定量标记免疫分析用国家标准品研制技术要求介绍

曹丽梅;肖新月;王一平;于婷;黄颖

【摘 要】进一步规范定量标记免疫分析用国家标准品的研制工作.定量标记免疫分析用国家标准品系指通过具有一定量值溯源性的、用于规范定量标记免疫分析试剂盒内校准物质准确性的国家标准品,本文详细介绍了这类标准品的原材料、制备、标定、稳定性研究、包装、储存及供应方面的要求.定量标记免疫分析用国家标准品的管理更加规范.

【期刊名称】《标记免疫分析与临床》 【年(卷),期】2018(025)007 【总页数】3页(P1074-1076)

【关键词】定量标记免疫分析;标准品;技术要求 【作 者】曹丽梅;肖新月;王一平;于婷;黄颖

【作者单位】中国食品药品检定研究院,北京102269;中国食品药品检定研究院,北京102269;中国食品药品检定研究院,北京102269;中国食品药品检定研究院,北京102269;中国食品药品检定研究院,北京102269 【正文语种】中 文

药品标准物质是药品检定的重要物质基础，同时也是国家药品标准的物质基础，是控制药品质量必不可少的工具。根据《中华人民共和国药品管理法》、《药品注册管理办法》，中国食品药品检定研究院（以下简称中检院）负责对标定的药品标准

物质从原材料选择、制备方法、标定方法、标定结果、定值准确性、量值溯源、稳定性及分装与包装条件等资料进行全面技术审核，并作出可否作为国家药品标准物质的结论［1］。另外，根据《医疗器械监督管理条例》、《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）精神，将“组织体外诊断试剂国家标准品、参考品的制备和标定工作”的责任主体明确为中检院［2］。 目前，中检院可以提供113种注册检验用体外诊断试剂国家标准品和参考品，其中有17个定量标记免疫分析用国家标准品（具体品种名称见附表），为进一步规范这类体外诊断试剂标准物质的研制工作，现将定量标记免疫分析用国家标准品研制过程中的一般技术要求介绍如下： 1 相关概念

1.1 体外诊断试剂 是指按医疗器械管理的体外诊断试剂，包括在疾病的预测、预防、诊断、治疗监测、预后观察和健康状态评价的过程中，用于人体样本体外检测的试剂、试剂盒、校准品、质控品等产品［2］。 1.2 定量标记免疫分析试剂盒及其溯源性［3］

定量标记免疫分析试剂盒用于人体内微量及超微量物质的定量分析，如：激素、肿瘤标志物等。而这些试剂盒内校准物质需要统一的国际或国家标准品校正，以实现其溯源性。对比国际市场，我国体外诊断试剂生产企业具有数量多，且质量参差不齐的特点因此，研制此类国家标准品有助于提高各生产企业产品间同一项目试剂盒内校准物质的溯源性和可比性，因此，标准品的研制对产品质量控制具有重要意义。 1.3 定量标记免疫分析用国家标准品 系指通过具有一定量值溯源性的、用于规范定量标记免疫分析试剂盒内校准物质准确性的国家标准品。如对激素及部分肿瘤标志物等定量标记免疫分析试剂盒进行质量评价的标准物质。 2 原材料选择

选择合适的候选品原料是制备标准物质的关键，定量标记免疫分析用国家标准品的

原材料应与供试品同质，应有足够的稳定性、均匀性和定值准确性，并有足够的数量。原料并非越纯越好，标准物质的作用是使同一产品在不同条件下测得的结果相对可靠，如果标准物质纯度很高，但与供试品内在质量相差很远，测定结果则不会准确，根据标准品与供试品相似的原则，用含组分与供试品相似的原料为宜［4］。 标准物质原料的均匀性和稳定性亦是重要的条件。均匀性可保证一批原料所制备的标准物质均匀一致，稳定性可使一批标准物质长期分发使用，以保持效价单位的连续性。为了保持原料的稳定性，标准物质的原料确定后，贮存于避光、少氧、低温条件下，存放和运输过程采取严密的防污染措施［5］。 3 标准品制备

应根据不同标准物质的品种要求进行配制、稀释、分装、冻干和熔封。须加保护剂等物质者，该类物质应对标准物质的活性、稳定性和试验操作过程无影响，并且其本身在干燥时不挥发。经一般质量检定合格后进行分装，要保证整个分装过程的条件对每个标准品是相同的，在分装过程中，温度、湿度要恒定，避免光照，在分装过程中，要以相同间隔时间抽取1%～2%的样品，称量空瓶及分装后瓶中，计算差值求出分装精度，药典要求精确度应在±1%以内［6］，但实际工作中分装精度最好达到0.4%。

冻干的最适条件应用同一批少量标准品进行预实验，摸好条件后再整体冻干。分装后立即进行冻干和熔封。一批标准品应一次完成冻干过程，冷冻速度和温度至关重要。水分含量应不高于3.0%。熔封是保证标准品稳性性的重要因素，熔封前通常需要充入氮气。从干燥器取出安瓿到熔封的时间愈短愈好，以避免吸收水分。整个分装、冻干和熔封过程，应保证对各安瓿间主要指标和稳定性的一致性不产生影响［6］。 4 标准品标定

