一种灵芝三萜皂甙新物质的分离鉴定和结构推断

维普资讯 http://www.cqvip.com 第２７卷第３期　食品与生物技术学报　Ｖｏ１．２７　Ｎｏ．３　２００８年５月　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｍａｙ．　２００８　文章编号：１６７３—１６８９（２００８）０３—００６０～０４　一种灵芝三萜皂甙新物质的分离鉴定和结构推断　崔月花　，　丁重阳。，　章克昌。　（１．扬州大学生物科学与技术学院，江苏扬州２２５００９；２．江南大学教育部工业生物技术重点实　验室，江苏无锡２１４１２２）　摘　要：通过凝胶色谱和反相硅胶柱色谱从灵芝发酵液中分离得到一种新物质，定性检验该物质　为灵芝三萜皂甙，通过反相高效液相色谱鉴定其纯度为９４．４５　。进一步用质谱，红外，紫外对其　分子结构进行初步推断，这种皂甙是一个连有１个糖基的母核荷质比为４０２、相对分子质量为５６４　的皂甙。　关键词：灵芝；皂甙；分离；纯化；质谱；结构推断　中图分类号：Ｓ　６４２．５　文献标识码：Ａ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ｄｅｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｓａｐｏｎｉｎ　ｆｒｏｍ　Ｇａｎｏｄｅｒｍａ　ｌｕｃｉｄｕｍ　ＣＵＩ　Ｙｕｅ—ｈｕａ　，Ｄｉｎｇ　ｃｈｏｎｇ—ｙａｎｇ　。　ＺＨＡＮＧ　Ｋｅ—ｃｈａｎｇ　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｙａｎｇｚｈｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｚｈｏｕ　２２５００９，Ｃｈｉｎａ；２．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｂｉｏｍａｓｓ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｊｉａｎｇｎａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ　２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　ｎｅｗ　ｓａｐｏｎｉｎ　ｗａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｇ．１ｕｃｉｄｉｕｍ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｌ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ａｎｄ　ｒｅｖｅｒｓｅｄ－－ｐｈａｓｅ　ｓｉｌｉｃａ　ｇｅｌ　ｃｏｌｕｍｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｔｈｅ　ｐｕｒｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓａｐｏｎｉｎ　ｗａｓ　９４．４５　ｂｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ＲＰ～ＨＰＬＣ．Ｔｈｅ　ＭＳ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓａｐｏｎｉｎ　ｈａｄ　ｏｎｅ　ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ．ｔｈｅ　ｍ／ｚ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｌｙｃｏｎ　ｗａｓ　４０２　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｗａｓ　５６４．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｇａｎｏｄｅｒｍａ　ｌｕｃｉｄｕｍ；ｓａｐｏｎｉｎ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＭＳ；ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　灵芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ　ｌｕｃｉｄｕｍ）是一种传统的名　到国内外学者的高度关注。关于灵芝三萜类的分　贵中药。因含有糖苷，有特殊苦味。灵芝含有糖　离纯化，国内外已有初步的研究ｆ４．ｓ￣，但对灵芝三萜　类、核苷类、呋喃类、生物碱类、氨基酸蛋白质类、三　皂甙的分离研究较少。作者拟用大孔树脂、凝胶柱　萜类、油脂类、有机锗化合物类口　等等，其中多糖和　色谱分离，最后用反相硅胶柱纯化，得到高纯度的　三萜类研究得很多，是灵芝起疗效作用的重要成　灵芝三萜皂甙，并结合质谱方法来初步推断皂甙的　分。从灵芝的子实体、孢子、菌丝体和发酵液中分　相对分子质量与分子结构，为研究灵芝三萜皂甙的　离出的多糖和三萜类具有抗肿瘤、抗乙肝病毒等多　分离纯化提供了一定的参考。　方面的作用Ｉｌ　］。近年来，灵芝的药用价值日益受　收稿日期：２００７～０６—０３．　作者简介：崔月花（１９７１一），女（蒙古族），内蒙古赤峰人，工学博士，讲师，主要从事发酵工程等方面的研究．Ｅｍａｉｌ：　ｙｈｃｕｉ＠ｙｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ　维普资讯 http://www.cqvip.com

第３期　崔月花等：一种灵芝三萜皂甙新物质的分离鉴定和结构推断　６１　１材料与方法　１．１　器材　灵芝（Ｇ．１ｕｃｉｄｕｍ）发酵液：江南大学生物工程　学院提供。　大孔树脂ＨＰＤ－４００：河北沧州宝恩化工厂产　品；Ｃ一１８：粒度２０～４０／，ｍ，日本泉岛公司产品；　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ２０：粒度０．２２／，ｍ，Ｓｉｇｍａ公司产品；　ＤＰＰＨ：Ｓｉｇｍａ公司产品；ＳＨＺ一３型水循环真空泵：　无锡星海生化仪器公司产品；ＢＴ　一１００恒流泵：上海　琪特分析仪器有限公司产品；玻璃层析柱Ｄ　１．２　ｃｍ　×３０　ｃｍ，上海华美层析设备厂产品；ＨＤ－２１—８８型　紫外检测器：上海琪特分析仪器有限公司产品；　Ｎｉｃｏｌｅｔ　Ｎｅｘｕｓ傅里叶变换红外光谱仪：Ｔｈｅｒｍｏ　ＥｌｅｃｔｒｏｎＣｏｒｐａｒａｔｉｏｎ产品；Ｗａｔｅｒｓ　ＺＭＤ　４０００型液　质联用仪：美国Ｗａｔｅｒｓ公司产品；Ｗａｔｅｒｓ　ＺＭＤ　４０００型二极管阵裂检测器：美国Ｗａｔｅｒｓ公司产品。　１．２　方法　１．２．１分离纯化将灵芝发酵液用体积分数７０　的乙醇沉淀后，去掉部分蛋白质和多糖等大分子物　质，上清液浓缩，用石油醚萃取，去掉油脂等，水相　浓缩后，用等体积的正丁醇萃取，正丁醇相经大孔　树脂ＨＰＤ４００去处杂质，将经大孔树脂体积分数　２０　乙醇洗脱液反复过Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｉ　Ｈ２０柱，再经过　反相ｏＤＳ层析得到灵芝三萜皂甙。　