・１０６２・ 临床肿瘤学杂志２０１３年１２月第１８卷第１２期Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｄｅｃ．２０１３，Ｖｏ１．１８，Ｎｏ．１２ ｍｉＲ．２０６对三阴性乳腺癌细胞的增殖 抑制作用及初步机制研究 ２１００００ 南京 南京医科大学第二附属医院肿瘤科 石永国 ，卞卫和 ，何烨 ，丁 洁 ，周 晶 ，王科明 ， 【摘要】 目的探讨ｍｉＲ－２０６对三阴性乳腺癌细胞ＭＤＡ．ＭＢ－２３１增殖的影响及其作用机制。方法 转染ｍｉＲ－２０６ ｍｉｍｉｃ和ｍｉＲ．ＮＣ至乳腺癌细胞株ＭＤＡ．ＭＢ－２３１中，应用实时荧光定量ＰＣＲ（ｑＲＴ．ＰＣＲ）技术检测ｍｉＲ－２０６相对表达水平；应用 ＭＴＩ＇法、克隆形成实验检测ｍｉＲ－２０６对ＭＤＡ．ＭＢ－２３１细胞增殖能力的影响；流式细胞术检测ｍｉＲ－２０６对细胞周期的影响； Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ进一步验证ｍｉＲ－２０６对周期相关蛋白ＣｙｃｌｉｎＤ２的影响。结果ｑＲＴ—ＰＣＲ检测结果显示，ｍｉＲ一２０６ ｍｉｍｉｃ转染 至ＭＤＡ．ＭＢ－２３１乳腺癌细胞４８ｈ后ｍｉＲ－２０６的相对表达水平为１０．２±１．５。ＭＴｒ法检测结果显示，ｍｉＲ－２０６ ｍｉｍｉｃ转染至 ＭＤＡ．ＭＢ－２３１乳腺癌细胞６、２４、４８、７２、９６ｈ后的增殖抑制率分别为（０ ４－０．Ｏ１）％、（０．１２ ４－０．０３）％、（０．２１ ４－０．０８）％、（０．２８ ４－ ０．１１）％和（０．３９ －４０．１６）％；克隆形成实验结果显示，ｍｉＲ－２０６ ｍｉｍｉｃ和ｍｉＲ—ＮＣ转染至ＭＤＡ—ＭＢ－２３１乳腺癌细胞２周后的克 隆数目分别为１０６ －４３５和８４３±１４３，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。流式细胞术检测结果显示，ｍｉＲ－２０６ ｍｉｍｉｃ转染至 ＭＤＡ．ＭＢ－２３１乳腺癌细胞４８ｈ后，明显地阻滞细胞周期于Ｇ１期；Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测显示ｍｉＲ－２０６表达下调了细胞周期蛋白 ＣｙｃｌｉｎＤ２的表达。结论ｍｉＲ－２０６明显抑制了三阴性乳腺癌细胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１的增殖，其机制可能与下调细胞周期蛋白 ＣｙｃｌｉｎＤ２的表达有关，这将成为乳腺癌临床治疗一个新的靶点。 【关键词】ｍｉＲ－２０６；细胞周期蛋白Ｄ２；乳腺癌 中图分类号：Ｒ７３７．９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００９—０４６０（２０１３）１２—１０６２—０４ Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｉＲ－２０６ ｏｎ ｔｒｉｐｉｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ＳＨ／Ｙｏｎｇｇｕｏ，ＢＩＡＮ耽 ｅ，ＨＥ Ｙｅ，ＤＩＮＧＪｉｅ，ＺＨＯＵＪｉｎｇ，ＷＡＮＧＫｅｍｉｎｇ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ａｆｉｆｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆＮａｎｉｆｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００００，Ｃｈｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＷＡＮＧ Ｋｅｍｉｎｇ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｋｍｙｓ＠ｓｏｈｕ．ｃｏｒｎ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｉＲ－２０６ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ＭＤＡ—ＭＢ一 ２３１ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｔｓ ａｃｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＭｉＲ－２０６ ＭｉＲ．２０６ ｍｉｍｉｃ ａｎｄ ｍｉＲ．ＮＣ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ＭＤＡ．