组E中，上游引物为如下(i3)或(i4)：[0083](i3)序列表的序列24所示的单链DNA分子；[0084](i4)将序列24经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列24具有相同功能的DNA分子；[0085]引物组E中，下游引物为如下(i5)或(i6)：[0086](i5)序列表的序列25所示的单链DNA分子；[0087](i6)将序列25经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列25具有相同功能的DNA分子；[0088]引物组F中，逆转录引物为如下(j1)或(j2)：[00](j1)序列表的序列11所示的单链DNA分子；[0090](j2)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子；[0091]引物组F中，上游引物为如下(j3)或(j4)：[0092](j3)序列表的序列12所示的单链DNA分子；[0093](j4)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的DNA分子；[0094]引物组F中，下游引物为如下(j5)或(j6)：[0095](j5)序列表的序列13所示的单链DNA分子；[0096](j6)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相同功能的DNA分子；[0097]引物组G中，逆转录引物为如下(k1)或(k2)：[0098](k1)序列表的序列14所示的单链DNA分子；[0099](k2)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相同功能的DNA分子；[0100]引物组G中，上游引物为如下(k3)或(k4)：[0101](k3)序列表的序列15所示的单链DNA分子；[0102](k4)将序列15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相同功能的DNA分子；[0103]引物组G中，下游引物为如下(k5)或(k6)：[0104](k5)序列表的序列16所示的单链DNA分子；[0105](k6)将序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具有相同功能的DNA分子。

[0106]所述引物组合也属于本发明的保护范围。所述引物组合的功能为如下(d1)或(d2)：(d1)鉴定或辅助鉴定肝癌细胞；(d2)诊断或辅助诊断肝癌。

[0107]以上任一所述特异miRNA为如下(a1)和/或(a2)和/或(a3)和/或(a4)和/或(a5)和/或(a6)和/或(a7)：[0108](a1)hsa-miR-106a；

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(a2)hsa-miR-192；

[0110](a3)hsa-miR-122；[0111](a4)hsa-miR-194；[0112](a5)hsa-miR-29a；[0113](a6)hsa-miR-125b；[0114](a7)hsa-miR-145。

[0115]以上任一所述产品具体可为试剂盒。

[0116]所述hsa-miR-106a如序列表的序列7所示。[0117]所述hsa-miR-192如序列表的序列4所示。[0118]所述hsa-miR-122如序列表的序列1所示。[0119]所述hsa-miR-194如序列表的序列5所示。[0120]所述hsa-miR-29a如序列表的序列6所示。[0121]所述hsa-miR-125b如序列表的序列2所示。[0122]所述hsa-miR-145如序列表的序列3所示。[0123]以上任一所述外泌体为血清外泌体。

[0124]以上任一所述检测特异miRNA的物质为检测外泌体中特异miRNA的物质。[0125]以上任一所述检测特异miRNA的物质为检测血清外泌体中特异miRNA的物质。[0126]本发明首次发现了血清外泌体中的hsa-miR-122、hsa-miR-125b、hsa-miR-145、hsa-miR-192、hsa-miR-194、hsa-miR-29a和hsa-miR-106a可作为肝癌的生物标志物，具有较高诊断价值，为临床提供快速准确的诊断方式，使肝癌的诊断更加方便易行。本发明还进一步发现抑制特异miRNA，可以抑制肝癌细胞增殖/生长，为临床治疗肝癌奠定了基础。附图说明

[0127]图1为采用投射电子显微镜观察外泌体的示例性照片。

[0128]图2为采用westernblot检测外泌体的标志性抗原的示例性结果。[0129]图3为HEPG2细胞细胞增殖试验的结果。[0130]图4为SMMC-7721细胞细胞增殖试验的结果。[0131]图5为细胞侵袭试验的结果。

具体实施方式

[0132]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员在本发明的纰漏范围内，根据本发明的技术方案及构思进行替换或改变均属于本发明的保护范畴。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。使用T检验方法统计实验所得数据，P值小于0.05且变化倍数大于2倍被认为具有统计学意义。[0133]抗CD63的兔多抗：Proteintech,25682-1-AP。[0134]抗CD9的兔多抗：Proteintech,20597-1-AP。[0135]HEPG2细胞(人肝癌细胞系)：中国科学院细胞库(目录号：TCHu 2)。

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SMMC-7721细胞(人肝癌细胞系)：中国科学院细胞库(目录号：TCHu 52)。

[0137]实施例1、7种血清外泌体miRNAs作为肝癌标志物的发现和验证[0138]血清样本为110份，其中80份来自2015年12月至2017年1月在苏州大学附属第一医院确诊的80例肝癌患者(知情同意的志愿者，经病理组织学确诊为I-IV期肝癌患者，于入院后未经手术及放化疗前采血)，剩余的30份来自同期进行疾病筛查的30例健康人(知情同意的志愿者)。80例患者和30例健康人的信息见表1。[0139]表1

