左旋多巴的合成与提取

氨基酸和生物资源

AminoAcids&BioticResources2000,22(4):33～38

·33·

左旋多巴的合成与提取

李华钟,孙　伟,陈　坚

①

(无锡轻工大学生物工程学院,江苏无锡　214036)

摘要:左旋多巴(L-DOPA)是治疗帕金森病的有效药物。L-DOPA的生产方法有化学合成、从植物中提取和微生酶物转化等,其中利用微生物的酪氨酸酚解酶以邻苯二酚、丙酮酸和氨为底物合成L-DOPA被证明是一种最经济且最有前途的方法。应用基因工程技术构建高效菌株。左旋多巴的提取有多种方法,其中向反应体系中加入晶种使多巴从反应体系中析出,除去菌体和杂质,再进行重结晶可得到纯度较高的多巴是一种很好的方法。

关键词:左旋多巴　帕金森病　酪氨酸酚解酶　提取

中图分类号:R914.5　　　　　　文献标识码:A　　　　　　　文章编号:1006-8376(2000)04-0033-06

　　左旋多巴(3,4-dihydroxylphenylalanine,L-DOPA)是生物体内一种重要的生物活性物质,是从L-酪氨酸到儿茶酚或黑色素的生化代谢途径过程中的重要中间产物[1]。L-DOPA是治疗常见老年病———帕金森病(Parkinson'sdisease)

的主要药物。据统计,普通人群帕金森病的发病率为0.1%,60岁以上老人的发病率为1%,80岁以上的发病率为2%。随着人口老龄化速度的加快,对L-DOPA的需求将迅速增加[4]。据1993年国家对消耗外汇的100种药物的统计,L-DOPA的进口总金额居第17位。60年代末,国外一些学者开始致力于微生物酶法合成L-DOPA的研究。70年代初,日本学者Yama-da[5,6]等对微生物酶法合成L-DOPA进行了深入的研究,通过菌种选育及发酵条件的优化于1993年在味之素公司投入工业化生产。目前国外L-DOPA的产率超过100mg/ml。80年代后期,武汉大学的彭珍荣等[7]在国内首先开展了微生物法合成L-DOPA的研究,但至今国内尚未有工业化的报道。虽然现在国内有多家制药厂生产L-DOPA及其药剂,但大都是从植物中提取的。

[2,3]

1　L-DOPA的用途

多巴的衍生物多巴胺是一种重要的神经递质,但多巴胺不能通过血脑屏障而进入脑组织,而L-DOPA可以通过血脑屏障,在脑组织中可脱羧形成多巴胺,可增加多巴胺含量而达到治疗帕金森氏病的功效[8]。L-DOPA还有其他许多用途,可用来治疗腿多动综合症、肝昏迷、CO中毒、锰中毒和精神病、心力衰竭、溃疡病、脱毛症、调节人的性功能等[9]。此外,人们还发现L-DOPA有抗衰老的神奇功效。在日本有人利用酪氨酸酶将L-酪氨酸转化,经L-DOPA氧化形成黑色素,作为染发的商品出售。L-DOPA是一种在医药卫生、保健美容[10]等诸方面有显著功效的氨基酸衍生物。2　L-DOPA的合成

目前,L-DOPA的生产有化学合成、从天然植物中提取以及用微生物酶转化法三条主要途径,各条生产途径的概述如下:2.1L-DOPA的化学合成

1911年人们首次利用3,4-碳酰二氧苯甲醛为原料化学合成多巴,后来人们还利用胡椒醛、香草醛、儿茶酚、酪氨酸来合成L-DOPA[11]。国

①

收稿日期:2000—03—23

李华钟,(1958-　),男,山东省龙口市人,硕士研究生导师,主要研究方向为工业微生物菌种改良。·34·

李华钟,等.左旋多巴的合成与提取

内还有人用的D-麻黄碱拆分N-乙酰-3-(3,4-二甲氧基苯)-DL-丙氨酸来合成L-DOPA,70年代初,国外化学合成多巴的产量已达150吨。虽用

化学法合成多巴的途径有许多,但遇到一个主要的困难是合成出来的产品是D-型和L-型的混合物,将二者分开较困难。由于L-DOPA会引起毒性反应,因此医学上需控制它的旋光度。1990年,西北大学的孙晓莉[13]用不对称催化法合成L-DOPA,但过程复杂难以工业化。2.2从植物中提取L-DOPA