ＭＢ－２３１ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌ１．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｍｉＲ－２０６ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）．ＭＴＹ ａｎｄ ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｓ— ｓａｙｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｉＲ－２０６ ｏｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｆｌｏｗ ｃｙｔ０ｍｅｔｒｙ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｉｎＤ２ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｉＲ－２０６．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｑＲＴ－ＰＣＲ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ－２０６ ｗａｓ １０．２ ４－１．５ ｗｈｅｎ ＭｉＲ－２０６ ｍｉｍｉｃ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｅｅｔｅｄ ｉｎｔｏ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ｂｒｅａｓｔ ｃ￣ｑｅｅｒ ｃｅｌｌ ｆｏｒ ４８ｈ．Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ＭＤＡ—ＭＢ－２３１ ｂｒｅａｓｔ ｃｏ／ｌｅｅｒ ｃｅｌｌ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｍｉＲ－２０６ ｍｉｍｉｃ ｆｏｒ ６，２４，４８，７２，９６ｈ ｗａｓ（０ －４０．０１）％，（０．１２ －４０．０３）％，（０．２１ ４－０．０８）％，（０．２８±０．１１）％，（０．３９ －４０．１６）％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ－ ｌｙ．Ｔｈｅ ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｃｏｎｏｌｉｅｓ ｗｅｒｅ １０６±３５．８４３±１４３ ｉｎ ｍｉＲ－２０６ ｍｉｍｉｃ ａｎｄ ｍｉＲ—ＮＣ ｇｒｏｕｐ ｗｈｅｎ ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｆｏｒ ｔｗｏ ｗｅｅｋｓ．ｍｉＲ一２０６ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｔｈｅ Ｇ１／Ｓ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｏｗｎ—ｒｅｇｕ— ｌａｔｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｉｎＤ２．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＭｉＲ－２０６ ｃａｌｌ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ＭＤＡ—ＭＢ－２３１， ｗｈｉｃｈ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ｅｘｅｒｔ ｉｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｙｃｌｉｎＤ２．ｍｉＲ－２０６ ｍａｙ ｂｅ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｏｒ ｆｔｈｅ ｔｒｅａｔ— ｍｅｎｔ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． 【Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ】 ｍｉＲ－２０６； ＣｙｃｌｉｎＤ２； Ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ 十 基金项目：江苏省自然科学基金面上资助项目（ＢＫ２０１０５９１） ２ ２１００２９江苏省中医院乳腺外科 １ ２１００００南京医科大学第二临床医学院 ３ ２２５３００ 泰州市人民医院肿瘤内科 ４通讯作者，Ｅ・ｍａｉｌ：ｗｋｍｙｓ＠ｓｏｈｕ．