解淀粉芽孢杆菌HZ179及其在制备微生物杀虫剂中的应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 105331557 A (43)申请公布日 2016.02.17

(21)申请号 201510795969.7(22)申请日 2015.11.18(83)生物保藏信息

CGMCC No：11358 2015.09.10

(71)申请人浙江省农业科学院

地址310021 浙江省杭州市江干区石桥路

198号(72)发明人竺利红 施跃峰

(74)专利代理机构杭州中成专利事务所有限公

司 33212

代理人周世骏(51)Int.Cl.

C12R 1/07(2006.01)

C12N 1/20(2006.01)A01N 63/00(2006.01)A01N 63/02(2006.01)A01P 7/04(2006.01)

()发明名称

解淀粉芽孢杆菌HZ179及其在制备微生物杀虫剂中的应用(57)摘要

本发明涉及微生物杀虫剂技术，旨在提供一种解淀粉芽孢杆菌HZ179及其在制备微生物杀虫剂中的应用。该解淀粉芽孢杆菌HZ179保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No：11358。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明菌株对蚜虫有明显的毒杀作用。本发明杀虫剂的有效成分为解淀粉芽孢杆菌HZ179，对人畜无毒，与化学农药相比具有安全的特点。本发明可利用微生物发酵技术制备而成。采用的发酵培养基主要成分均为普通农副产品，发酵周期也比较短，因而生产成本比较低。

权利要求书1页 说明书5页

序列表1页 附图1页

C N 1 0 5 3 3 1 5 5 7 A CN 105331557 A

权 利 要 求 书

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1.解淀粉芽孢杆菌HZ179，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏号为CGMCC No：11358。

2.解淀粉芽孢杆菌HZ179在制备微生物杀虫剂中的应用。3.一种微生物杀虫剂，其特征在于，该微生物杀虫剂的有效成分是：含有解淀粉芽孢杆菌HZ179的水剂，其菌株浓度为108～1010CFU/mL；或是含有解淀粉芽孢杆菌HZ179的粉剂，其菌株浓度为108～1010CFU/g。

4.根据权利要求3所述的微生物杀虫剂，其特征在于，还包括下述载体中的至少一种：防腐剂、乳化剂或紫外保护剂。

5.权利要求3所述微生物杀虫剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用液体深层发酵方法在培养基中进行解淀粉芽孢杆菌HZ179的菌株发酵，得到发酵液；发酵时控制温度为36～39℃，pH值为7～8，发酵时间为25～40小时；

(2)将发酵液调制成水剂或粉剂，调制过程中添加防腐剂、乳化剂或紫外保护剂中的至少一种作为载体；最终得到菌株浓度为108～1010CFU/mL的水剂产品，或是菌株浓度为108～1010CFU/g的粉剂产品。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，培养基中的营养源采用碳源和氮源；所述碳源是淀粉、糊精或葡萄糖；所述氮源是蛋白胨、酵母膏、麸皮、黄豆饼粉、牛肉膏或玉米浆。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在配置培养基时添加食盐、磷酸盐、钾盐或钙盐中的任意一种作为营养成份。

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说 明 书

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解淀粉芽孢杆菌HZ179及其在制备微生物杀虫剂中的应用

技术领域

本发明涉及微生物杀虫剂技术，涉及一种解淀粉芽孢杆菌HZ179及其在制备微生物杀虫剂中的应用。

[0001]