１．２．２　纯度鉴定　反相高效液相色谱条件：色谱　柱ＺｏｒｂａｘＳＢ　Ｃ１８（Ｄ　４１６　ｍｍ×１５０　ｍｍ）；柱温３０　。Ｃ；流动相：甲醇：０．４　甲酸水溶液；体积流量１　ｍＬ／ｍｉｎ；进样量１０“Ｌ；检测器ＥＬＳＤ。　１．２．３质谱分析条件　ＭＳ条件：ＥＳＩ—ＭＳ锥孔电　压６０　Ｖ，毛细管电压３．８８　ｋＶ，离子源温度１２０。Ｃ，　脱溶剂气温度３００　Ｃ，柱温３５。Ｃ；进样量５／，Ｌ，体　积流量１　ｍＬ／ｍｉｎ。　１．２．４　红外光谱检测方法　制样方法：液膜法；扫　描次数２５６次；分辨率４　ｃｍ。　２结果与讨论　２．１　灵芝三萜皂甙的定性　泡沫反应是皂甙反应的一个特点，实验中发现　灵芝皂甙水溶液能产生蜂窝状泡沫，持久（１５　ｍｉｎ　内）不消失；冰醋酸浓硫酸试验时，溶液的颜色变化　是棕红色一紫色一墨绿色；氯仿浓硫酸试验体系　中，颜色是氯仿层红色，浓硫酸层绿色，这是三萜类　的反应。以上是三萜和皂甙的特征反应，两种反应　均为阳性，初步证明了该物质是灵芝三萜皂甙。　２．２　灵芝三萜皂甙的纯度鉴定　反相高效液相色谱（ＲＰ—ＨＰＬＣ）检测灵芝三　萜皂甙的纯度，ＨＰＬＣ验证，结果是一个单一的峰，　见图１。归一化法求得纯度为９４．１３　，由此可见，　此物质是纯的化合物。　图１　灵芝三萜皂甙ＲＰ－ＩｔＰＬＣ图　ｎ昏１　ＲＰ－ＩｔＰＬＣ　Ｓｌ￣ｍｔｒａｍ　ｏｆｔｈｅ　ｓａｍｎｉｎ　ｆｒｏｍＧＬｕｃ／ｄｍｎ　２．３　灵芝三萜皂甙的结构推断　２．３．１　质谱分析　在图２中，保留时间为１０．０４　ｍｉｎ的峰为化合物ＧＣＴＬ１，其正离子色谱峰的保留　时间为１０．１４　ｍｉｎ，负离子色谱峰的保留时间为　１０．１９　ｍｉｎ。　一　１　；　。　－　２．６７　１　时间／ｒａｉｎ　（ｃ）　图２灵芝三萜皂甙的ＬＣ／ＭＳ图谱　Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ＬＣ／ＭＳ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ｏｆ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｓａｌｍｎｉｎ　ｆｒｏｍ　Ｇ．Ｌｕｅｉｄｕｍ　图３为对应正负离子色谱峰的ＥＭＳ－ＭＳ图谱。　分析图３：在ＥＳ＋图谱中有　／ｚ　５６５［Ｍ＋Ｈ］，　维普资讯 http://www.cqvip.com

６２　食品　与　生　物技　术　学报　第２７卷　５８７．１［Ｍ＋Ｎａ］，６０２．８ｒＭ＋Ｋ］，而在ＥＳ一图谱中　有ｍ／　５６３［Ｍ—Ｈ］。据此可以确定化合物　ＧＣＴＬ１的相对分子质量为５６４。该化合物的正离　ｍ／ｚ　４３５．４，ｍ／ｚ　３４８．６。可以推断在电离过程中产　生碎片ｍ／ｚ　６４８．５　ＥＭ＋Ｋ＋Ｎａ＋Ｈ。Ｏ—Ｈ］、ｍ／　４３５．４［Ｍ＋Ｋ一１６２１，ｍ／ｚ　３４８．６［Ｍ一１６２一Ｈ２　ｏｌ，　其中１６２代表失去１个糖基。这说明了此种皂甙是　子图谱（见图３）中除了［Ｍ＋Ｎａ］、［Ｍ＋Ｋ］碎片外，　还显示有３个主要的离子碎片，分别为ｍ／ｚ　６４８．５，　连有１个糖基的皂甙。　未知物　ｌ：ＳｃａｎＥＳ＋　０６０８０９—４　６９（１１．１１８１　ｌＯＯ　７．２８ｅ４　Ｍ＋Ｉ　＊　５Ｏ　霞　５４７　２　６，３　６．　５　４　５２　８７ｃ６．１　７５　７．７７８８．７　８８１．２Ｏ　一　一．—…—．９ｏ。３　９６８．　．２：Ｓｃａｎ　ＥＳ一　ｌＯ０　＾　１　＊　５Ｏ　２ｌ４　０　霞　１２５，８２０５ｋ６　Ｏ　．Ｉ　１．ＩＩ　　．．　．　．６２１　１．…｜　．　