植物中的天然DOPA都是L-型的。1913年就有人从蚕豆籽苗种豆荚中提取天然L-DOPA,1949年从野生植物藜豆中提取出L-DOPA。国内于1972年从豆科植物藜豆种子中提取L-DOPA获得成功[14],1974年商品L-DOPA投放市场。从猫豆中提取L-DOPA的得率,从1.5%已提高到3.25%。从植物中提取L-DOPA由于受到原料来源的限制,产量小,远不能满足市场需求。

2.3微生物酶转化法生产L-DOPA

人们利用微生物生产L-DOPA,就是利用了代谢途径中的某些酶,如酪氨酸酶、酪氨酸分解酶、转移酶将不同的底物转变成L-DOPA。为了获得大量的L-DOPA,许多国家对其生产进行了大量的研究,采取了许多不同的合成方法。2.3.1利用野生菌株或突变菌株合成L-DOPA

[15]60年代初期,Larway,P和Evans,W.C.首

[12]

件下此菌能够将8.6mg/mlL-酪氨酸转化为8mg/ml的L-DOPA。Pshirkov,S.Y等[18]详细地研究了假单胞菌属中的600多株菌,发现嗜麦

芽假单胞菌属(Pserdomonsmaltophilia)生产L-DOPA的能力较突出。在国内,彭珍荣[19]首次从216株假单胞菌中分离到有较高酪氨酸酶活性的菌株。酪氨酸酶也广泛存在于真菌中,Katsuji,H等[20]发现在酸性条件下,米曲霉(As-pergillusoryzae)和其它一些真菌具有生产L-DOPA的能力。

HitoshiEnei等[21]研究了肠杆菌科(Enterobacteriaceae)中的许多属,发现埃希氏属(Esherichia),变形菌属(Proteus)和欧文杆菌属(Erwinia)中的一些种含有较高活性的酪氨酸酚解酶(TPLase)。Kupletskays,M.B[23]eyVolvodov,K.I等人的研究表明,弗氏柠檬酸菌(Citrobacterfreundii)和中间柠檬酸菌(Cit-robacterintermedius)也能用TPLase来生产L-DOPA。HitoshiEnei等以草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)ATCC21434为菌种来生产L-DOPA,他们将完整的草生欧文氏菌作为TPLase的直接来源,在最适反应条件下L-DOPA的产率为5.1%。此法生产多巴最为常用(见表)。

TomoshisaNagasaki等采用粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)为生产菌株,以完整的细胞作为转氨酶的来源,催化3,4—二羟基苯丙酮酸发生转氨反应生成L-DOPA。利用转氨酶将L-天冬氨酸或L-谷鞍酸的氨基转移到3,4—二羟基苯丙酮酸(DOPP)上而生成L-DOPA,转化率达80%,产率达4mg/ml。Tomoshisa,N在筛选菌种方面做了大量工作,并首次利用Alcaligenesfaecalis中的转氨酶来生产L-DOPA。也有人利用酰基转移酶将N-乙酰-DL-多巴进行不对称水解而生成N-乙酰-D-多巴和L-DOPA。

为了克服游离酶或游离细胞稳定性差,易受环境因素影响等缺点,实现连续化生产,许多人开始研究用固定化方法来生产L-DOPA。有人[26]将L-酪氨酸转移酶和β-酪氨酸酶固定化来[24,25]

次在嗜酪氨酸微螺菌(Micros-piratyrasinatica)中发现了与L-DOPA形成有关的酪氨酸酶。随后,john,N等在蜡状芽孢杆菌(Bucilluscereus)中也发现酪氨酸酶并用来生产L-DOPA。Ha-jime,Y等在弧菌属(Vibrro)和假单胞菌属(Pser-domons)中发现一些种含有酪氨酸酶并能有效的将L-酪氨酸转化成L-DOPA。Hajime,Y等对嗜酪氨酸弧菌(Vibriotyro-sinatirs)进行了诱变,筛选出高酷氨酸酶活性的菌株。在适宜条件下该菌可将4.3mg/mlL-酪氨酸转化为4mg/ml的L-DOPA。另外,他们[17]还对产黑色素假单胞菌(Pseudomomasmelanogenum)进行了诱变,筛选出高酪氨酸酶活性的菌株,在适宜的条[16,17]