ｃｏｒｎ ２０１３ １２月第１８卷第１２期Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｅｏｌｏ￣ｖ．Ｄｅｃ．２０１３．Ｖｏ１．１８．Ｎｏ．１２ ・１０６３・ ＭｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）是一种单链、含有ｌ９—３０ 个核苷酸¨ ，通过下调ｍＲＮＡ或抑制其翻译而发挥 将ｍｉＲＮＡ ｍｉｍｉｃ－ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００混合液加入含有 作用的非编码ＲＮＡ ２ 。２００２年Ｃａｌｉｎ等 发现在 淋巴细胞白血病中存在ｍｉＲＮＡ下调，是ｍｉＲＮＡ在 癌症方面的首次报道。近年来研究显示ｍｉＲＮＡ在 多种癌症中异常表达 Ｊ，在恶性肿瘤的发生、发展 细胞的４００１ｘｌ培养基（ｖ２）的培养孑Ｌ中，轻轻混匀； （３）培养４～６ｈ后，将孔中含ｍｉｍｉｃ—ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００混合液的培养基移去，更换成含１０％胎牛血清 的Ｌ一１５培养液；（４）将培养板置于３７℃的ＣＯ，培养 箱中培养４８ｈ用于进一步实验。同时转染ｍｉＲ—ＮＣ， 步骤同上。 １．３．２ ＲＮＡ提取及ｑＲＴ．ＰＣＲ检测Ｔｒｉｚｏｌ法提取 过程中扮演着重要的角色 。本课题组前期研究 证实，ｍｉＲ一２０６在乳腺癌组织中呈低表达 。本研 究探讨了ｍｉＲ－２０６对三阴性乳腺癌细胞株ＭＤＡ— 细胞总ＲＮＡ。按一步法ＲＴ—ＰＣＲ试剂盒说明书进行 ＭＢ－２３１增殖的影响及其分子机制，以期为三阴性乳 腺癌的早期诊断和早期治疗提供新的理论依据和 研究方向。 １材料与方法 １．１ 细胞株和细胞培养 人乳腺癌细胞株ＭＤＡ． ＭＢ－２３１购自中国科学院上海细胞库，于含１０％胎 牛血清Ｌ．１５培养基中，在３７℃、５％ＣＯ 、相对湿度 为９０％的培养箱中培养，细胞贴壁生长。 １．２主要试剂兔抗人单克隆抗体ＣｙｃｌｉｎＤ２和Ｂ— ａｃｔｉｎ购自美国Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＳＴ）公 司；山羊抗兔ＩｇＧ购自上海巧伊生物科技有限公司； 实时荧光定量ＰＣＲ（ｑＲＴ—ＰＣＲ）相关试剂购自上海 ＴＡＫＡＲＡ公司；转染试剂ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００由Ｉｎ— ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司提供。 １．３实验方法 １．３．１ ｍｉＲ．２０６ ｍｉｍｉｃ的转染 ｍｉＲ一２０６ ｍｉｍｉｃ和 ｍｉＲ．ＮＣ均购自广州锐博生物科技有限公司。ｍｉＲ一 ２０６ ｍｉｍｉｃ：正义链：５’一ＵＧＧＡＡｕＧＵＡＡＧＧＡＡＧＵＧ— ＵＧＵＧＵ一３’；反义链：５’一ＡＣＡＣＡＣＣＵＵＣＣＵＵＡＣＡ— ＵＵＣＣＡＵＵ ３’。ｍｉＲ—ＮＣ：正义链：５’一ＵＵＣＵＣＣＧＡ— ＡＣＧＵＧｕＣＡＣＧＵＴＴ．３’；反义链：５’一ＡＣＧＵＧＡＣＡ－ ＣＧＵＵＣＧＧＡＧＡＡＴＴ一３’。实验分为实验组（转染 ｍｉＲ．２０６ ｍｉｍｉｃ）和对照组（转染ｍｉＲ—ＮＣ）。ＭＤＡ— ＭＢ－２３１细胞培养至对数生长期用于细胞转染，转染 前１天以５×１０ ／孔的密度接种于６孔板，待细胞生 长到８０％一９０％融合时转染。具体转染步骤为： （１）稀释ｍｉＲＮＡ ｍｉｍｉｃ：用５０ｉ￣１不含血清培养基 Ｏｐｔｉ．ＭＥＭ￣Ｉ（ｖ１）稀释１．２５Ｉｚｌ ２０Ｉｚｍｏｌ的ｍｉＲＮＡ ｍｉｍｉｃ储存液，轻轻混匀，室温孵育５ｍｉｎ；稀释ｌｉｐｏ－ ｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００：用５０ｔｘｌ不含血清培养基Ｏｐｔｉ—ＭＥＭ ＠Ｉ（ｖ１）稀释１ ｌ ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００，轻轻混匀并 室温孵育５ｒａｉｎ；将稀释的ｍｉＲＮＡ ｍｉｍｉｃ与稀释的１ｉ— ｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００轻轻混匀，室温孵育２０ｒａｉｎ。（２） 操作，以ｕ６为内参，检测ｍｉＲ．２０６的表达。具体步 骤为：将０．５Ｉｘｇ ＲＮＡ加入１０ｔ￣ｌ反转录反应体系（５ ×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ２ 、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ１ ０．