一种动物单细胞悬液的制备方法及其应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 112695011 A(43)申请公布日 2021.04.23

(21)申请号 202011605030.7(22)申请日 2020.12.29

(71)申请人 广州基迪奥生物科技有限公司

地址 510320 广东省广州市国际生物岛螺

旋三路6号第五层501、502单元(72)发明人 周煌凯　高川　陈飞钦　夏昊强　徐毓璇　梁国霞　(74)专利代理机构 广州科沃园专利代理有限公

司 44416

代理人 张帅(51)Int.Cl.

C12N 5/071(2010.01)C40B 50/06(2006.01)C12Q 1/6806(2018.01)

权利要求书1页 说明书6页 附图2页

(54)发明名称

一种动物单细胞悬液的制备方法及其应用(57)摘要

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种动物单细胞悬液的制备方法及其应用。本发明提供的制备方法，主要包括取样、酶解、重悬洗涤、活性计数等过程，采用本发明所述的制备方法可以制备出活性高达95％的单细胞悬液，且能够应用在多个物种不同组织单细胞悬液制备，可满足各类高通量单细胞测序平台的细胞悬液质量要求，具有很高的应用价值。

CN 112695011 ACN 112695011 A

权　利　要　求　书

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1.一种动物单细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、将目的组织用预冷的5mL、1×PBS缓冲液洗掉血渍，然后将组织剪成1mm3的小块，将其置于2mL的离心管中，然后向离心管中加入1mL的酶混合液，制得预混液；

S2、将步骤S1制得的预混液置于37℃下解离20～50min，然后取10μL解离物置于电子显微镜下观察，至清楚看到细胞且无团块，停止解离，制得解离细胞液；

S3、将步骤S2制得的解离细胞液转入15mL离心管中，加入3mL预冷的1×PBS缓冲液，并用细胞筛过滤1～2次，然后离心，去掉上清液，制得细胞沉淀；

S4、向步骤S3制得的细胞沉淀中加入1mL预冷的1×PBS缓冲液，用移液枪吹打混匀，重悬细胞，然后加入3mL红细胞裂解液，充分混匀，于室温下静置1～5min，制得细胞裂解物；

S5、将步骤S4制得的细胞裂解物重悬、离心处理，重复2次，去除上清液，用细胞筛过滤1用3mL预冷的1×PBS缓冲液冲洗一次，离心去除上清液，制得细胞沉淀；～2次，S6、将步骤S5制得的细胞沉淀用天然杀菌剂洗涤2～3次，然后离心，去掉上清液，向沉淀中加入预冷的1×PBS缓冲液，利用显微镜细胞计数板，台盼蓝染色检测细胞浓度、活性，筛选浓度在800‑1500个/μL，活性＞80％的细胞，置于冰上，即得。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1、S3～S6中所述的预冷的1×PBS缓冲液为4℃预冷、含质量百分数为0.04％的BSA的缓冲液。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述的酶混合液包含1000μL、37℃预热的、含0.04％BSA的1×HBSS缓冲液，质量百分数为10％的胶原蛋白酶，质量百分数为5％中性蛋白酶，2U/mL的DNA酶I，质量百分数为10％的透明质酸酶。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3所述的细胞筛孔径为70μm，所述离心过程为于4℃，1600～1700rpm转速下离心4～6min。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S4所述的红细胞裂解液的制备过程为将8.29g NH4Cl，1g KHCO3，37.2mg EDTA‑2Na混合，加蒸馏水定容至1000ml，调节PH至7.4。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S5所述的重悬、离心处理，重复2次的具体操作为：将细胞裂解物置于5mL、1×PBS下重悬细胞，然后4℃水平离心机，1600～1700rpm离心4～6min；吸走上清液，向沉淀中再次加入5mL预冷的1×PBS，重悬细胞，4℃水平离心机，1600～1700rpm离心4～6min，去掉上清液。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S5所述的细胞筛孔径为40μm，所述离心过程为于4℃，1600～1700rpm转速下离心4～6min。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S6所述的天然杀菌剂由质量百分数为10％的山梨酸溶液与质量百分数为15％的酒石酸溶液按体积比7～10：1～4组成；所述离心过程为于4℃，1600～1700rpm转速下离心4～6min。

9.一种利用权利要求1所述的制备方法在构建单细胞转录组测序文库中的应用。10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，将制备的细胞悬液置于冰上，于30min内建库。

