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下呼吸道分泌物中细菌的分离与鉴定

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・7ll・.论著.下呼吸道分泌物中糠秕马拉色菌的分离与鉴定陈东科许宏涛【摘要】目的对痰涂片镜检可疑为马拉色菌的标本进行马拉色菌的分离培养,并对分离菌株进行系统鉴定。方法收集2010年3月至2011年9月卫生部北京医院经派克墨水染色镜检可疑为马拉色菌的下呼吸道分泌物标本133份,接种于含l%吐温60的科玛嘉琼脂培养基(即改良念珠菌显色培养基),于35℃大气环境中培养。挑取疑似菌落在含0.5%吐温40和0.5%吐温印的沙保弱平板上进行纯培养。采用传统的表型鉴定方法对分离菌株进行鉴定,包括染色镜检观察菌体形态及染色性、沙保弱培养基生长试验、吐温试验、七叶苷分解试验、过氧化氢试验、吐温沉淀试验和蓖麻油试验,可疑菌株采用18srRNA基因序列分析方法对分离菌株进行菌种鉴定。结果镜检可疑的下呼吸道分泌物中马拉色菌分离率为47.4%(63/133),63株分离菌经传统的表型鉴定方法结合18srRNA基因序列分析方法均鉴定为糠秕马拉色菌。标本直接涂片,用派克墨水染色镜下可明显区分马拉色菌和念珠菌。结论糠秕马拉色菌在改良念珠菌显色培养基上的菌落呈粉红色,可明显区别于其他念珠菌菌落,用改良念珠菌显色培养基可提高下呼吸道分泌物中糠秕马拉色菌的分离率。传统的表型鉴定结合基因序列分析可提高马拉色菌鉴定的准确性。f中华捡验医学杂丧,2012,35:711-715)【关键词】马拉色霉菌属;痰;表型;RNA,核糖体,18S;序列分析;细菌学技术IsolationandidentificationofMalassezia.furfurfromlowerrespiratorytractsecretionsCHENDong-ke。XUHo鸭-tOO.DepartmentofClinicalLaboratory,Be日堍HospitaloftheMinistryofHealth,Beijingi00730.ChinaCorrespondingauthor:cHENDong-ke.EmailIv—d-k@263.net【Abstract】ObjectivesTocultureandisolateMalasseziafillfurwhichweresuspectedinsputumsmeal鸭.andthentoidentifytheisolatessystematically.nethodsFromMarch2010toSeptember2011,133lowerrespiratorytractsecretionsampleswerecollectedinBeijingHospitaloftheMinistryofHealthwhichwe托suspectedcontainingMalassezia知咖rbyParkerinkstaining.nIesampleswereinoculatedandcultm刮onCHROMagarmediumscontainingl%Tween60(whichwaE,modifiedfromCandidachromogenicmedia)intheatmosphericenvironmentat35℃.ThesuspectedcolonieswereselectedandculturedonbethSDAplatescontaining0.5%Tween40andSDAplatescontaining0.5%Tween60.Thetraditionalphenotypicidentificationmethodswereusedtoidentifythepurecolonies,includingstaining,growthonSabouraudagarplates,Tweentest,decomposingEscalin,C8tal鹤etest,Tweenprecipitationtestandcastoroiltest.Thenthesuspectedcolonieswereidentifiedbyanalyzingthesequencesofl8srRNAs.ResultsTheisolationrateofMalasseziafurfurfromlowerfll咖rrespiratorytractsecretionswas47.4%(63/133)and63strainswerealSOidantified鹪Malasseziabytraditionalphenotypicidentificationmathodscombinedwiththe18srRNAgenesequenceanalysis.MalasseziacanbesignificantlydistinguishedfromCandidabydirectsmesA"ofthespecimenwithParkerjnkstaining.ConclusionsMalassezia危币‘,Wasfounda8pinkcoloniesOnmodifiedCandidachromogenicmediawhichweresignificantlydifferentfromotherCandidacolonies.TheisolationrateoflowerrespiratorytractsecretionsC8LrIbeimprovedbymodifiedCandidachromogeniemedigTheidentificationaccuracyCanbefunherimprovedbycombiningtraditionalphenotypicidentificationmethodswith18srRNAsequenceanalysis.(C^fnJLabMad。2012。35:71,.715)【Keywords】MalaSsezia;Sputum;Phenotype;RNA,ribosomal,18S;Sequenceanalysis;BacteriologicaltechniquesDOI:10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2012.傩.013马拉色菌为一种嗜脂性酵母,属人体皮肤正常基金项目:国家自然科学基金(30872719)的菌群,也是一种条件致病真菌。到20世纪90年作者单位:100730卫生部北京医院检验科代中期,有学者基于形态学、超微结构、生理生化特通信作者:陈东科.电子信箱:c-d-k@263.net万方数据史堡焦熊医堂盘查垫12生!旦箜翌鲞箜!翅垦竖璺』!些堕鲤,叁坚塾垫!兰:!丛篁:墨垒墨征以及分子生物学的研究,将马抟色菌分为厚皮马拉色菌(Malasseziapachydermatis)、合轴马拉色菌(Malasseziasympodialis)、糠秕马拉色菌(Malasseziafuorur)、钝形马拉色菌(Malasseziaobtusa)、球形马拉色菌(Malasseziaglobosa)、马拉色菌(Malasseziarestricta)和斯洛菲马拉色菌(Malasseziaslooffiae)7个种…。近年来,随着分子生物学研究的进展尤其是核糖体DNA测序和随机扩增多态性分析在真菌分型上的应用,又有皮肤马拉色菌(Malasseziadermatis)江1、马属马拉色菌(Malasseziaequi)HJ、同本马拉色菌(Malasseziajaponica)、大和马拉色菌(Malasseziayamatoensis)¨J、Malassezianal2zz[sj及Malasseziacaprae【6j6种马拉色菌被发现,现已报道的马拉色菌有13个种。然而后6种新的马掩色菌种系发生上与合轴马拉色菌密切相关,还需要对其特征进行更多的研究以确认其为新种171。在易感因素的影响下,马拉色菌与花斑癣、毛囊炎、脂溢性皮炎、特应性皮炎及某些银屑病等疾病的发生密切相关,常侵袭皮肤角质层引起浅部真菌病。在已公认的马拉色菌7个种中,糠秕马拉色菌较为常见,其最常导致的疾病为花斑糠疹,糠秕马拉色菌还可引起败血症、腹膜炎、肺炎等【8]。本研究探讨了临床患者下呼吸道标本中糠秕马拉色菌的分离及鉴定情况。材料与方法一、材料1.标本来源:标本采自2010年3月至2011年9月卫生部北京医院呼吸道感染患者的气管吸痰4500份。直接涂片经革兰染色镜检,镜下找到形态疑似马拉色菌为入选标准,剔除同一患者的重复标本,共133份疑似标本。糠秕马拉色菌ATCCl4521由四川省人民医院喻华老师馈赠,球形马拉色菌CBS9795由上海华山医院抗生素研究所胡付品博士馈赠。2.试剂与仪器:科玛嘉念珠菌显色培养基(CHROMagarTMCandida)为法国柯玛嘉产品,沙保弱琼脂(Sabourauddextroseagar,SDA)购自北京陆桥技术有限责任公司。糠秕马拉色菌分离培养基(筛选平板)为加1%吐温60的科玛嘉念珠菌显色培养基(吐温.科玛嘉平板)。4%蓖麻油的SDA平板,加2%吐温20、40、60、80的SDA,加0.5%吐温40和0.5%吐温60的SDA(菌株传代用),均为本实验室配制。吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、七叶苷斜万方数据面培养基均购自杭州天和微生物试剂有限公司。