５ 、ｍｉＲＮＡ ＲＴ ０．５ 、Ｕ６ ＲＴ ０．５ ｌ、 ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ２Ｏ ｌＯｔｘ１）于ＰＣＲ仪行反转录合成ｃＤ． ＮＡ，反应条件为：３７ｑＣ １５ｒａｉｎ，８５℃５ｓ；采用ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ荧光染料法进行ｑＲＴ．ＰＣＲ，２０ｔｘｌ反应体系中 含有：ＳＹＢＲ￣Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ Ｕ ｌＯｉｘｌ，上下游引物各 ０．４ｐＡ，ｃＤＮＡ １ ｌ，ｄＨ２０ ８．３ ｌ。每个样本设３个复 孔。扩增条件为：９５℃预变性３０ｓ，９５ 变性５ｓ， ６０％退火３４ｓ，４０个循环。逆转录引物为：ｍｉＲ－２０６： ５ ’ ＧＴＣＡＧＡＡＧＧＡＡＴＧＡＴＧＣＡＣＡＧＣＣＡＡＣＡＡＣＡ． ３’：Ｕ６：５’一ＡＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＡＴＴＴＧＣＧＴ一３’。ＲＴ－ ＰＣＲ弓Ｉ物：ｍｉＲ．２０６：上游５’一ＣＧＴＣＡＧＡＡＧＧＡＡＴＧ－ ＡＴＧＣＡＣＡＧ一３’，下游５’．ＡＣＣＴＧＣＧＴＡＧＧＴＡＧＴＴＴ－ ＣＡＴＧＴ一３’：Ｕ６：上游５’一ＣＴＣＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧＣＡＣＡ一 ３’，下游５’．ＡＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＡＴＴＴＧＣＧＴ．３’。采 用２ △ 法计算ｍｉＲ一２０６的相对表达量。 １．３．３四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）法检测于转染后 ６、２４、４８、７２、９６ｈ收集实验组和对照组的细胞，进行 ＭＴＴ法检测。用酶联免疫检测仪测定在４９０ｒｉｍ处 各样本的吸光值（Ａ），绘制细胞生长曲线，计算细胞 生长抑制率。转染ｍｉＲ—ＮＣ作为阴性对照组。细胞 生长抑制率＝（１一实验组Ａ值／对照组Ａ值） ｘ １００％。 １．３．４克隆形成实验检测细胞增殖能力 ＭＤＡ— ＭＢ．２３１细胞于转染４８ｈ后接种于６孔培养板内，每 孔１０００个细胞，完全培养基换液每３～４天一次，约 ２周左右可形成肉眼可见的菌落，ＰＢＳ洗涤３次，甲 醇固定１５ｍｉｎ，结晶紫染色１５ｍｉｎ，ＰＢＳ再洗涤３次， 倒扣６孔板，晾干，拍照。用肉眼直接计数克隆，或 在显微镜（低倍镜）下计数大于ｌ０个细胞的克 隆数。 １．３．５ 流式细胞仪检测细胞周期 细胞转染后 临床肿瘤学杂志２０１３年１２月第１８卷第１２期Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏ￣￣，Ｄｅｃ．２０１３，Ｖｏ１．１８，Ｎｏ．１２ ・１０６５・ 茎环结构前体剪切加工成熟，其编码基因定位于６号 染色体 １２１。２００５年第一次通过ｍＲＮＡ芯片确定 ｍｉＲ－２０６在乳腺癌中表达上调 。近期研究显示 ａｎｄ ｄｏｗｎ—ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏ—ＲＮＡ ｇｅｎｅｓ ｍｉＲ１５ ａｎｄ ｍｉＲ１６ ａｔ １３ｑ１４ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００２，９９（２４）：１５５２４—１５５２９． ［４］Ｃａｌｉｎ ＧＡ，Ｓｅｖｉｇｎａｎｉ Ｃ，Ｄｕｍｉｔｒｕ ＣＤ，ｅｔ ａ１．Ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｇｅｎｅｓ ａｒｅ ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ ｌｏｃａｔｅｄ ａｔ ｆＩａ舀ｌｅ ｓｉｔｅｓ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ｒｅｇｉｏｎｓ ｍｉＲ－２０６能够通过绑定雌激素受体基因１（ＥＳＲ１）３’ 末端超保守区域的两个位点来抑制ＥＳＲ１ ｍＲＮＡ的 表达¨ 。