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一种动物单细胞悬液的制备方法及其应用

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技术领域

[0001]本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种动物单细胞悬液的制备方法及其应用。

背景技术

[0002]目前新一代高通量单细胞测序平台(例如，以10×genomics平台为代表)以高通量、低价格和单分子分辨率和高稳定性，能从不同大分子层面来研究单个细胞，成为单细胞研究的重要技术研究方式，可广泛应用于肿瘤、发育生物学、微生物学、神经科学等重要领域。由于高通量单细胞测序仪器一般要求细胞在液相中实现流动分选，所以要求投入的样本必须为细胞悬液。然而在实际研究过程中，往往因细胞悬液的细胞总量不够、细胞活性不高、细胞成团、细胞碎片等问题达不到上机建库要求，很多研究项目因悬液质量问题而被迫取消，因此，亟待开发一套成熟的方法用于制备合格的单细胞动物悬液。[0003]目前酶消化法是制备实体组织单细胞悬液最常用的方法，首先需要破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等，其次破坏组织细胞的紧密连接结构的蛋白，再清除组织粘多糖物质。中国发明专利CN111621466A公开了一种肺动脉组织单细胞悬液的制备方法，中国专利CN110951683A和CN110747164A均公开了一种牙髓干细胞的制备方法，中国专利CN104357395A公开了从胃癌组织中高效分选单核样骨髓来源免疫抑制细胞的方法，中国专利CN107748130A公开了一种动物心脏单细胞悬液的制备及检测方法，但这些方法都只针对某一类组织，应用场景有限。中国发明专利CN111647549A公开了一种动植物中单细胞的分离方法，该方法中使用的硝酸镧含有金属离子镧，会抑制反转录酶的活性，影响后续单细胞转录组测序文库构建的数据质量，而且，硝酸镧属于化学危险品，对人体有害且具有助燃性。

[0004]基于上述缺陷，中国发明专利CN111088222A公开了一种脂肪组织的单细胞悬液的制备方法，该方法虽然具有步骤简单，获得的细胞数量多，制得的单细胞悬液可用于10×Genomics等高通量单细胞测序平台等优点，但是采用该方法制得的细胞活性仍然在90％以下，且该方法涉及到的酶较多，在制备过程中，细胞容易被杂菌污染。[0005]综上可知，开发一种高通量单细胞测序平台通用的，易于操作的动物单细胞悬液制备方法迫在眉睫。

发明内容

[0006]基于现有技术普遍存在的缺陷，本发明提供了一种动物单细胞悬液的制备方法及其应用。采用本发明所述的制备方法可以制备出活性高达95％的单细胞悬液，且能够应用在多个物种不同组织单细胞悬液制备，具有很高的应用价值。[0007]为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：[0008]一种动物单细胞悬液的制备方法，包括如下步骤：[0009]S1、将目的组织用预冷的5mL、1×PBS缓冲液洗掉血渍，然后将组织剪成1mm3的小

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块，将其置于2mL的离心管中，然后向离心管中加入1mL的酶混合液，制得预混液；[0010]S2、将步骤S1制得的预混液置于37℃下解离20～50min，然后取10μL解离物置于电子显微镜下观察，至清楚看到细胞且无团块，停止解离，制得解离细胞液；[0011]S3、将步骤S2制得的解离细胞液转入15mL离心管中，加入3mL预冷的1×PBS缓冲液，并用细胞筛过滤1～2次，然后离心，去掉上清液，制得细胞沉淀；[0012]S4、向步骤S3制得的细胞沉淀中加入1mL预冷的1×PBS缓冲液，重悬细胞，然后加入3mL红细胞裂解液，充分混匀，于室温下静置1～5min，制得细胞裂解物；[0013]S5、将步骤S4制得的细胞裂解物重悬、离心处理，重复2次，去除上清液，用细胞筛过滤1～2次，用3mL预冷的1×PBS缓冲液冲洗一次，离心去除上清液，制得细胞沉淀；[0014]S6、将步骤S5制得的细胞沉淀用天然杀菌剂洗涤2～3次，然后离心，去掉上清液，向沉淀中加入预冷的1×PBS缓冲液，利用显微镜细胞计数板，台盼蓝染色检测细胞浓度、活性，筛选浓度在800‑1500个/μL，活性＞80％的细胞，置于冰上，即得。[0015]优选地，步骤S1、S3～S6中所述的预冷的1×PBS缓冲液为4℃预冷、含质量百分数为0.04％的BSA的缓冲液。[0016]优选地，步骤S1所述的酶混合液包含1000μL、37℃预热的、含0.04％BSA的1×HBSS缓冲液，10％胶原蛋白酶，5％中性蛋白酶，2U/mL的DNA酶I，10％的透明质酸酶。[0017]优选地，步骤S3所述的细胞筛孔径为70μm，所述离心过程为于4℃，1600～1700rpm转速下离心4～6min。[0018]优选地，步骤S4所述的红细胞裂解液为将8.29g NH4Cl，1g KHCO3，37.2mg EDTA‑2Na混合，加蒸馏水定容至1000mL，调节PH至7.4。[0019]优选地，将细胞裂解物置于步骤S5所述的重悬、离心处理，重复2次的具体操作为：5mL、1×PBS下重悬细胞，然后4℃水平离心机，1600～1700rpm离心4～6min；吸走上清液，向沉淀中再次加入5mL预冷的1×PBS，重悬细胞，4℃水平离心机，1600～1700rpm离心4～6min，去掉上清液。[0020]优选地，步骤S5所述的细胞筛孔径为40μm，所述离心过程为于4℃，1600～1700rpm转速下离心4～6min。[0021]优选地，步骤S6所述的天然杀菌剂由质量百分数为10％的山梨酸溶液与质量百分数为15％的酒石酸溶液按体积比7～10：1～4组成；所述离心过程为于4℃，1600～1700rpm转速下离心4～6min。

