体外培养的乳鼠皮层神经元氧糖剥夺后轴突损伤的实验观察

•基础研究论著•

体外培养的乳鼠皮层神经元氧糖剥夺后轴突 损伤的实验观察

田青叶文华陶玉倩

【摘要】

目的建立乳鼠皮层神经元体外培养模型，观察氧糖剥夺处理对神经元轴突损伤的

影响。方法取出生24 h内的SD大鼠大脑皮层神经元，采用逐渐降低培养液中血清浓度和添加阿糖 胞苷的方法培养、纯化神经元，观察其形态并鉴定。建立氧糖剥夺模型，随机分为正常对照组和氧糖 剥夺处理组（2、4、6、8 h各1组）。采用噻唑蓝比色法测定神经元活性，plU-tubulm免疫荧光染色 观察轴突形态学变化。结果神经元培养3 ~5

d后，胞体变得饱满并分出轴突和树突，突起之间逐 渐交织成密集网络，神经元微管相关蛋白-2 (MAP-2)标记阳性率>95%。与正常对照组相比，随着 氧糖剥夺时间的延长，轴突网络逐渐损伤、崩解，同时神经元活性呈梯度下降（P<〇. 01)。结论

突损伤及同时出现的神经元活性下降。

【关键词】

该研究成功建立了神经元体外原代培养及氧糖剥夺模型，并观察到在氧糖剥夺处理过程中神经元的轴

新生乳鼠；大脑皮层神经元；氧糖剥夺；轴突损伤

Experimental observation of OGD-induced axonal injury in neonatal rat models with primary cultured cortical neurons Tian Qing, Ye Wenhua, Tao Yuqian, Department of Neurology, the Third Affiliated Hospital

of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, China

Corresponding author，Tao Yuqian，E-mail: taoyuqiansums@ 163. com

【Abstract】 Objective The neonate rat models with primary cultured cortical neurons were estab­lished. The impact of oxygen and glucose deprivation ( OGD) treatment on neuronal axonal injury was ob­served. Methods Cerebral cortical neurons of neonatal Sprague-Dawley (SD) rats aged < 24 h were ob­tained. The neurons were cultured and purified by gradual reduction of serum concentration and supplement of cytarabine (Ara-c) into the culture medium. The neuronal morphology and identification were carried out.OGD models were established. Cultured cortical neurons were randomly divided into control and OGD treatment groups (2，4，6，8 h group). Neuronal activity was determined by methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium-bro- mide ( MTT) assay. Morphological changes of the axon were observed with p IH -tubulin immunofluorescence staining. Results After 3-5 d culture, the neuron cell body became plump presenting with axons and den­drites ,which gradually constructed a dense network. The positive rate of microtubule associated protein 2 (MAP-2) was >95%. Compared with the control group, the axonal network was gradually damaged and dis­rupted along with the prolonged OGD treatment. Meantime, the neuronal activity was decreased in a gradient manner (P <0. 01). Conclusion In this study, OGD-treated neonate rat models with primary cultured corti­cal neurons were established. Neuronal axonal injury accompanied with decreased neuronal activity was ob­served after OGD treatment.

【Key words】 Neonatal rat; Cerebral cortical neuron； Oxygen and glucose deprivation； Axon injury

缺血性脑卒中发生后，由于胞内钙超载，继发 瀑布样的损伤反应，导致神经细胞坏死和凋亡[1]。 目前，在缺血性脑卒中中，对于神经细胞死亡的病

理生理机制已有大量实验研究证实并阐述，但却很少关注神经元轴突损伤在其中起到的作用。已有研究表明，轴突损伤可能是一个早期诱发神经元死亡

DOI： 10. 3969/j. issn. 0253-9802. 2016. 11. 003

作者单位：510630广州，中山大学附属第三医院神经内科（田青）；528200佛山，佛山市南海区人民医院ICU (叶文华）；510080广州，

中山大学附属第一医院神经科（陶玉倩）

通讯作者，陶玉倩，E-mail: taoyuqiansums@ 163. com

新医学2016年11月第47卷第11期731

的重要因素[2]。然而，在缺血性脑卒中急性病理 生理过程中，有关实验观察少见报道。本次研究拟 建立体外培养的乳鼠皮层神经元模型，观察氧糖剥 夺处理对神经元轴突损伤和细胞活性的影响。