[0140]

各个血清样本分别进行检测。

[0142]一、血清外泌体的提取及鉴定[0143]1、取血清样本，采用PEG-base沉淀法提取外泌体。[0144]2、取步骤1得到的外泌体，采用投射电子显微镜进行观察。各个血清样本均得到了外泌体，示例性照片见图1。外泌体见图1中的箭头标示。[0145]3、取步骤1得到的外泌体，用细胞裂解液裂解后提取总蛋白。取总蛋白，进行SDS-PAGE和westernblot。采用的一抗为抗CD63的兔多抗或抗CD9的兔多抗，采用的二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔lgG。将血清样本作为外泌体的对照。各个血清样本得到的外泌体均为CD63和CD9双阳性，示例性结果见图2。[0146]二、外泌体总RNA的抽提

[0147]取步骤一的1得到的外泌体，提取总RNA。[0148]三、逆转录以及qPCR检测[0149]1、取步骤二得到的总RNA，采用逆转录引物进行逆转录，得到cDNA。[0150]2、以步骤1得到的cDNA为模板，进行荧光定量PCR，分别检测7种miRNA。[0151]反应体系(20μl)：由10μl 2×SYBR Green qPCR Mix、上游引物溶液(20μM)、下游引物溶液(20μM)、模板、rTaq DNA聚合酶溶液(5U/μL)和dd H2O组成。反应体系中，上游引物和下游引物的浓度均为0.10μM，rTaq DNA聚合酶的浓度为0.05U/μL，模板加入量为50ng。[0152]反应条件：94℃3min；94℃12s、62℃30s、72℃30s，40个循环。[0153]7种miRNA如下：

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[0141]

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hsa-miR-122(序列表的序列1)：5’-uggagugugacaaugguguuug-3’；

[0155]hsa-miR-125b(序列表的序列2)：5’-ucccugagacccuaacuuguga-3’；[0156]hsa-miR-145(序列表的序列3)：5’-guccaguuuucccaggaaucccu-3’；[0157]hsa-miR-192(序列表的序列4)：5’-cugaccuaugaauugacagcc-3’；[0158]hsa-miR-194(序列表的序列5)：5’-uguaacagcaacuccaugugga-3’；[0159]hsa-miR-29a(序列表的序列6)：5’-acugauuucuuuugguguucag-3’；[0160]hsa-miR-106a(序列表的序列7)：5’-aaaagugcuuacagugcagguag-3’。[0161]将hsa-miR-16作为7种miRNA的内参。hsa-miR-16为已知在血清外泌体中含量稳定的miRNA。

[0162]hsa-miR-16：5’-uagcagcacguaaauauuggcg-3’。[0163]用于检测7种miRNA以及hsa-miR-16的引物见表2。miR122-RT(序列表的序列8)、mir-122-FO(序列表的序列9)和miR-122-RE(序列表的序列10)用于检测hsa-miR-122。miR125b-RT(序列表的序列11)、miR-125b-FO(序列表的序列12)和miR-125b-RE(序列表的序列13)用于检测hsa-miR-125b。miR145-RT(序列表的序列14)、miR-145-FO(序列表的序列15)和miR-145-RE(序列表的序列16)用于检测hsa-miR-145。miR192-RT(序列表的序列17)、miR-192-FO(序列表的序列18)和miR-192-RE(序列表的序列19)用于检测hsa-miR-192。miR194-RT(序列表的序列20)、miR-194-FO(序列表的序列21)和miR-194-RE(序列表的序列22)用于检测hsa-miR-194。miR29a-RT(序列表的序列23)、miR-29a-FO(序列表的序列24)和miR-29a-RE(序列表的序列25)用于检测hsa-miR-29a。miR106a-RT(序列表的序列26)、miR-106a-FO(序列表的序列27)和miR-106a-RE(序列表的序列28)用于检测hsa-miR-106a。miR-16-RT、miR-16-FO和miR-16-RE用于检测hsa-miR-16。FO代表上游引物，RE代表下游引物，RT代表逆转录引物。[01]表2

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将血清外泌体中hsa-miR-16的含量作为1，计算7种miRNA的相对表达水平。

[0168]比较肝癌患者组和健康人组血清外泌体中7种miRNA的相对表达水平，结果见表3。在肝癌患者组中血清外泌体中hsa-miR-122、hsa-miR-125b、hsa-miR-145、hsa-miR-192、hsa-miR-194、hsa-miR-29a和hsa-miR-106a相对表达水平显著高于健康人组(p<0.05)。进行ROC曲线分析，结果见表4。AUC面积介于0.569-0.752，p＜0.005。结果表明，血清外泌体中hsa-miR-122、hsa-miR-125b、hsa-miR-145、hsa-miR-192、hsa-miR-194、hsa-miR-29a和hsa-miR-106a的相对表达水平与肝癌发生相关。