背景技术

蚜虫是我国农业生产中最难防治且常见普发的几类主要害虫之一，在粮食作物和

经济作物中每年均大面积发生。特别是近年来，我国设施栽培发展迅速，已逐渐成为农业现代化的重要载体。设施栽培中防虫网的应用有效减少了瓜绢螟、黄守瓜、斜纹夜蛾等害虫，而蚜虫等小型昆虫因设施的保护迅速成为了重要害虫，已严重影响了设施栽培瓜果蔬菜的产量和商品性。目前对蚜虫的控制主要靠化学农药。事实上，到目前为止，这类害虫几乎已经对所有使用的化学药剂均产生了抗性，已成为抗药性严重和难以治理的害虫之一。调查发现，我国河北等地的棉蚜对抗蚜威的抗性已达7887.7倍；吡虫啉一直来是防治蚜虫等刺吸式害虫最有效的药剂之一，其抗性也已极为严重。另外，蚜虫是各类病毒病害的主要传播载体，鉴于至今国内外还几乎未有一种能真正解决问题的病毒病害防治药剂，目前病毒病害的防治还是主要通过控制蚜虫传播来进行间接预防。所以，当前的农业生产中不论是蚜虫本身的防治，还是病毒病害的预防，均迫切需要高效安全的生物杀虫剂上市。

[0002]

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种解淀粉芽孢杆菌HZ179及其在制备微生物杀虫剂中的应用。[0004] 为解决技术问题，本发明的解决方案是：[0005] 提供一种解淀粉芽孢杆菌HZ179，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏号为CGMCC No：11358。

[0006] 本发明进一步提供了解淀粉芽孢杆菌HZ179在制备微生物杀虫剂中的应用。[0007] 本发明还提供了一种微生物杀虫剂，该微生物杀虫剂的有效成分是：含有解淀粉芽孢杆菌HZ179的水剂，其菌株浓度为108～1010CFU/mL；或是含有解淀粉芽孢杆菌HZ179的粉剂，其菌株浓度为108～1010CFU/g。[0008] 本发明中，还包括下述载体中的至少一种：防腐剂、乳化剂或紫外保护剂。[0009] 本发明进一步提供了所述微生物杀虫剂的制备方法，包括以下步骤：

[0010] (1)利用液体深层发酵方法在培养基中进行解淀粉芽孢杆菌HZ179的菌株发酵，得到发酵液；发酵时控制温度为36～39℃，pH值为7～8，发酵时间为25～40小时；[0011] (2)将发酵液调制成水剂或粉剂，调制过程中添加防腐剂、乳化剂或紫外保护剂中的至少一种作为载体；最终得到菌株浓度为108～1010CFU/mL的水剂产品，或是菌株浓度为

[0003]

108～1010CFU/g的粉剂产品。[0012] 本发明中，培养基中的营养源采用碳源和氮源；所述碳源是淀粉、糊精或葡萄糖；

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说 明 书

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所述氮源是蛋白胨、酵母膏、麸皮、黄豆饼粉、牛肉膏或玉米浆。[0013] 本发明中，在配置培养基时添加食盐、磷酸盐、钾盐或钙盐中的任意一种作为营养成份。

[0014] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：[0015] 1.高效：本发明菌株对蚜虫有明显的毒杀作用。田间药效实验表明,HZ179对瓜蚜具有良好的防治效果(90％以上)。[0016] 2.安全：本发明杀虫剂的有效成分为解淀粉芽孢杆菌HZ179，对人畜无毒，与化学农药相比具有安全的特点。[0017] 3.价廉：本发明可利用微生物发酵技术制备而成。采用的发酵培养基主要成分均为普通农副产品，发酵周期也比较短，因而生产成本比较低。附图说明

[0018]

图1为本发明中液体深层发酵培养的具体工艺流程。

具体实施方式[0019] 一、菌种来源：[0020] 1、本发明所用的微生物菌种为解淀粉芽孢杆菌HZ179，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该中心的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。保藏名称为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏号为CGMCC No：11358，保藏日期为2015年9月10日。[0021] 2、菌种形态及生理生化特征：

[0022] 将解淀粉芽孢杆菌HZ179的菌株在普通琼脂培平板上于37℃培养24小时后，菌落近圆形，干燥，凹陷，边缘不整齐有褶皱，淡黄色，不透明。菌株活化后革兰氏染色、芽孢染色，显微镜下观察，菌体呈杆状，中生芽孢，革兰氏染色阳性。本发明菌株的生理生化特征与解淀粉芽孢杆菌标准菌株相比较见下表1。[0023] 表1 HZ179菌株的生理生化特征

[0024]