氨基酸和生物资源

·35·

生产L-DOPA,但固定化酶遇到酶分离困难及酶被固定后部分活力丧失等问题[27],应用受到限制。有人采用固定化细胞生产L-DOPA,Volvodov,K.I等[28]用聚丙烯酰胺凝胶将Citrobactirfreundii固定化细胞生产L-DOPA。Para,G等[29,30]将草生欧文氏菌固定化来生产L-DOPA,产率为0.46g/L.hr,转化率为18%。他们还用聚丙烯酰胺凝胶和卡拉胶将中间埃希氏菌细胞固定生产L-DOPA,产率为7.8g/L.hr。Lan

Lloyd-George[31]等还作了微胶囊化Erwiniaher-bicolaATC21434细胞的研究。近来,加拿大的Perter,P和Bradley,A.S[32]研究用尼龙6,6固定来自蘑菇的酪氨酸酶生产L-DOPA。Pras等用固

定化产酪氨酸酶植物细胞Mucunaprurie-nsL.合成L-DOPA。由于固定化细胞的研究时间不长,因而存在许多问题,但随着研究的深入开展,相信会成为一种很有希望和很有应用价值的生产方法。

[33]

表　采用不同酶类、底物和生产方法合成左旋多巴的研究水平比较

mg/ml　　

酶TPL＊TPLTPLTPLTPLTyrosinaseTyrosinase

菌种Erwinia.herbicolaE.herbicolaE.herbicolaE.herbicolaE.herbicolaATCC21434P.melanogenumATCC17806突变株假单孢属细菌

L-酪氨酸

7.5

底物

丙酮酸,氨,邻苯二酚丝氨酸,邻苯二酚丝氨酸,邻苯二酚丙酮酸,氨,邻苯二酚丙酮酸,氨,邻苯二酚

L-酪氨酸

产品浓度58.551.00.137.8810021.0

参考文献序号

[21][22][29,30][29,30][31][17][18]

＊TPL:酪氨酸酚解酶(Tyrosinephenollyase)

2.3.2利用基因工程菌合成L-DOPA90年代初

人们开始运用基因工程的手段获取TPL的基因片段,然后连接到不同的载体中让其在宿主细胞中高效表达。90年Kurusu.Y[34]等人构建了pGRY30-TPL1质粒,此质粒含有来自

Escherichiaintermedia的酪氨酸酚解酶(Ⅰ)基因。91年Kurusu,Y[35]等人分析了Escher-ichiaintermedia中TPL结构基因的核酸序列,91年Fukushima.M

[36]

多巴合成体系中,反应30h后,反应液中多巴含量为105mM(20.7mg/ml)。94年,有人

[40]

将

编码TPL的基因克隆到质粒载体pGY1000和pGY4000中并将其转入E.coli中进行表达,用

于L-DOPA的生产。3　L-DOPA的提取

为了获得纯净的符合标准的产品,必须有适宜的L-DOPA的提取方法。利用微生物发酵法生产L-DOPA,其最终发酵产物含有许多不溶和可溶性杂质,必须采用适当的方法除去这些杂质,分离出纯净的L-DOPA。从发酵液中提取L-DOPA的一般步骤为:(1)离心去掉菌体等不溶物,(2)采用适当方法除去一些可溶性杂质,有必要还需脱色,(3)浓缩得到结晶,再采用一定的方法纯化,得到纯净的晶体。以L-酪氨酸为底物等人构建了pHTDⅠ质

粒,此质粒在E.coli中能高效地表达产生酪氨

酸酚解酶。这个质粒产生的酪氨酸酚解酶的量比其亲株Escherichiaintermedia多15倍。91年波兰的Polak.J[37]等人从Cfreundii中提取出TPL基因并构建质粒。92年Hideyuki.S[38]等人对ErwiniaherbicolaAJ2982的TPL基因克隆到E.coli中进行表达,再将培养的细胞转入·36·