５００　６００　７００　８００　９００　ｌ　０００　ｍ／ｚ　（ｂ）　图３化合物Ｉ的ＥＳＩ－ＭＳ图谱　Ｆｉｇ．３　ＥＳＩ－ＭＳ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ｏｆ　ｓａｐｏｎｉｎ　ｆｒｏｍ　Ｇ．Ｌｕｃｉｄｕｍ　相对分子质量５６４去掉一个为ｌ６２的糖基，甙　图谱可知化合物ＧＣＴＩ　１的紫外吸收在２１９．６和　元的相对分子质量为４０２，查阅文献　，为灵芝化合　２７０　ｎｍ以及３３４．６　ｎｍ处有特征吸收（见图５）。　物ｌｕｃｉｄｏｎｅ　Ａ，所以推测了化合物可能是ｌｕｃｉｄｏｎｅ　２１９．６和３３４．６　ｎｍ的吸收峰证明了结构中有ａ、８　Ａ与六碳糖形成的皂甙。其分子式为：ｃ。。Ｈ　Ｏ。。，　不饱和酮。而推测的ｌｕｃｉｄｏｎｅ　Ａ中有这样的结构。　可能的结构式见图４。　未知物　０６０８０９－４　５９４（１　０．００８）　Ｈ　图５　灵芝三萜皂甙的紫外图谱（甲醇）　Ｆｉｇ．５　Ｔｈｅ　ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ｏｆ　ｓａｐｏｎｉｎ　０　ｆｒｏｍ　Ｇ．Ｌｕｃｉｄｕｍ　２．３．３化合物ＧＣＴＩ　１的红外光谱分析　图６可　得到以下信息：在３　４０５．９８　ｃｍ、１　０８９．７５　ｃｍ。有强　图４相对分子质量为５６４的灵芝三萜皂甙　的吸收，说明结构中有羟基；在２　９２７．７１　ｃｍ。处的强　Ｆｉｇ．４　Ｍ　５６４　ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ　ｓａｐｏｎｉｎ　ｆｒｏｍ　Ｇ．１ｕｃｉｄｕｍ　吸收是ＣＨ。、ＣＨ　的Ｃ—Ｈ伸缩振动；在１　７１３．７８　由图４可见，甙元的母核结构为Ｖ型。图中的　ｃｍ。处的吸收峰是羰基的特征吸收峰；在１　６５６．６０　糖为六碳糖，为了进一步推断化合物ＧＣＴＬ１的结　ｃｍ。处的吸收峰是ａ、８不饱和酮特征吸收，在　构，采用紫外、红外光谱来检测化学结构中的功能　ｌ　４２４．６７　ｃｍ　处是Ｃ—Ｏ的特征吸收峰。这些都　团，对化合物ＧＣＴＩ　１的结构做进一步研究。　印证了ｌｕｃｉｄｏｎｅ　Ａ的结构。　２．３．２　化合物ＧＣＴＩ　１的紫外光谱分析　从紫外　维普资讯 http://www.cqvip.com 第３期　崔月花等：一种灵芝三萜皂甙新物质的分离鉴定和结构推断　６３　综合质谱分析、红外和紫外图谱推测，结合文　献报道，可推测ＧＣＴＬ１的结构是甙元为ｌｕｃｉｄｏｎｅ　Ａ的带有一个葡萄糖基的三萜皂甙。　３　结　语　通过大孔树脂，凝胶柱Ｓｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ２０以及反　相ＯＤＳ色谱，成功地分离纯化到一种灵芝三萜皂　图６　灵芝三萜皂甙的红外吸收光谱　Ｆｉｇ．６　Ｔｈｅ　ｉｎｆｒａｒｅｄ　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ｏｆ　ｓａｐｏｎｉｎ　ｆｒｏｍ　Ｇ．Ｌｕｃｉｄｕｍ　甙，并经ＨＰＬＣ检测分析，纯度达到９４　以上。这　为灵芝三萜皂甙标准品的制备提供了理论依据。　由此表明建立的分离纯化方法有效可行。至于此　种皂甙的进一步结构鉴定和生理活性，有待进一步　研究。　ＧＣＴＬ１经过酸水解和纸层析，鉴定糖为葡萄　糖，但是糖的连接位置和方式还须进一步研究。　