[0022]本发明还提供了一种利用所述的制备方法在构建单细胞测序文库中的应用。[0023]优选地，将制备的细胞置于冰上，于30min内建库。[0024]本发明，首次提供了一种用于动物单细胞悬液的制备方法，而本发明，在制备过程中，添加了一种混合酶，通过调整各种酶的添加量，根据组织类型看细胞消化效果进行调整，可以实现不同物种、多个部位单细胞悬液的制备，同时又使其可以满足高通量单细胞测序平台的特殊细胞悬液质量需求。[0025]在此基础上，发明人还采用自制的天然杀菌剂对细胞沉淀进行处理，消除在制备过程中可能滋生的细菌，降低了细菌杀死细胞的风险，进一步保证了本发明方法制备的单细胞悬液的活性。使得细胞活性维持在95％以上。[0026]此外，需要注意的是，本发明的提供的制备方法适用于动物细胞尤其是哺乳动物

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细胞，如果制备单细胞悬液的组织不是哺乳动物，则不需要进行步骤S4的裂解及后续静置过程。

[0027]与现有技术，本发明提供的单细胞悬液的制备方法具有如下优势：[0028](1)本发明提供的制备方法，添加了一种混合酶，通过调整酶的添加量，可以实现不同物种、不同组织部位单细胞悬液的制备，同时又可以满足高通量单细胞测序平台的特殊细胞悬液质量需求；[0029](2)本发明提供的制备方法，对细胞进行杀菌，有效提高了细胞的活性，使细胞活性维持在95％以上。

附图说明

[0030]图1为解离后细胞形态图；[0031]图2为显微镜下的细胞浓度图；

[0032]图3为经台盼蓝染色后的细胞活性图。

具体实施方式

[0033]下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。

[0034]实施例1一种动物单细胞悬液的制备方法[0035]所述动物单细胞悬液的制备方法，包括如下步骤：[0036]S1、将小鼠皮肤组织用4℃预冷的5mL、含质量百分数为0.04％的BSA的1×PBS缓冲液洗掉血渍，然后将组织剪成1mm3的小块，将其置于2mL的离心管中，然后向离心管中加入1mL的酶混合液，制得预混液；所述的酶混合液包含1000μL、37℃预热的、含0.04％BSA的1×PBS缓冲液，10％胶原蛋白酶20μL，5％中性蛋白酶10μL，2U/mL的DNA酶I1μL，10％的透明质酸酶5μL；[0037]S2、然后取10μL解离物置于电子显将步骤S1制得的预混液置于37℃下解离20min，微镜下观察，至清楚看到细胞且无团块(具体镜检结果如图1)，停止解离，制得解离细胞液；[0038]S3、将步骤S2制得的解离细胞液转入15mL离心管中，加入3mL、4℃预冷的含0.04％BSA的1×PBS缓冲液，并用孔径为70μm的细胞筛过滤1次，然后于4℃、1600rpm转速下离心4min，去掉上清液，制得细胞沉淀；[0039]S4、向步骤S3制得的细胞沉淀中加入1mL、4℃预冷的含质量百分数为0.04％的BSA的1×PBS缓冲液，重悬细胞，然后加入3mL红细胞裂解液，充分混匀，于室温下静置1min，制得细胞裂解物；所述红细胞裂解液为将8.29g NH4Cl，1g KHCO3，37.2mg EDTA‑2Na混合，加蒸馏水定容至1000mL，调节PH至7.4；[0040]S5、将步骤S4制得的细胞裂解置于5mL、1×PBS下重悬细胞，然后4℃水平离心机，1600rpm离心4min；吸走上清液，向沉淀中再次加入5mL预冷的1×PBS，重悬细胞，4℃水平离心机，1600rpm离心4min，去掉上清液，用孔径为40μm的细胞筛过滤1次，用3mL、4℃预冷的含质量百分数为0.04％的BSA的1×PBS缓冲液冲洗一次，于4℃、1600rpm转速下离心4min，去

