发酵工程实验实验指导书

发酵工程实验指导书

（2014版）

宁波大学海洋学院

2014.09

发酵工程实验指导书

目 录

实验一 乳酸菌的分离与初步筛选实验

实验二

实验三

实验四

实验五

实验六

乳酸菌的初步鉴定实验 乳酸菌菌种保藏实验 乳酸菌的培养与发酵实验 乳酸菌发酵产物的分析与测定

发酵罐操作训练

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实验一 乳酸菌的分离与初步筛选实验

一、 实验目的及要求

1、 掌握从环境样品中分离所需微生物的一般操作 2、 掌握平板划线分离菌种的原理和操作方法 3、 掌握利用透明圈法获得单菌落菌株的原理。 二、 实验原理

自然样品中存在混杂的微生物，通过选择性培养基及样品稀释使形成细胞分散液，再通过固体培养基在合适的培养条件下培养形成单菌落，由此得到分离的纯培养菌株。乳酸菌最基本的代谢特性是发酵产酸，待分离样品在合适的培养基和培养条件下，乳酸菌在特定设计的培养基中由于生长产酸产生溶钙形象，从而在培养基中产生透明圈，透明圈直径大小可反映菌落生长产酸量的大小，而不是乳酸菌或不产生酸积累的细菌不能产生透明圈。 三、 实验器材

1、 待用分离样品（腌菜，各种泡菜，酸奶，植物汁液，等）； 2、 培养基：MRS培养基或改良乳酸菌分离培养基；无菌水；

3、 器皿与设备：培养皿、移液管、试管、三角瓶、接种环、涂布棒、超净工作台、天平、采样瓶，

培养箱，等。 四、 方法和步骤 1、 分离样品的采集 采样须知：结合乳酸菌菌种特性（文献资料查阅），获取乳酸菌在自然界或相关产品等的分布规律，设计样品采集范围。

采集样品经适当保存或立即处理。 2、 菌种的分离

称取样品5g或5ml 加到45ml无菌水的三角瓶中（30℃恒温处理20分为佳）充分震荡后（含玻璃珠）使其自然沉淀用1ml移液管吸取上清菌悬液1ml至9ml无菌水试管中依次进行10倍稀释至10-4~10-5用移液管吸取1mL菌悬液至含碳酸钙的MRS培养基平板中，涂布均匀30℃恒温培养2~3天观察菌落，分别挑取生长良好的含透明圈的可疑乳酸菌单菌落，分别移接至普通乳酸菌培养基的斜面试管，菌种编号，30℃恒温培养1~2天，长菌后在4℃冰箱保存待用。 五、 实验结果

1、 在培养平板中观察各菌落生长情况，仔细观察可疑乳酸菌的菌落形态，大小，色泽，透明圈等

特征，运用所学微生物知识初步确定其属于哪个菌属。 2、 记录，选取，并标记，斜面移接和培养，待用。 六、 思考题

1、 阅读文献资料后设计你的采样方案并说明理由？目的是最大可能筛选分离得到乳酸菌。 2、 产酸性微生物分离筛选的一般步骤？

写作实验报告

附培养基配方及制备方法

含碳酸钙的MRS培养基（分离实验），除去碳酸钙即得斜面培养基。

配方如下：蛋白胨 10g，牛肉膏 10g，葡萄糖 20g，酵母膏 5g，柠檬酸氢二铵2g，MgSO4.7H2O 0.58g， MnSO4.4H2O 0.25g，乙酸钠5g，吐温-80 1mL，CaCO3 20~30g，琼脂 15g，蒸馏水 1000mL，pH6.8。（液体培养基则不加琼脂）。（注：目前已有合成的MRS培养基）

配制方法：将各成分按配方比例溶解，冷却至50℃，以盐酸、或醋酸或氢氧化钠调节pH为6.8

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左右，分装三角瓶，按量加入1.5%琼脂，121℃灭菌20min，备用。CaCO3分开灭菌用时加入。