参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）：　［１］Ｃａｒｍｅｎ　Ｗ　Ｈ，Ｘｉｎ　Ｄ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　ａｎｄ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｌｉｎｇｚｈｉ　ｐｈａｒｍａｃｏ１ｏｇｉｃａｌ１ｙ　ａｃｔｉｖｅ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ｂ，２００４，８１２：２４１　２５７．　［２３杨海龙，灵芝发酵新型抗肿瘤制剂的研究［Ｄ］．无锡：江南大学，２００４．　［３］李雁群，章克昌．灵芝转化苦参水提物的３个新生成分体外抗乙型肝炎病毒作用［Ｊ］．微生物学报，２００５，４５（４）：６４３—　６４６．　Ｉ　Ｉ　Ｙａｎ－ｑｕｎ，ＺＨＡＮＧ　Ｋｅｎ－ｃｈａｎｇ．Ｉｎｖｉｔｒｏ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ＨＢｓＡｇ　ａｎｄ　ＨＢｅＡｇ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｏｆ　３　ｎｅｗ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｐｒｏ—　ｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ｇａｎｏｄｅｒｍａ　ｌｕｃｉｄｕｍ　ｉｎ　ｍｅｄｉｕｍ　ｃｏｎｔａｉｎｅｄ　ｒａｄｉｘ　ｓｏｐｈｏｒａｅ　ｆｌａｖｅｓｃｅｎｔｉｓ　ｅｘｔｒａｃｔ［Ｊ］．Ａｃｔａ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｉｏｇｉｃａ　ｓｉｎｉｃａ，２００５，　４５（４）：６４３—６４６．　［４］梁晓天．常用中药基础研究［Ｍ］．北京：科学出版社，２００４．　［５］钱竹．灵芝酸液体发酵及其分离纯化的研究［Ｄ］．无锡：江南大学，２００６．　（责任编辑：朱明）　Ｌａｂｔｈｉｎｋ兰光包装安全与检测技术全球巡回讲座拉开帷幕　为了推动包装安全与检测技术的发展与进步，Ｉ　ａｂｔｈｉｎｋ兰光于２００８年３月～１１月　期间，在全　球３１个城市举办“２００８１　ａｂｔｈｉｎｋ兰光包装安全与检测技术全球巡回讲座”，邀请包装质量检测机　构，科研院校。行业协会，包装、彩印企业以及食品、药品、化妆品生产企业等，共同探讨包装检测控　制技术的应用与发展。作为中国包装检测行业的引领者，Ｌａｂｔｈｉｎｋ兰光以完备的研究设施、完整　的核心技术、完善的解决方案著称业界，拥有涵盖全球检测标准最全的高分子聚合物阻隔性实验　室。凭借专业严谨的创新精神、及时周到的技术服务、遍布全球的营销网络以及敬业高效的人才　精英团队，Ｌａｂｔｈｉｎｋ兰光已为全球３０００多家客户提供数万套检测设备及多层次技术服务。　近年来，Ｉ　ａｂｔｈｉｎｋ兰光在软包装检测技术研究领域不断推陈出新，许多新产品、新技术在业内　引起巨大反响。本次巡回讲座期间，Ｌａｂｔｈｉｎｋ兰光将就与食品、药品、化妆品直接接触的包装材料　对产品货架期的影响与控制；商品包装从深冷到高温宽泛应用环境下的阻隔性检测技术；中国法　定检验机构食品、药品包装材料试验方法与数据体系的共性与特点；全球化的软包装产品质量检　测控制解决方案等问题与参会者进行面对面的交流，并将与参会者分享一系列代表Ｌａｂｔｈｉｎｋ兰光　最新发展成果的新产品、新技术。　巡回讲座将在中国的厦门、福州、长沙、武汉、成都、重庆、温州、宁波、杭州、青岛、上海、南京、　无锡、郑州、漯河、合肥、桐城、天津、北京、沈阳、大连、广州等２２个城市以及比利时布鲁塞尔、美国　芝加哥、日本东京、德国杜塞尔多夫、俄罗斯莫斯科、荷兰乌得勒支、韩国首尔、泰国曼谷、印度钦奈等　地举办