材料与方法

一、 主要试剂、仪器和实验动物牛血清白蛋白（BSA)、H〇chest33258、脱氧 核糖核酸酶I(DNasel)(美国Sigma公司）；Neu- robasal培养基、B27 (美国Invitrogen公司）；小鼠

偶联的羊抗小鼠。荧光显微镜下观察、拍照，随机

选择10个视野，取平均值，计算：MAP-2标记阳 性率（％) = MAP-2染色阳性细胞数/H〇echst33258 标记的细胞数x 100%。六、 氧糖剥夺处理致神经元轴突损伤的观察

神经元接种于培养皿中，培养5 ~6 d后，随机分为5组，其中1组为正常对照组，另外4组分 别进行氧糖剥夺处理2、4、6、8 h。氧糖剥夺处理 相应时间后，进行轴突标记物Pi-tubulin免疫荧

光染色，并用H〇echst33258标记细胞核（方法同 抗大鼠MAP-2抗体（美国OlympusProgramma公司）；倒置

显微镜和荧光显微镜（公司）。实验动物 为新生24 h内的SD大鼠，雌雄不限（中山大学医 学院实验动物中心）。

二、 主要溶液配制B种植培养液：98 ml Neurobasal培养基，2 ml

27, 1 ml BSA。维持培养液：98 ml Neurobasal 培 养基，2 ml gB27。缺氧液：KC1 0.224 g，NaCl 9. 116 ，MgS04 0.492 g，CaCl2 0.221 g，KH2P040pH. 17 g，HEPES 2. 383 g，超纯水定容至1 L，调节 至 7. 35。

三、 神经元取材、培养、纯化

选取2只乳鼠，取大脑皮层，剪碎后收集组织 碎片，消化后反复吹散、离心；用37°C预热的种 植培养液重悬细胞，吹散为单细胞悬液，接种于培 养皿/板中，置于培养箱中培养。24 h后加入阿糖 胞苷（浓度10 pmd/L)抑制胶质细胞生长，3 d

后用维持培养液半量换液，以后每间隔3〜4 d半 量换液1次。

四、 神经元氧糖剥夺模型的建立

选取生长良好、分布均匀的神经元，吸弃原有 培养液，加入缺氧液轻漂洗1〜2次，后换入缺氧 液（100 pl/96孔培养板，1 ml/35 mm培养皿）， 然后将其置入密闭盒中，向盒中持续缓慢通入体积 分数为5% C02和95% N2气体30 min，以置换盒 内氧气；将通气后的密闭盒完全密闭后，置入 37°C培养箱中继续培养，达到所需缺氧时间后进行 相应的实验观察。

五、 神经元形态观察及免疫荧光染色鉴定神经元种植于培养皿后，连续在普通倒置显微镜下对其进行形态学观察。培养至5〜6 d，应用神 经元标记物echstMAP-2进行免疫荧光染色，同时用H〇- 33258标记细胞核。具体方法参考文献[3]，

其中一抗为小鼠抗大鼠MAP-2,荧光二抗为FITC

前），其中一抗为兔抗大鼠PDI-tubulin,荧光二抗 为Cy3偶联的羊抗兔。

七、 细胞活性检测

使用96孔培养板，将神经元随机分为正常对 照组和氧糖剥夺处理组（分别处理2、4、6和8 h)， 每组设1个空白对照孔和6个平行复孔。避光状态 下，每孔加入终浓度为5 mg/ml的噻唑蓝20 ^1， 37°C培养箱内放置4 h后，弃去上清，加入DMSO 1〇〇 pl，振荡溶解紫色结晶物，后用酶标仪检测吸 光度值（D4Wnm)，计算细胞存活率（％)= 〇处理粗/D正雜xl00%。实验结果均经重复实验3 次。

八、 统计学处理

采用SPSS 22. 0统计软件分析数据，计量资料 Wallis以元± ^表示，多组样本均数比较采用Krnskai-

检验（方差不齐），各个实验组与正常对照

组的比较采用Dunnett-T3检验法，P <0. 05为差异

有统计学意义。

结

果

一、神经元形态观察及鉴定

1. 神经元总体形态观察

神经元种植于培养皿，24 h后已完全贴壁， 可见有细小突起开始从胞体爬出，并逐渐向外周延 伸。培养3 d后，胞体变得饱满、立体，折光性 强，多呈圆形、椭圆形或梭形；从胞体分出1 ~2 条相对较粗、长的轴突和若干条细、短树突，突起 之间开始彼此联接。培养5d后，胞体更加饱满， 突起之间逐渐交织成密集网络（图1)。