触酶试剂ID—ASE、革兰染色液购自法国生物梅里埃公司。派克标准墨水(Blue-Blackink)为上海派克笔有限公司产品。蓖麻油为湖北科田药业有限公司产品。橄榄油为西班牙亿芭利橄榄油公司产品。二、方法1.标本筛选:痰标本经革兰染色、镜检,发现有可疑为马拉色菌(革兰染色阳性、成群圆形或卵圆形、单出芽、芽生孢子与母孢子连接处可见颈圈样结构)的标本,另涂片作派克墨水染色,镜检确认(念珠菌孢子不着色)后接种马拉色菌筛选平板。2.菌株分离培养:挑一环镜检阳性的标本接种于吐温科玛嘉平板上,用接种环密涂,于35℃大气环境,孵育2d开始观察。挑取小圆。白色至粉红色,突起,较干燥,有特殊芳香气味的菌落涂片,用派克墨水染色后镜检,疑似菌株在加0.5%吐温40和0.5%吐温60的SDA平板上进行纯培养。孵育至10d无马拉色菌生长为阴性。3.菌株鉴定一o:鉴定过程以糠秕马拉色菌标准菌株ATCCl4521和球形马拉色菌CBS9795做质控对照。4.形态学鉴定:取分离菌株涂片,用500ml/L派克墨水染色后镜下观察形态为卵圆形出芽孢子。5.沙保罗培养基生长试验:将分离菌种接种于SDA培养基上,35℃培养14d,记录生长情况。6.吐温试验:(1)打孑L法:配制0.5麦氏浓度待检菌液,密涂直径90lnmSDA平板,以直径3lnm的无菌钻孔器在平板四周打4个孑L,分别加入100%吐温40、吐温60、吐温80,35℃培养3d后观察生长情况。(2)点种法[I训:配制0.5麦氏浓度待检菌液,吸取菌悬液5出分别滴加于含2%吐温20的SDA培养基上,35℃培养5d,记录结果,明显生长为阳性,不生长为阴性。7.七叶苷分解试验:将待检菌接种于七叶苷琼脂斜面培养基上,并在斜面上滴l滴橄榄油,35℃培养3d,观察培养基的颜色变化。培养基斜面变黑者为阳性,不变色为阴性。8.过氧化氢试验:滴加ID-ASE触酶试剂l滴于吐温一科玛嘉平板上的待检菌菌落上,立即观察,产生气泡则为阳性,不产生气泡为阴性。9.吐温沉淀试验:在加0.5%吐温40和0.5%吐温60的SDA培养基上观察马拉色菌的菌落周围,如果出现白色沉淀圈,即为吐温沉淀试验阳性。10.蓖麻油试验:(1)打孔法:配制0.5麦氏浓尘堡捡监医堂盈盛!!!;笙!旦笙!!盔笙!翅业也』!坐丛坐!,△!!g幽垫!!,坠!:!!:盥!!:!度待检菌液,密涂直径703mmSDA平板,以直径落(见罔2a),在吐温科玛嘉平板l:的菌落形态为粉红色、隆起、圆形、光滑或粗糙的菌落(见图2b),菌落散发m特殊的香味。派克墨水染色镜检马拉色菌菌体形态为卵嘲形、单出芽、芽生孢子与母孢子连接mm的无菌钻孔器在平板上打孔,在孔内加入蓖麻油l滴,35℃培养5d后观察生长情况。(2)点种法…]:配制5麦氏浓度待检菌液,吸取菌悬液l“l滴加于含4%蓖麻油的SDA培养基上,35cC培养5处可见颈圈样结构,个别菌株可见菌丝体(见图3d,记录结果,明显生长为阳性,不生长为阴性。11.18sa)。63株临床分离菌株的菌落与糠秕马拉色菌rRNA基因序列分析:随意抽取5株不ATCCl4521的形态特征一致,镜下形态不同于球形同时间分离的马拉色菌菌株进行基闪序列分析,以糠秕马拉色菌标准菌株ATCCl4521做质控对照。具体方法参照文献[12]进行,获得序列提交美国国家生物技术信息中心(NationalBiotechnologyCenterforInformation,NCBI)GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行序列比对,分析待检真菌与参考序列相似度。Blast序列比对结果与某种系的代表参照序列相比,未知菌株序列的相似性≥99%,未知菌株鉴定为该种。结一、菌株分离结果从133份疑似痰标本分离出63株马拉色菌,分离率为47.4%。63例培养阳性患者的病Ⅸ分布为,呼吸科病房8例(12.7%),呼吸监测室7例(11.1%),急诊科病房14例(22.2%),老年病房23例(36.5%),神内病房4例(6.4%),神外病房3例(4.7%),其他病区4例(6.4%)。二、菌株鉴定结果1.形态学鉴定:革兰染色阳性、成群圆形或卵圆形、单出芽、芽生孢子与母孢子连接处可见颈圈样结构、直径为3—8怫m(见图la),派克墨水染色(见图lb),镜检确认(念珠菌孢子不着色,见图1c)。糠秕马拉色菌ATCCl4521在吐温SDA平板上的菌落形态为奶酪色、隆起、圆形、光滑或粗糙的菌注:n罔为Ⅱi:温SDA平板培养7d;h罔为吡温科玛靠平板培养6d图2马托色菌菌落形惫果飞凹’・o’・o沌:n图为群、!染色的马托色蒲孢千;h…勾派兜聚水染色的75}口色蒲孢f;rl警1为派兜鼹水染包,念珠【辇i孢产4i符乜(×l(xm)田l呼吸道感染患嚣痰涂片万方数据生垡丝堕医堂盘查!Q!!