而Ｌｅｉｖｏｎｅｎ等¨ 研究显示在雌激素受体 （ＥＲａ）阳性的乳腺癌标本中ｍｉＲ－２０６表达下调，并能 ｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎ ｃａｎｃｅｒｓｌ Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｄ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００４，１０１ （９）：２９９９—３００４． ［５］ Ｆａｂｉａｎ ＭＲ，Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ Ｎ．Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｃｓ ｏｆ ｍｉＲＮＡ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ：ａ ｌｏｏｋ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｈｏｏｄ ｏｆ ｍｉＲＩＳＣ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０１２，１９（６）：５８６—５９３． 抑制乳腺癌细胞株ＭＣＦ－７的增殖；同时研究发现 ｍｉＲ－２０６是ｍｉＲ一１８ａ、ｍｉＲ一１８ｂ、ｍｉＲ．１９３ｂ及ｍｉＲ－３０２ｃ ［６］Ｌｉ Ｃ，Ｆｅｎｇ Ｙ，Ｃｏｕｋｏｓ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｓｔｒａｔｅ一 的靶点。以上研究结果为乳腺癌的研究提供了新的 分子机制。Ｔａｖａｚｏｉｅ等 研究显示在乳腺癌的转移 过程中ｍｉＲ一２０６同样发挥重要作用，同时证实在转移 性乳腺癌细胞中ｍｉＲ－２０６不影响细胞增殖和凋亡，但 能通过改变细胞形态影响细胞转移。总之，ｍｉＲ．２０６ 有可能成为治疗乳腺癌新的潜在靶点＿１ 。 本课题组前期通过ｑＲＴ—ＰＣＲ检测了３０例乳腺 癌组织及癌旁组织中ｍｉＲ－２０６的表达水平，结果显 示ｍｉＲ．２０６在癌组织中的表达明显低于癌旁组织， 进一步分析发现ｍｉＲ－２０６的表达水平与乳腺癌患者 的临床病理特征有关，并在ＭＣＦ－７细胞中发现ｍｉＲ一 ２０６可通过调节ＣｙｃｌｉｎＤ２抑制细胞增殖 。本研究 结果显示，过表达ｍｉＲ－２０６能显著抑制三阴性乳腺 癌细胞ＭＤＡ—ＭＢ－２３１的增殖，能够阻滞ＭＤＡ－ＭＢ一 ２３１细胞周期于Ｇ 期；Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测结果显 示，过表达ｍｉＲ．２０６后细胞周期蛋白ＣｙｃｌｉｎＤ２的表 达明显下降，与前期研究结果一致，但其确切的分 子机制尚需进一步研究。 综上所述，本研究结果表明ｍｉＲ－２０６能明显抑 制三阴性乳腺癌细胞株ＭＤＡ—ＭＢ－２３ｌ的增殖。以 后将进一步研究ｍｉＲ－２０６和细胞周期蛋白之间的分 子联系，寻找其上游调节因子和下游靶基因，从而 为乳腺癌的临床早期诊断和早期治疗提供新的理 论依据和研究方向。 参考文献 Ｗａｇｎｅｒ ＡＤ，Ｇｍｔｈｅ Ｗ，Ｈａｅｒｔｉｎｇ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ａｄ— ｖａｎｃｅｄ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ，，ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｍｅｔａ—ａｎａｌｙｓｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｇｇｒｅｇａｔｅ ｄａｔａ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２ＯＯ６，２４（１８）：２９０３—２９Ｏ９． ［２］ Ａｍｂｍｓ Ｖ．ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ：ｔｉｎｙ ｅｒｇｕｌａｔｏｍ ｗｉｔｈ ｇｒｅａｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ【Ｊ］． Ｃｅｌｌ，２００１，１０７（７）：８２３—８２６． ［３］ Ｃａｌｉｎ ＧＡ，Ｄｕｍｉｔｒｕ ＣＤ，Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＡＡＰＳ Ｊ，２００９，１１（４）：７４７—７５７． ［７］Ｚｈｏｕ Ｊ，Ｔｉａｎ Ｙ，Ｌｉ Ｊ，ｅｔ ａ１．