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除上清液，制得细胞沉淀；[0041]S6、将步骤S5制得的细胞沉淀用天然杀菌剂洗涤2次，然后于4℃、1600rpm转速下离心4min，去掉上清液，向沉淀中加入4℃预冷的含质量百分数为0.04％的1×PBS缓冲液，利用显微镜细胞计数板，台盼蓝染色检测细胞浓度、活性(具体结果见图2、图3)，筛选浓度在800‑1500个/μL，活性＞80％的细胞，置于冰上，即得；所述天然杀菌剂由质量百分数为10％的山梨酸溶液与质量百分数为15％的酒石酸溶液按体积比7：1组成。[0042]实施例2一种动物单细胞悬液的制备方法[0043]所述动物单细胞悬液的制备方法，包括如下步骤：[0044]S1、将小鼠肾脏组织用4℃预冷的5mL、含质量百分数为0.04％的BSA的1×PBS缓冲液洗掉血渍，然后将组织剪成1mm3的小块，将其置于2mL的离心管中，然后向离心管中加入1mL的酶混合液，制得预混液；所述的酶混合液包含1000μL、37℃预热的、含0.04％BSA的1×PBS缓冲液，10％胶原蛋白酶10μL，5％中性蛋白酶10μL，2U/mL的DNA酶I1μL，10％的透明质酸酶5μL；[0045]S2、将步骤S1制得的预混液置于37℃下解离50min，然后取10μL解离物置于电子显微镜下观察，至清楚看到细胞且无团块(结果与图1相近)，停止解离，制得解离细胞液；[0046]S3、将步骤S2制得的解离细胞液转入15mL离心管中，加入3mL、4℃预冷的含0.04％BSA的1×PBS缓冲液，并用孔径为70μm的细胞筛过滤2次，然后于4℃、1700rpm转速下离心6min，去掉上清液，制得细胞沉淀；[0047]S4、向步骤S3制得的细胞沉淀中加入1mL、4℃预冷的含质量百分数为0.04％的BSA的1×PBS缓冲液，重悬细胞，然后加入3mL红细胞裂解液，充分混匀，于室温下静置5min，制得细胞裂解物；所述红细胞裂解液为将8.29g NH4Cl，1g KHCO3，37.2mg EDTA‑2Na混合，加蒸馏水定容至1000mL，调节PH至7.4；[0048]S5、将步骤S4制得的细胞裂解置于5mL、1×PBS下重悬细胞，然后4℃水平离心机，1600rpm离心6min；吸走上清液，向沉淀中再次加入5mL预冷的1×PBS，重悬细胞，4℃水平离心机，1700rpm离心6min，去掉上清液，用孔径为40μm的细胞筛过滤2次，用3mL、4℃预冷的含质量百分数为0.04％的BSA的1×PBS缓冲液冲洗一次，于4℃、1700rpm转速下离心6min，去除上清液，制得细胞沉淀；[0049]S6、将步骤S5制得的细胞沉淀用天然杀菌剂洗涤2次，然后于4℃、1700rpm转速下离心6min，去掉上清液，向沉淀中加入4℃预冷的含质量百分数为0.04％的1×PBS缓冲液，利用显微镜细胞计数板，台盼蓝染色检测细胞浓度、活性(结果与图2、图3相近)，筛选浓度在800‑1500个/μL，活性＞80％的细胞，置于冰上，即得；述的天然杀菌剂由质量百分数为10％的山梨酸溶液与质量百分数为15％的酒石酸溶液按体积比10：4组成。[0050]实施例3一种动物单细胞悬液的制备方法[0051]所述动物单细胞悬液的制备方法，包括如下步骤：[0052]S1、将小鼠肠道组织用4℃预冷的5mL、含质量百分数为0.04％的BSA的1×PBS缓冲液洗掉血渍，然后将组织剪成1mm3的小块，将其置于2mL的离心管中，然后向离心管中加入1mL的酶混合液，制得预混液；所述的酶混合液包含1000μL、37℃预热的、含0.04％BSA的1×PBS缓冲液，10％胶原蛋白酶20μL，5％中性蛋白酶10μL，2U/mL的DNA酶I 2μL，10％的透明质酸酶5μL；