[0169]将hsa-miR-122的相对表达水平大于0.0112作为判断为肝癌患者的阈值，准确率为74.6％。将hsa-miR-125b的相对表达水平大于0.00196作为判断为肝癌患者的阈值，准确率为65.0％。将hsa-miR-145的相对表达水平大于0.001177作为判断为肝癌患者的阈值，准确率为56.9％。将hsa-miR-192的相对表达水平大于0.00128作为判断为肝癌患者的阈值，准确率为75.2％。将hsa-miR-194的相对表达水平大于0.000376作为判断为肝癌患者的阈值，准确率为73.8％。将hsa-miR-29a的相对表达水平大于0.0198作为判断为肝癌患者的阈值，准确率为70.3％。将hsa-miR-106a的相对表达水平大于0.0156作为判断为肝癌患者的阈值，准确率为70.4％。[0170]表3

[0171]

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[0173][0174]

表4

miRNAAUC95％置信区间hsa-miR-1220.7460.650-0.842hsa-miR-125b0.6500.526-0.744hsa-miR-1450.5690.422-0.9hsa-miR-1920.7520.658-0.846hsa-miR-1940.7380.638-0.838hsa-miR-29a0.7030.597-0.809hsa-miR-106a0.7040.534-0.873[0175]实施例2、细胞增殖试验[0176]待测物为：hsa-miR-106a模拟物或hsa-miR-106a抑制物。

[0177]hsa-miR-106a模拟物为由序列表的序列29所示单链RNA和序列表的序列30所示单链RNA形成的双链RNA。[0178]序列表的序列29：5’-AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG-3’；[0179]序列表的序列30：5’-ACCUGCACUGUAAGCACUUUUUU-3’。[0180]hsa-miR-106a抑制物为序列表的序列31所示的单链RNA。[0181]序列表的序列31：5’-CUACCUGCACUGUAAGCACUUUU-3’。[0182]待测细胞为：HEPG2细胞或SMMC-7721细胞。[0183]1、采用DMEM培养液悬浮待测细胞，然后将细胞悬液接种至96孔板中，每孔100μl(含105个细胞)，然后37℃静置培养24小时。[0184]2、每份混合物的制备方法：20μl实施例1的步骤一的1制备的健康者的外泌体(含10μg外泌体，以蛋白量计)和200pmol待测物混合，得到混合物。[0185]3、完成步骤1后，取所述96孔板，吸弃上清，每孔加入1份步骤2制备的混合物，然后37℃静置培养0时刻、24小时、48小时、72小时或96小时。设置只加入外泌体，来代替加入混合物的对照。[0186]4、完成步骤3后，采用CCK8试剂盒(日本东仁化学科技，CK04)并按说明书操作，检测细胞增殖活力。

[0187]将0时刻的细胞活力作为1，计算24小时、48小时、72小时或96小时后的细胞相对活力。

[0188]进行三个重复处理，结果取平均值。[01]HEPG2细胞的结果见图3。SMMC-7721细胞的结果见图4。结果表明，hsa-miR-106a模

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拟物可以促进肝癌细胞的生长和增殖，而hsa-miR-106a抑制物则抑制肝癌细胞的生长和增殖。

[0190]实施例3、细胞侵袭试验[0191]待测物同实施例2。[0192]待测细胞同实施例2。[0193]1、采用DMEM培养液悬浮待测细胞，然后将细胞悬液接种至96孔板中，每孔100μl(含105个细胞)，然后37℃静置培养24小时。[0194]2、每份混合物的制备方法：20μl实施例1的步骤一的1制备的健康者的外泌体(含10μg外泌体，以蛋白量计)和200pmol待测物混合，得到混合物。[0195]3、完成步骤1后，取所述96孔板，吸弃上清，每孔加入1份步骤2制备的混合物，然后37℃静置培养24小时，收集细胞。设置只加入外泌体，来代替加入混合物的对照。[0196]4、matrigel在4℃融化，取100μl融化的matrigel，与400μl无血清DMEM培养液混匀。

[0197]5、取穿膜小室，每个小室的上层加入500μl步骤4得到的混合物，下层加入含10％胎牛血清的DMEM培养液并使其接触到小室的中间膜。[0198]6、完成步骤5后，取所述穿膜小室，在上层加入步骤3收集的细胞，37℃静置培养24小时。

[0199]7、完成步骤6后，取所述穿膜小室，擦去中间膜面向上层的一面的细胞，将穿膜小室倒置晾干，将中间膜面向下层的一面进行甲醛固定，然后进行结晶紫染色。[0200]染色结果见图5。结果表明，hsa-miR-106a模拟物可以促进肝癌细胞的侵袭，而hsa-miR-106a抑制物则抑制肝癌细胞的侵袭。