2. 神经元生长锥形态观察

神经元种植于培养皿，24 h后可观察到神经 元突起开始从胞体爬出，并逐渐向外周延伸，在突 起的末端可见呈扇形膨大的生长锥（图2,箭头 示）。

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饱满的胞体，胞核大，轴突平滑、粗壮（图4D)， 逐渐交织成为紧密而复杂的神经轴突网络（图 4A)。而经氧糖剥夺处理4 h后，神经元胞体皱缩 变形，胞核固缩，轴突变得纤细、粗糙，、是断续串 珠样（图4E)，神经元之间仍有联系，但神经轴 突网络开始崩解（图4B)。氧糖剥夺处理8 h后， 神经元胞体、胞核及轴突（图4F)已消失，只残> 留部分碎片，轴突网络也完全崩解为颗粒样碎片， 图1新生.SD大鼠大脑皮层神经元■ .(6 d，x200)

图2新生SD大鼠大脑皮层神经元生长锥（Mh，x2〇0)

3.神经元经阿糖胞苷纯化后MAP-2免疫荧光鉴定

神经元经阿糖胞苷纯化后，用神经元标记物

MAP-2进行免疫荧光染色，同时H〇eChst33258标 记细胞核。可见神经元胞体、突起MAP-2染色阳 性，胞核则被H〇echst33258标记为蓝色（图3)。 计算得：神经元MAP-2标记阳性率（％ ) > 95 %， 神经元纯度符合要求，可用于后续实验。

图3纯化后神经元MAP-2免疫荧光染色（x200)二、氧糖剥夺处理对神经元轴突及活性的影响 1.氧糖剥夺处理后导致神经元轴突损伤

正常情况下，神经元培养到5 ~6d，可观察到

细胞之间失去网络联系（图4C)d

2.氧糖剥夺处理后导致神经元活性下降

与正常对照组相比，氧糖剥夺处理2h后，细 胞活性即出现明显下降，其细胞存活率降至7〇%; 随时间延长，细胞存活率也逐步下降；氧糖剥夺处 理8h后，细胞活性降至最低值14% (多组间

D概un 比较，；^值为 27. 87，P < 0. 05 ; 存活率比

较，；^值为28. 09,尸<0. 05,见表1。

表1神經元存活率与缺氧时间的关系U=6，元 ± s)组别^490nm存活率（％)正常对照组0. ±0.03100.00 ±0.00氧糖剥夺2h

0.63 ±0.0170. 12±2.20氧糖剥夺4 h0.45 ±0.0150.33±2.01氧糖剥夺6 h0.28 ±0.0231.62±2.88氧糖剥夺8 h

0. 12 ±0.05

14.04 ±5.70

讨 论

目前，国内外皮层神经元原代培养材料来源有 两种：胎鼠和新生鼠。胎鼠来源的神经元处苄 增殖阶段，分化程度低，神经元体外生存能力较 强，易于成功培养。所以，隱外研究中多采用胎鼠

(多取自15〜18 d胎龄）作为神经元的实验材料来 源。但是，胎鼠脑体积小，不便取材，每次原代培 养均需处死孕鼠，此种方法耗资较大，操作繁琐， 且易造成鼠源的浪费。而以出生24 h新生鼠作为 取材来源，其神经细胞虽已近晚期，分化较 高，但仍处于幼年阶段，适应性、可塑性仍较强， 并且此法对孕鼠无伤害》可保证孕鼠和新生鼠的长 期供应，既可满足实验需求，又具有操作性强的特 点W。因此，本实验采用新生24 h内的大鼠作为

取材对象，通过动态观察，可见神经元体外生;长状 态良好，与既往文献报道一致。

神经元发育和再生过程中，其突起末端膨大， 呈扇形，最苹由Cajal描述称为生长锥[#D。本实验

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图4

氧糖剥夺处理致轴突损伤（(3EI-tubuliH/Hoeehst33258染色）（x2〇0)

A/D:正常对照组；B/E:氧糖剥夺4 h; C/F:氧糖剥夺8 h

中，原代皮层神经元种植于培养皿后24 h，在普通 倒置相差显微镜光镜下即可观察到轴突末端的生长 锥，其形态特点与文献报道吻合。生长锥位于所有 突起活跃生长的尖端，轴突的延伸实际上是生长锥 尖端前伸和回缩反应相竞争的结果，轴突的形状记 录了生长锥的历史W。