乳酸菌生长培养基或斜面保存培养基，成分同MRS培养基配方（去除CaCO3）。

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实验二 乳酸菌的初步鉴定实验

一、 实验目的

1、 了解菌种初步鉴定基本方法 2、 掌握乳酸菌鉴定的基本方法 二、 实验原理

对实验一得到的经初步判定为乳酸菌的纯培养物，进一步通过其形态或生物学特性进行分析或测定，根据乳酸菌鉴定相关手册加以比较，初步鉴定得出分离菌株的种属类型。

三、 实验器材

显微镜，简单染色液（美蓝、结晶紫、碱性复红，等），95%乙醇，。 其它同实验一

四、方法与步骤 1、菌落形态观察：

在固体培养基中培养后形成的菌落，观察形态（如菌落大小，边缘形状，隆起程度，等）；并作好记录。

2、细胞形态观察：

通过简单染色法或革兰氏染色法观察细胞形态，或G+及G-特点。

方法：简单染色法流程 涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检

革兰氏染色法流程 涂片→干燥→固定→染色（初染→媒染→脱色→复染）→镜检。

其它：生理生化鉴定或PCR分子鉴定（待用） 建议增加碳源利用实验（试纸条）

五、实验结果与分析 1．菌落形态观察结果。 2．细胞形态观察结果。

六、问题（作业）：

乳酸菌的基本生物学特性？

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实验三 乳酸菌菌种保藏实验

一、 实验目的

了解菌种保藏基本原理与掌握菌种保藏方法 二、 实验原理

对实验二得到的经初步判定为乳酸菌的纯培养物进行菌种保藏。

菌种保藏原理：在低温、缺氧环境等条件下，抑制微生物的生命活动但不致死，使微生物长期保存生命活力且不死亡。 保藏法 斜面保藏法 穿刺保藏法（矿物油） 干燥载体保藏法 低温保藏法 液氮保藏法 真空冷冻干燥保藏法 悬液保藏法 原理 低温 缺氧 适宜菌种 各种微生物 好氧微生物 保藏时间 3-6个月 6个月-10年 1-10年 操作要点 4oC 覆盖无菌液体矿物油 沙土等过筛灭菌干燥，4oC -20oC，-80oC，加防冻保护剂 -196oC，加防冻保护剂，逐步冷却与解冻 真空冷冻干燥仪，加冻干保护剂 悬浮于不含养分的灭菌溶液，10oC 优点 操作简便 操作简便 缺点 易污染、易变异 征对特殊微生物 征对特殊微生物 运输较困难，不宜反复冻融 液氮蒸发 干燥、寡营养、低温 低温 产孢子真菌或形成芽孢的细菌 各种微生物 经济实用 1-5年 方便 低温 各种微生物 2-9年 保藏效果好，时间长 效果好，时间长，运输方便 操作简便 低温干燥 各种微生物 5-10年 冻干会有损伤 征对特殊微生物 寡营养 丝状真菌、酵母、肠道细菌 1年以上 三、 实验器材

甘油，冰箱，超低温冰箱；其它同实验一 四、方法与步骤

1. 斜面低温保藏法：将现有的菌种接入空白斜面培养基中，在合适培养条件下培养，得到生长旺盛的菌种时，做好标记，置于4℃冰箱保藏。

2. 冷冻保藏法：从试管斜面取2~3环菌苔于5ml MRS液体培养基中，培养过夜（10~14h）即为对数生长中期至后期细菌，将5ml 菌液8000 rpm离心1 min收获菌体沉淀，弃上清；用600μl新鲜MRS液体培养基重新悬浮所收获的细胞；加入400μl灭菌的50％甘油，混匀，使甘油终浓度为20%；分装入冷冻指管或安瓿中，于-80℃超低温冰箱中保藏。 五、实验结果与分析

菌种保藏结果分析 六、问题（作业）：

菌种保藏基本原理？不同方法的区别点？

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实验四 乳酸菌的培养与发酵实验

一、实验目的

1、 了解菌种培养所需条件 2、 掌握几种常见接种技术

3、 掌握兼性好氧发酵培养操作技术 二、实验原理与内容

静置培养：根据对象微生物的好氧特性采用的培养方式。由微生物的营养要求（决定培养基营养组成）及培养特性（温度pH要求），设计培养条件，在适宜的培养条件下进行微生物的生长与代谢活动，最后达到实验设计所需要的目的。