李华钟,等.左旋多巴的合成与提取

用微生物发酵法生产L-DOPA,最后的发酵产物为棕黑色液体,要从其中提取出纯净的L-DOPA,首先必须进行脱色,活性炭脱色法是人

们广为使用脱色方法。但采用活性炭进行脱色遇到一些问题,活性炭对各种天然氨基酸具有吸附作用,对芳香族氨基酸表现出最强的吸附力,吸附率达20%左右,因此在L-DOPA提取过程中用活性炭脱色损失较大。近来,有许多研究者研制和寻找新的替代活性炭的脱色剂。提取L-DOPA的方法有许多,针对不同的生产方法得到的待提取液,人们采取了各有特点的方法来提取L-DOPA。

HitoshiEnei等[21]以活性炭层析法来分离纯化L-DOPA,他们将最终发酵产物的pH用浓盐酸调至1.0,然后酸洗,水洗,最后以氨水洗脱,洗脱液经浓缩后调pH至3.5,得到的沉淀以酸碱法重结晶得到纯净L-DOPA,得率为56%。TomohisaNagsaki等将最终发酵产物用10%HC1调pH至2.5;然后离心去掉菌体等不溶物,上清液经真空浓缩后,用乙酸乙酯洗两次,调pH至4.5,放置过夜得粗结晶,粗结晶用等电点沉淀法纯化两、三次,用热水溶化,重新结晶两次,获得较纯晶体,得率为50%。

Katsujihaneda等采用Dowex50-4X(200-400目)H-型树脂来分离L-DOPA,Kaiser,A.等用硼酸复合物法来提取L-DOPA,SealockR.R和Brenner.M.用铅复合物法来提取L-DOPA,但此方法步骤较多,且产品中可能有对人体有害的铅。Blocker.P.等用液态离子交换。

Micker.D.等发现,在低于30℃的情况下,从过饱和溶液中结晶出来的L-DOPA为针形晶体,比高于30℃情况下结晶出来的立方形晶体更纯,针形晶体在加热的情况下可变成立方体形晶体。日本在L-DOPA的提取方面作了大量的研究,他们向反应液中添加L-DOPA的无水结晶,在25℃以下继续反应,无水结晶不断析出。反应在25℃以上可析出一水结晶,但向其中加入无水结晶时,析出无水结晶。

[43]

[42]

+

[41]

4　展望

随着我国人口老龄化速度的加快,对L-DOPA的需求将迅速增加。而目前国内市场上的L-DOPA来源绝大部分依靠进口,如何能使微生物法合成L-DOPA在国内投入工业化生产是一个急待解决的问题。运用现代生物技术对菌种进行改造,期望获得高效表达酪氨酸酚解酶的菌株对于提高L-DOPA的产率是非常重要的。另外,对固定化细胞法的进一步研究,可提高生产的连续性、稳定性、高效性。虽然L-DOPA的提取方法有多种多样,但L-DOPA易于氧化,这样给提取带来许多不便。又由于L-DOPA大都

被用作药来治疗帕金森病,因而对此纯度要求很高,这样对下游提取技术提出更高的要求。参考文献

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TheSynthesisandThePurificationofL-DOPA

LIHua-zhong　SUNWei　CJENJian

(WuxiUniversityofLightIndustry　Wuxi　214036))

Abstract:L-DOPAisakindofeffectivemedicineforParkinson'syndrome.L-DOPAcanbeproduced

bychemicalsynthesis,extractionfromplantandbioconversionwithmicrobialenzyme.IthasbeenprovedthatthebiosynthesisofL-DOPAfromcatechol,pyruvicacidandammoniabytyrosinephenollyaseisthemosteconomicandpotentialmethod.Geneengineeringtechniquehasbeenusedforconstructingthestrainwithhigherenzymeactivity.SeveralmethodsfortheextractiomofL-DOPAhavebeenpracticed,amongthosethebestoneisthattheL-DOPAisseparatedfrominthecellsandimpuritiesbyaddingcrystalseedsofL-DOPAintothereactionsystem,andthenhegherpurenessoftheL-DOPAisgainedbyrecrystallization.

Keywords:L-DOPA,Parkinson'syndrome,tyrosinephenollyase,extraction.

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