生!且筮!!鲞箜!塑鱼堕!』!坐型型:叁!耻塾!!!!:!!!:箜,堕垒§雹图3。0i分离自呼吸道感染患者马拉色菌镜下形态o泣:aI冬{为临床分离抹【”J见菌丝体);b图为球形马拉色菌cBs9795;c图为糠秕马拉色菌ATCCl4521(a—c囝均为派克墨水染色x1000)马拉色菌CBS9795(见图3b),与糠秕马拉色菌ATCCl4521相似(见图3c),但不同菌株稍有差异。2.沙保弱培养基生长试验:63株马拉色菌在SDA平板上经14d孵育,均不生长。3.吐温试验:试验结果显示,63株马拉色菌对吐温40、吐温60和吐温80的需求为阳性,吐温20为弱阳性。4.七叶苷分解试验:孵育3d后,63株马拉色的致病力较弱,机体免疫力下降是导致系统感染的前提。本研究人组的患者年龄范围为50~104岁,平均84岁,均有基础性疾病,大部分为鼻饲患者,近期或正在使用抗生素(部分患者使用了抗真菌药物),标本均为经气管吸痰,多次送检均分离到糠秕马拉色菌。笔者依据目前临床实验室普遍使用的念珠菌显色培养基(CHROMagar。MCandida),在其中加入了马菌的七叶苷试验结果均为阳性(斜面变黑)。5.过氧化氢试验:63株马拉色菌的过氧化氢试验结果均为阳性。6.吐温沉淀试验:63株马拉色菌的吐温沉淀试验结果均为阳性。7.蓖麻油试验:经5d孵育,63株马拉色菌的蓖麻油试验结果均为阳性。综合上述结果分析,63株临床分离的马拉色菌均符合糠秕马拉色菌的生物学特征。8.DNA测序结果:碱基序列提交美国NCBI的GenBank获取对比指标。5株待测菌测序结果均为糠秕马拉色菌。讨论拉色菌生长必需的脂质物质(系列研究另文报道),结果显示马拉色菌在改良念珠菌显色培养基上的菌落(如图2b所示)可明显区别于其他真菌菌落【9J。用改良念珠菌显色培养基(加1%吐温60)分离可疑痰标本中糠秕马拉色菌的分离率为47.4%(63/133),此方法未见文献报道,可推广到其他标本中糠秕马拉色菌的分离使用。在痰标本涂片镜检中,使用派克墨水染色较革兰染色更能有效地区分马拉色菌和念珠菌(如图1b、c所示),派克墨水在马拉色菌鉴别的特异性方面明显优于革兰染色,尤其体现在对混合标本的检测。在进行吐温试验和蓖麻油试验时,SDA琼脂平板点种法较传统的打孑L法操作更简便、结果易观察和判断,且成本低,本研究结果与文献报道一致Ll啦…。点种法更适用于大批量菌株的检测。由于糠秕马拉色菌是皮肤表面的正常菌群之一,临床上在花斑糠疹病灶部位分离率较高,但由该菌引起的系统性感染病例并不多见。证明该菌是否就是呼吸道致病菌,还要结合临床表现及其他诊断指标是否异常具体分析,63例糠秕马拉色菌培养阳性病例均为长期住院患者,均有鼻饲、气管切开并插马拉色菌属是一种条件致病真菌,仅在某些特殊条件下由孢子相转为菌丝相而致病ur。其致病机制与机体的细胞免疫、体液免疫及非特异免疫有关Ll4。。赵红梅等。。5。的动物实验结果显示,单纯用菌悬液感染免疫功能健全的小鼠或豚鼠均不能引起临床和病理水平上的病变,而在预先进行免疫抑制后才能引起明显的临床和病理改变:提示马拉色菌万方数据・715・管,标本均采自负压吸痰,即使这样对痰培养检出菌的致病性确定要慎重,尤其是真菌。如果作为定植菌考虑也应引起临床医生的关注,毕竟在此之前并没有类似的连续监测的研究报告.在整体状况交叉、species:apracticalapproach.JMyeolMed.1996.6:103・I10.[6]SugitaTM.TakashimaT。ShinodaH,eta1.Newyeastspecies。Malasseffadermatis.isolatedfrompatientswithatopiedermatitis.JClinMicrobi01.2002.40:1363.1367.【7]NellofaA.JamesSA,BondCJ,eta1.IdentificationanddistributionnovelMalasseziaspcci∞yeastonnormalequineskin.Vet反复感染并长期大量使用抗菌药物的患者,定植菌即为条件致病菌也可能成为最终的感染菌。因此,用科学的态度客观地评价该菌在致病中的意义是十分必要的。参[1]Gu6hoBec.2002,150:395-398.[8]Teg[ia0.SchoehPE.CunhaBA.Maktsseziafu币,rinfections.InfectControlHospEpidemi01.1991。12:676-681.[9]陈东科.孙长贵.实用临床微生物学检验与图谱.北京:人民卫生}lj版社,201l:664-667.[10]崔凡.沈永年.徐宏斌,等.马拉色菌属鉴定中吐温试验新方法的研究.实用医院临床杂志.2010,7:384I.