实验内容：微生物接种培养与发酵；微生物生物量的测定；微生物代谢变化初步分析（酸度测定）。

三、实验器材

1、 乳酸菌发酵培养基：同实验一。

2、 器皿：超净工作台、接种环、记号笔，培养箱，台式离心机，等。 3、 菌种：取自实验一分离培养的乳酸菌。 四、实验步骤与方法

1、 将通过鉴定与保藏的待试验菌种乳酸菌经无菌操作接种到乳酸菌斜面培养基中，然后将其

置于30℃恒温培养箱中恒温培养1~2d，得新鲜斜面种子待用。

2、 配制液体培养基（用于液体培养的MRS培养基）或实验一预先准备好。培养基体积50ml

左右为宜，8层纱布包住瓶口，包扎，以取代一般的棉塞，灭菌同前。 3、 接种（1瓶/人）：用接种环从斜面上蘸取少许菌苔，在锥形瓶内靠近液面的瓶壁处将菌苔

轻轻研磨并轻轻振荡，或将接种环直接在培养基内振摇几次即可，一般接种2~3环。 也可先制备液体种子液，用移液管根据接种百分比接种种子。 4、 将锥形瓶置于培养箱中静置培养，30℃下培养1~2d，放瓶。 5、 发酵产物基本测定：酸度（可用pH计），生物量测定（取一定量发酵液，放入相应大小

离心管，经高速离心后（10000转/分，5分）沉淀，倾去上清液，称重菌体重量，计算湿密度；或将菌体烘干，测定细胞干重，得到细胞干物质量。

五、实验结果及思考题

1. 观察试验菌在液体培养基中的细胞群体形态，描述试验菌的生长规律（特性），并记录与分析。

2. 通过计算pH变化值，分析乳酸菌生长代谢变化特点或规律。

3. 计算细胞生物量值，根据生物量的变化分析细胞生长的特点（如生物周期等）。

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实验五 乳酸菌发酵产物的分析与测定

一、目的和要求

1. 了解并初步掌握一般细菌发酵培养产物的定性定量分析测定方法。 2. 学习薄层层析法对乳酸的定性定量测定一般操作及方法。 二、实验原理与内容 实验原理：

薄层层析是一种广泛应用于氨基酸、多肽、核苷酸、有机酸和生物碱等多种物质的分离和鉴定的层析方法。由于层析是在吸附剂或支持介质均匀涂布的薄层上进行的，所以称之为薄层层析。

薄层层析的主要原理是：根据样品组分与吸附剂的吸附力及其在展层溶剂中的分配系数的不同而使混合物分离。当展层溶剂移动时，会带着混合样品中的各组分一起移动，并不断发生吸附与解吸作用以及反复分配作用。根据各组分在溶剂中溶解度不同和吸附剂对样品各组分的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列的斑点。如果把标准样品在同一层析薄板上一起展开，便可通过在同一薄板上的已知标准样品的Rf值和未知样品各组分的Rf值进行对照，就可初步鉴定未知样品各组分的成分。

薄层层析根据所支持物的性质和分离机制的不同包括吸附层析、离子交换层析和凝胶过滤等。 实验内容：

发酵培养液酸度的测定，以乳酸%计。（同实验三） 乳酸定性定量：薄层层析法，比色法测定等（选学）

三、实验器材

1.实验材料：实验二发酵液、硅胶G层析板（或纸层析：滤纸），0.3%和0.7%%乳酸；等 2.实验试剂：

展层溶剂（1）：正丁醇：甲酸：水=80：15：5（V/V/V）；显色剂：3%的溴甲酚绿酒精溶液。（为本次试验所使用的展层溶剂）

展层溶剂（2）（备用）：乙醇：浓氨水：水=80：5：15（V/V/V）；显色剂：0.04%的溴甲酚紫酒精溶液（称取适量的溴甲酚紫，用50%的乙醇溶液溶解后，再用0.1N NaOH溶液调pH=8）