神经元培养液可采用有和无血清两种[7]。血 ? 青虽可为神经元生长提供丰富营养，但因其同时也 为神经胶质细胞等杂质细胞等提供了生长条件，从 而影响了神经元的纯度；而无血清培养液虽营养相 对缺乏，但可防止杂质细胞过度增殖，从而提高了 神经元纯度。并且，由于血清直接从动物血液内提 取，含有很多不明成分，对实验结果可造成一些不 可预测的影响，而无血清培养基成分清楚，有利于 实验条件的稳定。因此，昌前无血清培养法被多数

研究者采用神经元培养液配方：Neurobasal 培养基和神经生长添加剂B27，已被国内外普遍认 可并使用。而本研究取两者之长，通过逐渐降低培 养液中的血清浓度来进行培养。在神经元种植人培

养皿的第1日，使用含1% FBS的培养液，能够给 神经细胞提供充足营养，保持细胞活性；然后，在 后续的换液过程中，通过半量更换无血清的培养 液，逐渐降低培养液中的血清浓度选择性地促进 神经元生长，抑制神经胶质细胞等的生长，使神经 元得以纯化。另外，在培养1 d后，加人有丝 抑制剂阿糖胞苷进一步纯化；利用MAP-2这一特 异性分布于神经元胞浆和突起中的细胞骨架蛋白作 为标记物，进行免疫荧光染色鉴定，结果显示神经 元纯度达95%以上，能够满足后续实验要求&

缺血缺氧性脑损伤是缺血性脑卒中的基础病理 过程，有关动物模型和细胞模型国内外报道较多， 造模方法也不尽相两1:9403。考虑到本研究的研究目 的和实验条件的可操作性，我们选择了神经元的氧 糖剥夺模型，它是在体外细胞水平下充分模拟缺血 性脑血管病病理过程的经典模型[ul。本研究应用 不含糖的缺氧液，完全替换原细胞培养液，使得神 经元处宁一个酸碱平衡但能量、营养供给完全缺失 的状态；词时将神经元置人已充填95%N2和5%

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C02的密闭容器中，以达到剥夺神经元供氧的目 的。结果显示氧糖剥夺处理2 h，即可观察到神经

元活性的明显下降；并且随着缺氧时间延长，神经 元活性逐渐下降；氧糖剥夺处理8 h及以上时间， 神经元活性降至最低值；神经元存活率与缺氧时间 有良好的负性梯度。此氧糖剥夺模型能够较好地模 拟体内神经元缺血缺氧性损伤，具有易操作、易控 制、重复性好的特点。

脑梗死发生后，神经元死亡的初始引发机制还 有很多未知，而轴突损伤对于整个神经元死亡来说 的轴突损伤及同时出现的神经元活性下降，而有关 轴突及轴突网络损伤的分子生物学机制，则需要进 一步的研究来探讨。

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神经元轴突损伤后，轴突本身会发生一系列变 性反应，其中华勒变性是一种经典类型。损伤后， 华勒变性发生迅速，轴突骨架结构如微管、神经微 丝等去组装并呈现无序性地颗粒聚集，同时髓鞘发 生肿胀、收缩、断裂，最后崩解为脂质颗粒[12]。 上述文献报道与本研究神经元氧糖剥夺处理后观察 到的形态学变化相符，表明体外培养的神经元遭受 缺氧缺糖性损伤后，轴突可发生类似于华勒变性的 崩解变性反应。

除了轴突本身变性反应，轴突受损的神经元胞 体也会因此发生一系列反应，称为“逆向性反应” 或“胞体反应”[13]。本研究观察到，氧糖剥夺处 理神经元可诱发轴突损伤，同时细胞活性下降，结 合文献报道，可以推测在神经元氧糖剥夺的病理机 制中，轴突损伤有可能通过逆向性胞体反应诱发神 经元死亡。然而，对于胞体反应的起始机制尚不清 楚。由于轴突断裂而丧失靶源性营养因子、逆行性 损伤电流反应如高钙内流等被认为是轴突损伤诱发 胞体死亡的部分因素[1314]。在缺血性脑损伤急性 期，在病理性细胞凋亡的过程中，轴突损伤可在早 期发生，继而由于轴浆运输的破坏、细胞间相互营 养支持的减少等诱发细胞死亡。

本研究成功建立了神经元体外原代培养及氧糖 剥夺模型，并观察到在神经元氧糖剥夺处理过程中

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(收稿日期：2016-08-06)

(本文编辑：杨江瑜）