高效液相色谱-蒸发光散射法测定烟草中的高级脂肪酸

刘江生;张鼎方;赖伟玲;蔡国华;林艳;洪祖灿;包可翔

【摘 要】研究了以3 mol/L氢氧化钾-乙醇溶液作皂化剂,高效液相色谱-蒸发光散射法同时测定烟草中5种高级脂肪酸的方法.结果表明:亚麻酸、亚油酸、棕榈酸、油酸和硬脂酸的回收率为96.5%～102.3%,相对标准偏差分别为

1.53%,2.85%,2.09%,2.35%,1.92%.该方法适合烟草中这5种高级脂肪酸的同时检测.%A method for determining five high fatty acids in tobacco by reversed-phase high performance liquid chromatography with an evaporative light-scatter detector using 3 mol/L KOH-C2H5OH solution as a saponifier was studied.The results indicated that the relative standard deviations of linolenic, linoleic, palmitic, oleic and stearic acids were 1.53％ , 2.85％ , 2.09％ , 2.35％ , 1.92％ , respectively; and their recoveries ranged from 96.5％ to 102.3％.The method was suitable for the simultaneous determination of those five high fatty acids in tobacco. 【期刊名称】《烟草科技》 【年(卷),期】2011(000)003 【总页数】4页(P55-58)

【关键词】高效液相色谱;蒸发光散射;烟草;高级脂肪酸 【作 者】刘江生;张鼎方;赖伟玲;蔡国华;林艳;洪祖灿;包可翔

【作者单位】福建中烟技术中心龙岩工作站,福建省龙岩市新罗区乘风路1299号,3000;福建中烟技术中心龙岩工作站,福建省龙岩市新罗区乘风路1299

号,3000;福建中烟技术中心龙岩工作站,福建省龙岩市新罗区乘风路1299号,3000;福建中烟技术中心龙岩工作站,福建省龙岩市新罗区乘风路1299号,3000;福建中烟技术中心龙岩工作站,福建省龙岩市新罗区乘风路1299号,3000;福建中烟技术中心龙岩工作站,福建省龙岩市新罗区乘风路1299号,3000;福建中烟技术中心龙岩工作站,福建省龙岩市新罗区乘风路1299号,3000 【正文语种】中 文 【中图分类】TS411.1

高级脂肪酸是评价烤烟品质的有效指标［1-2］。常用的分析高级脂肪酸的方法是将其衍生为甲酯类化合物，然后用气相色谱(GC)［3］、气相色谱/质谱(GC/MS)［3］或高效液相色谱法(HPLC)测定［4］。柱前衍生化的缺点是衍生过程中易发生异构化、氧化、分解等副反应，而且很难保证衍生化完全。蒸发光散射检测器(ELSD)是一种质量检测器，是基于不挥发的样品颗粒对光的散射程度与其质量成正比进行检测的，具有稳定性好，灵敏度高等特点，已在烟草中的水溶性糖检测中得到应用［5-6］，然而利用HPLC/ELSD检测烟草中的高级脂肪酸鲜有报道。因此，进行了本研究，旨在建立一种同时检测烟草中5种高级脂肪酸的方法。 (1)试剂与烟样:氢氧化钾、盐酸、无水乙醇(AR，北京化工厂);甲醇(色谱纯，Tedia公司);超纯水(电阻值＞18MΩ);0.45μm微孔滤膜(有机系，德国赛多利斯公司);2007年云南曲靖C3F烟叶样品(龙岩烟草工业有限责任公司提供)。 (2)标样:亚麻酸、亚油酸(纯度＞99%，百灵威公司);油酸(纯度＞97%，百灵威公司);棕榈酸(纯度＞97%，瑞士Fluka chemika公司);硬脂酸(纯度＞97%，Sigma公司)。

(3)仪器:Waters 2695 Alliance高效液相色谱系统(美国Waters公司)，配备四元

梯度泵、Empower色谱工作站、Alltech ELSD2000蒸发光散射检测器(美国Alltech公司);Milli-Q超纯水处理器(美国Millipore公司);AE240电子分析天平(感量0.00001 g，瑞士Mettler公司)。

称取1.0 g 40～60目的烟草样品，加入50 mL 3 mol/L KOH－乙醇溶液，于60℃水浴中皂化20 min，冷却至室温，加入20 mL蒸馏水，混匀，用20%(质量分数)盐酸调pH至3～4，用无水乙醚萃取2次，30 mL/次 ，合并醚层，用30 mL蒸馏水反萃取乙醚相，醚层用氮气吹干，残余物用无水乙醇溶解、定容至2 mL，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液取样进行HPLC/ELSD分析，分析条件为:

色谱柱:Waters Altiantis C18柱(250 mm × 4.6 mm i.d.，5μm);流动相:甲醇(A)、1%(体积分数)乙酸水溶液(B)，流速1.0 mL/min;梯度洗脱程序:80%(体积分数，下同)A+20%柱温:25℃;ELSD的漂移管温度:70℃;ELSD的载气:氮气，流速1.7 L/min;进样量:15 μL。