3、器皿：烧杯、玻璃板（8cm×12cm）、层析缸（ø 15cm×30cm）、毛细管(ø 0.5mm)、玻棒、喷雾器、烘箱、尺、铅笔、干燥器 四、实验方法与过程 1、发酵液的预处理

经高速离心后得到的上清液：发酵液为酸性。 2、硅胶G薄层板的制备

已有产品：层析硅胶G-薄板。 3、点样

取制备好的薄板一块，在距底边1.5cm处划一条直线，在直线上每隔1.5～2㎝作为一记号（用铅笔轻点一下，不可将薄层刺破）。用0.5mm直径的毛细管吸取样品量约5～50μg，点样体积约1－1.5μL，可分次滴加，控制点样斑点直径不超过2mm。在点样过程中可用吹风机冷热风交替吹干样品，也可以让样品自然干燥。 4、展开系统的饱和

预先取适量配制好的展开剂注入层析缸（内部一侧），并将已点样的的薄板也放入层析缸（内部另

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一侧），注意薄板不要接触另一侧展开剂，密闭层析缸15~20min，使展开液蒸汽饱和层析系统。 5、展层

拿出小烧杯，取适量展开液注入层析缸，将已点样的薄板放入盛有展层溶剂的层析缸中，点样一端在下，展层液面距点样线下约0.5cm，密闭层析缸，自下向上展层，当展层溶剂到达距薄析顶端约1cm处时取出薄板，前沿用铅笔或小针作一记号。可用吹风机热风吹干或60℃烘箱内烘干或晾干。 6、显色

以3%的溴甲酚绿酒精溶液喷雾，再将其放入烘箱105℃/10min（或吹风机吹干），取出。将薄层上的对应区点作标记，计算Rf值。轻轻刮下标记可得到相应有机酸（乳酸）。（为本次试验所使用的显色剂）

或（第二种方案）：以0.04%的溴甲酚紫酒精溶液喷雾，再将其放入烘箱105℃/10min，取出。

将薄层上的对应区点作标记（兰紫色薄层上呈现出黄色斑点），计算Rf值。（有机酸分析），轻轻刮下标记可得到相应有机酸（乳酸）。

五、实验结果与讨论

1、 描述分离效果（作图或照片显示）； 2、 计算Rf值；

3、 分析实验结果及误差原因。

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实验六 发酵罐操作训练

一、 实验目的

1、了解发酵罐的结构和原理。 2、学习发酵罐的空消操作步骤。 二、 实验原理

按照生物反应器的类型，发酵罐可分为三大类。（1）敞口式发酵：属于繁殖速度快的好氧发酵，例如酵母工业；（2）半密闭式发酵：如酵母菌等的发酵，大多数情况下属于不是很严格的厌氧发酵；（3）密闭式发酵：主要是好气性的液体深层培养，要求复杂，但无菌程度高。

发酵罐的主要部件包括以下几部分。罐体：主要用来培养发酵各种菌体，密封性要好（防止菌体被污染）；罐体当中有搅拌浆，用于发酵过程中不停的搅拌；空气处理系统，用来供给菌体生长所需要的空气或氧气；蒸汽净化系统以供给发酵罐空消及实效所需蒸汽；罐体上有控制传感器，最常用的有pH电极和溶氧电极，用来监测发酵过程中发酵液pH和DO的变化。此外有些发酵罐还配备有电气控制系统，用来显示和控制发酵条件等。 三、 实验器材 种子发酵罐 四、操作步骤

1．通用型发酵罐系统的构造

发酵系统由三大组块构成：空气压缩机，蒸汽发生器，发酵罐体

1）罐体（主要用来培养发酵各种菌体，密封性要好，防止菌体被污染）

电机、泡沫电极、pH电极、溶氧电极、温度电极、空气过滤器、空气前压力表、流量计、尾气管、尾气冷凝管、视窗、照明灯、夹套、温度电极、取样阀、罐底阀、搅拌浆 2）管路