定量标记免疫分析用国家标准品的定值首先应确定是否有国际标准品，如有，以其

为标准标定待制备的免疫测定用国家标准品；如没有，则依据其它经过验证的方法来制定该标准物质的定值方案和方法。以下仅讨论有国际标准品的情况。 定值通常采用协作标定的方法，在正式协作标定前，组织者应进行预实验，摸清候选标准物质的预期效价。一般需经3个以上有经验的实验室进行协作标定，通常考虑选择不同标记免疫分析方法参加协作标定，以说明标准物质对不同标记免疫分析方法的适用性。在有关厂家试剂盒反应体系的线性范围内，以国际标准品（如有）为对照，对候选品（随要抽样）进行协作标定实验。按照各试剂盒说明书进行实验，根据不同的标记免疫分析原理采用适宜的数学模型进行数据处理和分析，如非竞争性标记免疫分析采用Log-Log双对数数学模型，而竞争抑制法标记免疫分析采用In-Logit数学模型进行分析，标定结果一般应至少取得5次独立的有效结果。在协作标定过程中，要对每组实验中国际标准品和候选品的两条剂量-反应曲线标准曲线斜率进行显著性检验（t检验），要求P＞0.05，即两条曲线不显著偏离平行，表明候选品与国际标准品的“同质性”［7］，在t检验平行的情况下，计算出候选品的免疫活性。最后，组织者收集各协作单位的标定结果，整理统计分析，一般是每一个参与的实验室（试剂盒）计算均值，再用不同实验室（试剂盒）计算均值得出最终的结果。

为了保证新研制标准品的适用性，在选择参与协作标定的试剂盒时应注意其市场上流通性，试剂盒生产企业的代表性及覆盖面，以确定其在实际工作中的适用情况。另外，在标准品换批制备时，应保证原（材）料特性的一致性和稳定性，其生物学特性指标应尽可能与上批标准物质相同或接近。 6 瓶间精密度研究

按照人华人民共和国国家一级标准物质技术规范（JJG1066-94）有关规定，对于均匀性好的样品，当总体单元数少于500时，抽取单元数不少于10个；当总体单元数大于500时，抽取单元数不少于15个。按照以上要求，抽取一定数量的候选

标准物质，平行进行分析测定其免疫活性，冻干后瓶间精密度应该达到4%。 7 稳定性研究

定量标记免疫分析用国家标准品稳定性研究应进行加速破坏试验，根据品种性质放置不同温度（一般放置 -20℃、4℃、25℃、37℃等）不同时间，测定效价变化，以评估其稳定情况。国家标准品建立后应定期与国际标准品比较，观察其稳定性，同时还应对其反复冻融稳定性进行考察。

根据国际惯例，目前免疫测定用国家标准品不设“有效期”，由中检院对其进行定期监测。

8 包装、储存与供应

研制工作的实验室工作完成后，还要经过严格的审评审批，获得签批的标准品应进行贴标签及外包装工作，标签内容一般包括：中文名称、批号及标识量（如效价等），如果超出规定的用途时，使用者应对标准物质的适用性负责。中检院在官网设立了体外诊断试剂标准物质查询专栏，方便用户查询相关品种和下载电子版说明书。说明书内容包括中文名称、英文名称、批号、性状、用途、包装、规格、特性量值、使用方法和要求、储藏条件、注意事项和技术咨询电话等12项内容。其中，“用途”项中明确了所适用的具体方法，如酶联免疫法、化学发光法、荧光免疫法等；“特性量值”项明确了定量用标准品的标示量，如7400ng/支；“使用方法和要求”中涵盖具体的操作方法和要求。

该类标准物质的贮存条件应有利于特性及免疫活性的稳定，通常为低温冷冻保存，其贮存情况应定期检查并记录。某些有特殊贮存要求的，应有特殊的贮存措施，并应在标签与使用说明书中注明。

定量标记免疫分析用国家标准品应有专人负责保管和发放，由中检院直接提供给各生产单位标定其工作参考品或用于产品检定。 附：

表1 中检院定量标记免疫分析用国家标准品序号 名称1 促甲状腺素（TSH）免疫测定用国家标准品2 促黄体生成素（LH）免疫测定用国家标准品3 促卵泡生成激素（FSH）免疫测定用国家标准品4 人生长激素免疫测定用国家标准品5 人绒毛膜促性腺激素β亚单位（hCG-β）免疫测定用国家标准品6 人胎盘泌乳素（HPL）免疫测定用国家标准品7 铁蛋白（Fer）国家标准品8 甲胎蛋白（AFP）免疫测定用国家标准品9 前列腺特异性抗原（PSA）免疫测定用国家标准品10 游离前列腺特异性抗原（f-PSA）免疫测定用国家标准品11 三碘甲腺原氨酸（T3）免疫测定用国家标准品12 甲状腺素（T4）免疫测定用国家标准品13 反三碘甲腺原氨酸（rT3）免疫测定用国家标准品14 胰高血糖素（Glucagon）免疫测定用国家标准品15 人绒毛膜促性腺激素（HCG）免疫测定用国家标准品16 抗甲状腺球蛋白抗体（Anti-TgAb）国家标准品17 抗甲状腺过氧化物酶抗体（Anti-TpoAb）国家标准品 参考文献

【相关文献】

［1］曹丽梅，马双成，马玲云，等.中检所药品、医疗器械标准物质管理新模式—从分散多头管理走向集中统一管理［J］.药物分析杂志，2010，30（10）：1993

［2］国家食品药品监督管理总局.体外诊断试剂注册管理办法（国家食品药品监督管理总局令第5号）

［3］中华人民共和国标准GB/T 21415-2008/ISO 17511：2003.体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性［S］.

［4］马玲云，宁保明，陈国庆，等.国家药品标准物质研制技术要求的介绍.药物分析杂志，2010，30（10）：1990-1992.

［5］丁丽霞，周海钧.生物标准物质的研究和技术要求（上）［J］.中国药师，2007，10（3）：229-231.

［6］王军志.生物技术药物研究开发和质量控制［M］.北京.第2版.科学出版社，2007：138-140. ［7］谭德讲，马双成.药品监督与检定中的统计学应用.北京.科学出版社，2011：327-349.