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SEQUENCE LISTING<110> 苏州吉玛基因股份有限公司上海吉玛制药技术有限公司<120> 与肝癌诊疗相关的7种血清外泌体miRNAs及其应用<130> GNCYX180568<160> 31<170> PatentIn version 3.5<210> 1<211> 22<212> RNA<213> Artificial sequence<400> 1uggaguguga caaugguguu ug 22<210> 2<211> 22<212> RNA<213> Artificial sequence<400> 2ucccugagac ccuaacuugu ga 22<210> 3<211> 23<212> RNA<213> Artificial sequence<400> 3guccaguuuu cccaggaauc ccu 23<210> 4<211> 21<212> RNA<213> Artificial sequence<400> 4cugaccuaug aauugacagc c 21<210> 5<211> 22<212> RNA<213> Artificial sequence<400> 5uguaacagca acuccaugug ga 22<210> 6

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<211> 22<212> RNA<213> Artificial sequence<400> 6acugauuucu uuugguguuc ag 22<210> 7<211> 23<212> RNA<213> Artificial sequence<400> 7aaaagugcuu acagugcagg uag 23<210> 8<211> 60<212> DNA<213> Artificial sequence<400> 8gtctgtatgg ttgttcacga ctccttcaca tccctatcca accatacaga ccaaacacca 60<210> 9<211> 22<212> DNA<213> Artificial sequence<400> 9gatgctctgg agtgtgacaa tg 22<210> 10<211> 24<212> DNA<213> Artificial sequence<400> 10tatggttgtt cacgactcct tcac 24<210> 11<211> 59<212> DNA<213> Artificial sequence<400> 11gtctgtatgg ttgttctgct ctctgtcaca tccctatcta caaccataca gactcacaa 59<210> 12<211> 25<212> DNA<213> Artificial sequence

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<400> 12actgataaat ccctgagacc ctaac 25<210> 13<211> 24<212> DNA<213> Artificial sequence<400> 13tatggttgtt ctgctctctg tcac 24<210> 14<211> 61<212> DNA<213> Artificial sequence<400> 14gtctgtatgg ttgttcacga gtccttcaca tccctatcca accatacaga cagggattcc 60t 61<210> 15<211> 19<212> DNA<213> Artificial sequence<400> 15tgccgagtcc agttttccc 19<210> 16<211> 24<212> DNA<213> Artificial sequence<400> 16tatggttgtt cacgagtcct tcac 24<210> 17<211> 59<212> DNA<213> Artificial sequence<400> 17gtctgtatgg ttgttcacga ctccttcaca tccctatcca accatacaga cggctgtca 59<210> 18<211> 20<212> DNA<213> Artificial sequence<400> 18agccgctgac ctatgaattg 20

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<210> 19<211> 24<212> DNA<213> Artificial sequence<400> 19tatggttgtt cacgactcct tcac 24<210> 20<211> 62<212> DNA<213> Artificial sequence<400> 20agtcgggtct cagagcaggg tccgaggtac acgttcgctc tgagacccga cttccacatg 60ga 62<210> 21<211> 20<212> DNA<213> Artificial sequence<400> 21agcccgtgta acagcaactc 20<210> 22<211> 19<212> DNA<213> Artificial sequence<400> 22cagagcaggg tccgaggta 19<210> 23<211> 62<212> DNA<213> Artificial sequence<400> 23gtctgtatcc ttgttcacga ctccttcaca tccctatcca aggatacaga ctaaccgatt 60tc 62<210> 24<211> 19<212> DNA<213> Artificial sequence<400> 24ctgccgtagc accatctga 19<210> 25

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<211> 24<212> DNA<213> Artificial sequence<400> 25tatccttgtt cacgactcct tcac 24<210> 26<211> 61<212> DNA<213> Artificial sequence<400> 26gtctgtatgg ttcttgacga ctggttgaca tccctatcga accatacaga cctacctgca 60c 61<210> 27<211> 21<212> DNA<213> Artificial sequence<400> 27ccgagcgaaa agtgcttaca g 21<210> 28<211> 24<212> DNA<213> Artificial sequence<400> 28tatggttctt gacgactggt tgac 24<210> 29<211> 23<212> RNA<213> Artificial sequence<400> 29aaaagugcuu acagugcagg uag 23<210> 30<211> 23<212> RNA<213> Artificial sequence<400> 30accugcacug uaagcacuuu uuu 23<210> 31<211> 23<212> RNA

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<213> Artificial sequence<400> 31cuaccugcac uguaagcacu uuu 23

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图1

图2

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图3

图4

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图5

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