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说 明 书

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注：阳性+、阴性-。[0026] 3、16S rRNA基因序列分析：

[0027] 解淀粉芽孢杆菌HZ179的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO：1所示。[0028] 通过对本发明菌株HZ179的形态、生理生化及16S rRNA基因序列分析，发现HZ179菌株与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的同源性为100％，两者处于系统的同一分支。结合本发明菌株的形态及生理生化性状检测结果及其独特的毒杀蚜虫特性，可以判定本发明菌株HZ179为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)新菌株。[0029] 二、微生物杀虫剂的制备：[0030] 1、培养基及培养工艺[0031] 本发明中，微生物杀虫剂的制备方法包括以下步骤：

[0032] (1)利用液体深层发酵方法在培养基中进行解淀粉芽孢杆菌HZ179的菌株发酵，得到发酵液；发酵时控制温度为36～39℃，pH值为7～8，发酵时间为25～40小时；

[0025]

(2)将发酵液调制成水剂或粉剂，调制过程中添加防腐剂、乳化剂或紫外保护剂中的至少一种作为载体；最终得到菌株浓度为108～1010CFU/mL水剂产品，或是菌株浓度为108～1010CFU/g的粉剂产品。

[0034] 液体深层发酵方法是本领域技术人员熟练掌握的技术，属于本领域公知技术，其具体工艺流程见图1。培养基中的营养源采用碳源和氮源；碳源可选淀粉、糊精或葡萄糖；氮源可选蛋白胨、酵母膏、麸皮、黄豆饼粉、牛肉膏或玉米浆。在配置培养基时还可以添加食盐、磷酸盐、钾盐或钙盐中的任意一种作为营养成份。[0035] 本发明中，培养基配置、发酵液调制的方法属于本领域技术人员熟练掌握的技术手段。培养基中碳源和氮源的比例、及食盐、磷酸盐、钾盐或钙盐添加量等数据，均可由使用者根据实际情况进行调整，本发明对此并无特别要求。

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说 明 书

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2、微生物杀虫剂的使用方法：

[0037] 取适量水剂或粉剂形式的HZ179微生物杀虫剂，用清水稀释100-200倍，在田间发生蚜虫的作物上喷洒，防治虫害。[0038] 实施例1：含孢量100亿/ml水剂产品的制备[0039] 在70L发酵罐中，按麸皮2.5％、黄豆饼粉1.5％、玉米淀粉1.0％、酵母膏0.4％、NaCl0.5％、KH2PO40.3％、MgSO40.15％，配成50L培养基，调节pH为7.0，121℃下30min后冷却至38℃，按5％比例接种生产菌，经38℃振荡培养36小时，即得含孢量55亿/mL的发酵液。该发酵液经沉淀浓缩后稀释成含孢量为100亿/ml的悬液，再加入0.12％苯甲酸钠、10％皂素作分别作为防腐剂和乳化剂，即得产品。该产品含孢量100亿/ml，悬浮率65-90％，pH4.5-7.0，细度为95％过100目筛。[0040] 实施例2：含孢量1亿/ml水剂产品的制备[0041] 在70L发酵罐中，按葡萄糖3.0％、黄豆饼粉2.5％、玉米浆1.5％、NaCl0.3％、MgSO40.15％，配成50L培养基，调节pH为8.0，121℃下30min后冷却至39℃，按5％比例接种生产菌，经39℃振荡培养25小时，即得含孢量30亿/mL的发酵液。该发酵液经稀释后成含孢量为1亿/ml的悬液，再加入0.15％苯甲酸钠、10％皂素作分别作为防腐剂和乳化剂，即得产品。该产品含孢量1亿/ml，悬浮率70-90％，pH4.5-7.0，细度为95％过100目筛。[0042] 实施例3：含孢量60亿/ml水剂产品的制备[0043] 在70L发酵罐中，按甘薯淀粉3.0％、蛋白胨1.0％、牛肉膏0.5％、NaCl0.5％，配成50L培养基，调节pH为7.5，121℃下30min后冷却至36℃，按5％比例接种生产菌，经36℃振荡培养40小时，即得含孢量40亿/mL的发酵液。该发酵液经沉淀浓缩后成含孢量为60亿/ml的悬液，再加入0.15％苯甲酸钠、10％皂素作分别作为防腐剂和乳化剂， 即得产品。该产品含孢量60亿/ml，悬浮率70-90％，pH4.5-7.0，细度为95％过100目筛。[0044] 实施例4：含孢量50亿/g粉剂产品的制备[0045] 在70L发酵罐中，按糊精4.0％、蛋白胨1.5％、牛肉膏0.5％、NaCl0.45％、KH2PO40.25％、CaCO30.05％，配成50L培养基，调节pH为7.5，121℃下30min后冷却至36℃，按5％比例接种生产菌，经36℃振荡培养40小时，即得含孢量40亿/mL的发酵液。该发酵液经沉淀浓缩后加10％硅藻土作为填料，干燥后得含孢量为50亿/g的粉末，并加入0.1％抗坏血酸(VC)作为紫外保护剂，即得产品。该产品含孢量50亿/g，细度为95％过100目筛。