考文献MalasseziaE.BoekhoutT,AshbeeHR,eta1.Theroleoftheecologyofhumanskinandspeciesinat;pathogens.Med[11】张瑞峰.冉玉平.代亚玲.油蕈法蓖麻油试验鉴定马拉色菌的研究.四川大学学报(医学版),2010,41:692.695.[12】耿佳靖.袁梁,鲁辛辛.18SrRNA基闲序列分析在临床常见酵缔样真菌鉴定中的应用.中华检验医学杂志,2009,32:644与48.Myeol,1998.36:220-229.[2]SandatzadehimmunitypityriasistoMR,AshbeeHB,CunliffethemycelialphaseofWJ,eta1.Cell—mediatedJDermatol,2001。144:Malassez'ia.spp.inpatientswithversieoiorandcontrols.Br77斟.[13]林元珠.现代儿童皮肤病学.北京:学苑}n版社.2008:252.[14]张海平.陶诗沁,杨莉佳,等.讫斑癣和脂溢性皮炎患者皮损中马托色菌种的鉴定及其分布情况.临床皮肤科杂志,2005。34:666-667.[3]Gup诅AK.Bluhm[4]GaitsnisR.SummerbellR.Pityriaslsversicolor.JEurofAcadDermatolVenem01.2002,16:19-33.G.VelegrakiA.FrangoulisE.eta1.Identification[15]赵红梅.冉玉平,蒋献,等.肾移植患者皮肤脓肿分离出糠秕马拉色菌i例报道.四川大学学报,2005,36:143-146.(收稿日期:201I-10-07)Ma/assez/aMierobiolspeciesfrompatientskinacales,byPCR—RELE.ClinInfect.2002。8:162—173.E,LesourdM.eta1.Identificationof(本文编辑:武昱)【5]GuiBotJ.GuehoMa/assez/a.学界与业内新动态.2012年医学实验室自动化研讨会召开随着实验室自动化在我国的不断发展,实验室建设的方向从标准化和规范化向信息化和智能化转变已经成为趋势。日益成熟的实验室白动化技术应用使得检验技术和管理的统一成为可能,并成为科室要求高效率和高质量的好帮手。同时,不断完善的实验流程能够更好地为患者与临床提供及时、优质的服务。如何行之有效地改善实验室流程成为实验室共同努力的方向。连续两届成功举办医学实验室自动化研讨会后,2012年3月29日在浙江省宁波市,贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司举办的主题为“更快更高更强”的“2012年医学实验室自动化研讨会”成功召开,超过600位临床检验专家与医师出席。会议由第三军医大学西南氏院检验科主任、全国医院感染控制专业委员会副主任委员府伟灵教授与第二军医大学长征医院实验诊断科主任仲人前教授共同主持.卫生部临床榆验中心陈文祥主任、中华检验医学杂志编辑部韩锟主任亦莅临现场致辞。此次研讨会邀请到周内外知名专家进行精彩演讲。深圳市妇幼保健院龙峰主任做了“实验室自动化流水线价值初探”的报告.介绍了通过流水线的引进.推动r医院数字化建设.促进了医院业务的发展,提升了检验科综合实力,完善了实验室生物安全.实现了综合效益的增长。来自美国(张楠)FranciscanHealthSystem主任LindaGuay介绍了。实验室精益流程”;圣约瑟夫医学中心应用k明一精益流程与自动化相结合的成功案例.阐释了未来现代化实验宅的长远发展之路。首都医科大学附属北京安贞医院检验科袁慧主任以“实验室的智能化建设”为题.报告了如何实现检验科各部门一体化.提高检验信息的准确性、稳定性和安全性的内容。中国医药大学附属医院施木青主任的“DM2与TLA协同在实验室IS015189与CAP认证过程中的经验分享”引起强烈反响。他从实验室管理者的角度分析了挑战与对应的战略.突出介绍了DM2的自动化审核功能.及引入之后与1rIA的协同效益;两者的有效结合.协助实验室通过相应认证。此外。芜湖市第二人民医院陈健康主任的“谈发展检验自动化的意义”也引起在场嘉宾的共鸣。会后专家们一起参观了宁波第一人民医院及宁波酆州人民医院.共同探讨、交流实验室自动化对流程改革的意义.关注自动化在中国的发腮前景。与会嘉宾均对此次高层次的自动化研讨会给于充分肯定与积极评价。期待2013年医学实验室自动化研讨会再相聚!万方数据

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