ｍｉＲ－２０６ ｉｓ ｄｏｗｎ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｉｎＤ２［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２０１３，４３３（２）： ２０７—２１２． ［８］Ｓｔｅｉｍａｎ Ｊ，Ｐｅｒｌａｔａ ＥＡ，Ｌｏｕｉｓ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｓｔｏｒｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＧＰＲ３０，ｉｎ ｔｉｒｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ，２０１３，２０６（５）：６９８—７０３． ［９］Ｄｅｎｔ Ｒ，Ｔｒｎｄｅａｕ Ｍ，Ｐｆｉｔｅｈａｒｄ ＫＩ，ｅｔ ａ１．Ｔｒｉｐｌｅ—ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００７，１３（１５ Ｐｔ １）：４４２９—４４３４． ［１Ｏ］ Ｋａｐｌａｎ ＨＧ，Ｍａｌｍｇｒｅｎ ＪＡ．Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｂｒｅａｓｔ Ｊ，２００８，１４（５）：４５６ —４６３． 【１１］ＬｅｅＲＣ，ＦｅｉｎｂａｎｍＲＬ，ＡｍｂｒｏｓＶ．Ｔｈｅ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｈｅｔｅｒｏｅｈｒｏｎ— ｉｃ ｇｅｎｅ ｌｉｎ－４ ｅｎｃｏｄｅｓ ｓｍａｌｌ ＲＮＡｓ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｔｏ ｌｉｎ一１４［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，１９９３，７５（５）：８４３—８５４． ［１２］Ｔａｖａｚｏｉｅ ＳＦ，Ａｌａｒｅｏｎ Ｃ，Ｏｓｋａｒｓｓｏｎ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｔｈａｔ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ， ２００８，４５１（７１７５）：１４７—１５２． ［１３］Ｉｏｒｉｏ ＭＶ，Ｆｅｒｒａｅｉｎ Ｍ，Ｌｉｕ ＣＧ，ｅｔ ａ１．ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓ— ｓｉｏｎ ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００５， ６５（１６）：７０６５—７０７０． ［１４］ Ａｄａｍｓ ＢＤ，Ｆｕｍｅａｎｘ Ｈ，Ｗｈｉｔｅ ＢＡ．Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏ—ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｅ ａｃｉｄ （ｍｉＲＮＡ）ｍｉＲ－２０６ ｔｒａｇｅｔｓ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ—ａｌｐｈａ （ＥＲａｌｐｈａ）ａｎｄ ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ ＥＲａｌｐｈａ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｂｒｅｓａｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｌｉｎｅｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，２００７， ２１（５）：１１３２—１１４７． ［１５］Ｌｅｉｖｏｎｅｎ ＳＫ，Ｍａｋｅｌａ Ｒ，Ｏｓｌｆｉｎｇ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｙｓａｔｅ ｍｉ— ｃｒｏｎｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐ— ｔｏｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００９，２８ （４４）：３９２６—３９３６． ［１６］ Ｏ’Ｄａｙ Ｅ，Ｌａｌ Ａ．ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｔｒａｇｅｔ ｇｅｎｅ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｉｎ ｂｒｅｓａｔ ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１０，１２（２）：２０１． 收稿日期：２０１３—０９—０８；修回日期：２０１３—１０—１２