蒸汽：一路蒸汽进发酵罐夹套；二路蒸汽进发酵罐；三路蒸汽进取样管路 空气：进罐

水：一路进发酵罐夹套；电加热器、循环水泵、电磁阀；二路进排气管夹套 排气管； 排水管 3）主机

电源开关、显示屏、加热指示灯、注水开关、搅拌开关、补料泵、电极线 4）附属设备

蒸汽发生器：（供给发酵罐空消及实效所需蒸汽） 空气压缩机：（用来供给菌体生长所需要的空气或氧气）

2．发酵罐空消的流程和具体操作步骤 （1）pH电极、溶氧电极使用时需标定

1）pH电极和溶氧电极在标定之前要在缓冲液中浸泡并联机通电30min以上。 2）pH电极先标定零点（6.86），再标定斜率（4.00）。 3）在灭菌达到100℃时标定溶氧0%，（也可在饱和的亚硫酸钠溶液中标定0%）发酵参数设置完毕但还未接种时标定100%。

（2）发酵罐的灭菌（空消）流程：

1）准备

开蒸汽发生器、开空气压缩机、开水源开关、标定电极、装罐。 2）预热（0-90℃）

开搅拌器，转速为200-300rpm；温度设为手动微开排气阀、开排夹套水阀，三通阀提到上挡位，其它阀均关，缓慢开一路蒸汽阀，蒸汽进夹套预热。

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3）加热（蒸汽进罐）90-121℃

停止搅拌，开空气过滤器排冷凝水阀，开二路蒸汽阀，至基本无冷凝水排出，关小排冷凝水阀，三通阀放到下挡位，蒸汽进罐（调整过滤器前压力表示数在0.12-0.16MPa之间）；

到100℃约2min后关闭排气阀，此时可标定溶氧为0%。 4） 保温阶段（121℃，20min） 开排气阀，旋松接种口；

开三路蒸汽阀—开取样阀—开罐底阀，6-7min后关闭，关闭顺序相反； 调节进气量和排气量，使温度维持在121℃。 （4） 发酵

1）温度降至发酵温度后，设置各发酵参数，溶氧电极校100%； 2）火焰圈接种（罐压调小后再接种）； 3）发酵初始化；

4）发酵结束，数据存盘； 5）放料，清洗，关仪器。 3．发酵罐使用注意事项

（1） 升温过程中所有的控制按钮必须处于关闭状态或单片机处于关机状态，否则自动冷却水会

自动开启，影响升温，也浪费蒸汽。

（2） 最高工作压力不大于0.2Mpa，进罐空气压力应不大于0.2Mpa，最高消毒温度为126℃。 （3） 培养基装量：5L罐最高不超过4L，10L罐最高不超过8L，最少装量以所有的电极都没于

液面以下为准。

（4） 在过滤器消毒时，流经空气过滤器的蒸汽压力应在0.12～0.14MPa之间，最高不得超过

0.17MPa。压力过低将造成灭菌不彻底，压力过高则空气过滤器滤芯有可能被损坏而失去过滤能力。

（5） 在实消结束后冷却时，发酵罐内的压力会迅速下降，为防止发酵罐内产生负压，必须微开，

并调节使罐压保持在0.03～0.05Mpa之间。开始控温前把注水开关打开，确保夹套中有水。

（6） 接种时要保证无菌环境，需要在进料口放置火圈。

（7） 发酵过程中，罐压应维持在0.03～0.05MPa之间，以免引起污染。

（8） 发酵结束后数据存盘，关闭总电源前，请将控制器退回主菜单，然后按Ctrl+F6关闭控制

程序，然后关闭电源。

（9） 运行结束后，关闭自来水阀，空气源，蒸汽发生器。

（10） 每次移动发酵罐的时候都要先把溶氧电极和pH电极取下来，防止在挪动的过程中碰撞损

坏电极。

（11） 手动清洗罐体前要先取下溶氧和pH电极，再打开发酵罐的盖子，清洗时要用柔软的棉布

轻轻擦洗内部，绝对不可以使用硬物刮发酵罐的内壁。否则以后的发酵罐容易染菌。

（12） 使用发酵罐应登记，使用后由负责人检查签字。

五、实验报告

1.简述发酵罐系统的构造，并画图表示。

2.简述液体深层发酵上罐的操作步骤，了解其注意事项。

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