以标准样品的色谱峰保留时间定性，峰面积外标法定量。

为选择适宜的皂化剂浓度，在样品量一定，皂化温度60℃，皂化时间20 min的条件下，分别用1，2，3，4 mol/L KOH－乙醇溶液进行了烟丝皂化试验，结果如表1。由表1可知，随着KOH－乙醇溶液浓度的增大，5种高级脂肪酸的测定值先增大后趋于平缓，KOH－乙醇溶液浓度由1 mol/L上升到3 mol/L时，5种高级脂肪酸的测定值显著增大，这是由于碱溶液在反应中有两种作用:一是作为皂化反应的催化剂－氢氧根离子的来源，二是碱与皂化反应生成的游离酸结合，促使反应进行彻底，所以KOH－乙醇溶液浓度越大，皂化反应速度越快，皂化越完全。当KOH－乙醇溶液浓度超过3 mol/L后，碱溶液浓度对5种高级脂肪酸的测定值影响不显著，这可能是KOH－乙醇溶液浓度过高时在增大了氢氧根离子浓度的同时也使体系黏度增大，而体系黏度的增加使离子扩散阻力增大。因此本研究采用3 mol/L的KOH－乙醇溶液作皂化剂。

在样品量一定，皂化温度为60℃，KOH－乙醇溶液浓度为3 mol/L条件下，分别皂化10，15，20和30 min，结果如表2所示。由表2可知，皂化时间不超过20 min时，5种高级脂肪酸的测定值随着皂化时间的延长而增大，皂化时间越长，皂化程度越高，相应的高级脂肪酸含量越大。皂化时间由20 min增加到30 min时，5种高级脂肪酸的测定值变化不大，说明皂化已经比较完全，因此选定皂化时间为20 min。

在皂化时间20 min，KOH－乙醇溶液浓度3 mol/L条件下，考察了反应温度分别为50，55，60和70℃时对5种高级脂肪酸测定值的影响，结果如表3所示。由表3可知，皂化温度在60℃以下时，5种高级脂肪酸的测定值随温度升高而增大，60℃以上时，5种高级脂肪酸含量变化不明显，说明在60℃以下，随温度升高，皂化程度相应地增加，到60℃时，皂化反应已达到平衡，因此选择皂化温度为60℃。

漂移管的温度和载气流速对基线的稳定性和物质的响应值有较大影响，温度过高、载气流速太大时，基线稳定，但响应值小，反之，基线易漂移［5］。ELSD厂商提供的参考操作参数为:流动相甲醇与水的体积比80∶20和95∶5，漂移管温度 71 和 62.8 ℃，氮气流速1.9和1.7 L/min。为选择适宜的分离与检测条件，对不同漂移管温度(60，65，70，80℃)分别进行不同载气流速(1.7，1.8，1.9，2.0 L/min)的分离检测试验，观察对照样品的信号强度。结果表明，漂移管温度为70℃，气体流速为1.7 L/min时基线平稳，在较小噪声水平上有适宜的响应。故确定漂移管温度70℃，气体流速 1.7 L/min。

在本实验选定的条件下，不管是混合标样，还是烟草样品中这5种高级脂肪酸40 min内都可以得到较好分离(图1)。

分别准确称取亚麻酸、亚油酸、棕榈酸、油酸、硬脂酸 50.1，62.8，.5，58.2 和 53.1 mg，均置于同一只100 mL容量瓶中，加少许无水乙醇，在50℃水浴中

溶解后取出，冷却至室温，用无水乙醇定容，得混合标准储备液。取 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL 标准储备液，分别倾入100 mL容量瓶中，用乙醇定容，得到高级脂肪酸标准混合溶液。按照浓度由低至高顺序分别对标准混合溶液进行 HPLC/ELSD测定，并将测得的ELSD峰面积(y)与标准溶液浓度(x)进行线性回归，得5种高级脂肪酸的标准曲线回归方程(表4)。再将最小浓度的标准溶液逐级稀释，反复测定，以信噪比S/N=3时对应的标准溶液的质量浓度为检测限，以信噪比S/N=10时对应的标准溶液的质量浓度为定量限(表4)。从表4可以看出，5种高级脂肪酸标准曲线的相关关系较好，在 2.51 ～25.10，3.14 ～31.40，2.73 ～27.30，2.91 ～ 29.10，2.66 ～ 26.60 mg/L 浓度范围内，亚麻酸、亚油酸、棕榈酸、油酸和硬脂酸的峰面积分别与其质量浓度呈良好线性关系，适合定量。5种高级脂肪酸的检测限均小于0.05 μg/mL，定量限均小于0.17 μg/mL，说明本方法比较准确。

取相同的样品2份，其中1份作为基准，另1份分别加入 6.39，2.25，3.45，2.11 和 0.65 g 亚麻酸、亚油酸、棕榈酸、油酸和硬脂酸，采用本方法重复测定6次，根据基准测定含量、加标量和加标测定量计算回收率，根据平均值和标准偏差计算精密度，结果见表5。由表5可见，5种高级脂肪酸的回收率在96.5% ～102.3%，RSD 在1.53% ～2.85%，说明方法回收率较高，精密度良好。 建立了以KOH－乙醇溶液作皂化剂，采用高效液相色谱－蒸发光散射法检测烟草中亚麻酸、亚油酸、棕榈酸、油酸、硬脂酸的方法。本方法简单、准确、重复性好，适合烟草中这5种高级脂肪酸的同时检测。

【相关文献】

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