[0046] 实施例5：含孢量100亿/g粉剂产品的制备[0047] 在70L发酵罐中，按玉米淀粉4.0％、黄豆饼粉1.0％、蛋白胨0.5％、NaCl0.35％、KH2PO40.25％、MgSO40.15％，配成50L培养基，调节pH为8.0，121℃下30min后冷却至38℃，按5％比例接种生产菌，经38℃振荡培养30小时，即得含孢量45亿/mL的发酵液。该发酵液经沉淀浓缩后加10％硅藻土作为填料，干燥后得含孢量为100亿/g的粉末，并加入0.3％抗坏血酸(VC)作为紫外保护剂，即得产品。该产品含孢量100亿/g，细度为95％过100目筛。

实施例6：含孢量1亿/g粉剂产品的制备

[0049] 在70L发酵罐中，按甘薯淀粉2.0％、葡萄糖1.0％、玉米浆2.5％、酵母膏0.5％、MgSO40.15％、CaCO30.05％，配成50L培养基，调节pH为7.0，121℃下30min后冷却至39℃，

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说 明 书

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按5％比例接种生产菌，经39℃振荡培养25小时，即得含孢量35亿/mL的发酵液。该发酵液经稀释后加10％硅藻土作为填料，干燥后得含孢量为1亿/g的粉末，并加入0.5％糊精作为紫外保护剂，即得产品。该产品含孢量1亿/g，细度为95％过100目筛。[0050] 应用实例：HZ179防治瓜蚜[0051] 1、供试药剂和浓度：

[0052] 取实施例3中的HZ179制剂，用清水分别稀释100倍、150倍、200倍，以稀释液作为供试药剂；对照药剂为40％乐果乳油800倍稀释液，空白对照为清水。[0053] 2、试验方法：[00] 试验作物为棉花，试验面积为666.7m2，共4个处理，重复3次，随机区组排列，用量按每666.7m245Kg药液量进行全株均匀喷雾。喷药前随机选择3点，每点选择5 株作为定点调查株，每株定点调查5张叶片活虫数。喷药后1天、3天调查残存活虫数，计算虫口减退率和校正防效。

[0055] 虫口减退率(％)＝[(施药前活虫数—施药后活虫数)/施药前活虫数]×100[0056] 校正防效(％)＝[(处理区虫口减退率-对照区虫口减退率)/(100-对照区虫口减退率)]×100[0057] 3、试验结果：

[0058] 表2 HZ179防治瓜蚜田间药效

[0059]

由表2可以看出，HZ179制剂100倍稀释液对瓜蚜有很好的防效，喷药后1天即发

生作用，3天后防效为92.2％，优于40％乐果乳油800倍稀释液(88.0％)。HZ179制剂150倍、200倍稀释液对瓜蚜的防效分别为85.6％、73.6％。

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序 列 表

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说 明 书 附 图

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图1

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