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S2、将步骤S1制得的预混液置于37℃下解离35min，然后取10μL解离物置于电子显

微镜下观察，至清楚看到细胞且无团块(结果与图1相近)，停止解离，制得解离细胞液；[0054]S3、将步骤S2制得的解离细胞液转入15mL离心管中，加入3mL、4℃预冷的含0.04％BSA的1×PBS缓冲液，并用孔径为70μm的细胞筛过滤1次，然后于4℃、1650rpm转速下离心5min，去掉上清液，制得细胞沉淀；[0055]S4、向步骤S3制得的细胞沉淀中加入1mL、4℃预冷的含质量百分数为0.04％的BSA的1×PBS缓冲液，重悬细胞，然后加入3mL红细胞裂解液，充分混匀，于室温下静置3min，制得细胞裂解物；所述红细胞裂解液为将8.29g NH4Cl，1g KHCO3，37.2mg EDTA‑2Na混合，加蒸馏水定容至1000mL，调节PH至7.4；[0056]S5、将步骤S4制得的细胞裂解置于5mL、1×PBS下重悬细胞，然后4℃水平离心机，1650rpm离心5min；吸走上清液，向沉淀中再次加入5mL预冷的1×PBS，重悬细胞，4℃水平离心机，1650rpm离心5min，去掉上清液，用孔径为40μm的细胞筛过滤2次，用3mL、4℃预冷的含质量百分数为0.04％的BSA的1×PBS缓冲液冲洗一次，于4℃、1650rpm转速下离心5min，去除上清液，制得细胞沉淀；[0057]S6、将步骤S5制得的细胞沉淀用天然杀菌剂洗涤3次，然后于4℃、1650rpm转速下离心5min，去掉上清液，向沉淀中加入4℃预冷的含质量百分数为0.04％的1×PBS缓冲液，

μL，活性利用显微镜细胞计数板，台盼蓝染色检测细胞浓度、活性，筛选浓度在800‑1500个/

＞80％的细胞，置于冰上，即得；所述的天然杀菌剂由质量百分数为10％的山梨酸溶液与质量百分数为15％的酒石酸溶液按体积比8：3组成。[0058]对比例1一种动物单细胞悬液的制备方法

[0059]所述动物单细胞悬液的制备方法与实施例2类似；[0060]与实施例3的区别在于，对比例1中的混合酶不包含10％的透明质酸酶。[0061]对比例2一种动物单细胞悬液的制备方法

[0062]所述动物单细胞悬液的制备方法与实施例2类似；[0063]与实施例3的区别在于，对比例2中的混合酶不包含10％的胶原蛋白酶。[0064]对比例3一种动物单细胞悬液的制备方法

[0065]所述动物单细胞悬液的制备方法与实施例2类似；[0066]与实施例3的区别在于，对比例3中的天然杀菌剂为质量百分数为10％的山梨酸溶液。

[0067]对比例4动物单细胞悬液的制备方法

[0068]所述动物单细胞悬液的制备方法与实施例2类似；[0069]与实施例3的区别在于，对比例4中的天然杀菌剂由质量百分数为10％的山梨酸溶液与质量百分数为15％的酒石酸溶液按体积比1：1组成。[0070]对比例5动物单细胞悬液的制备方法

[0071]所述动物单细胞悬液的制备方法与实施例2类似；[0072]与实施例3的区别在于，对比例5中的天然杀菌剂为质量百分数为15％的酒石酸溶液。

[0073]试验例细胞活性对比[0074]1.试验样品：实施例1‑3及对比例1‑5所述方法制得的单细胞悬液；

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2.试验方法：取上述细胞悬液各500μL，稀释至1×104，各取300μL加入试管中，然

后向试管中加入300μL，4％的台盼蓝染液，染色2～3min，并吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖玻片，于显微镜下任取几个视野计数死细胞数和活细胞数，计算细胞活力。[0076]细胞活力＝活细胞数/(死细胞数+活细胞数)×100。[0077]3.试验结果：具体试验结果见表1。[0078]表1不同试验样品的活性对比

[0079]

[0080]

由表1可知，采用本发明实施例1‑3的制备方法，制得的细胞活性均在95％以上，而

改变混合酶或者去掉天然杀菌过程，均使细胞纯度降低，尤其是对比例3‑5改变杀菌剂，细胞活性降低至75％以下，进一步证明了本发明各组分、各步骤的相互配合。[0082]最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

[0081]

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图1

图2

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图3

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