Leica激光扫描共聚焦显微镜
快速操作手册
制作：徕卡显微系统（上海）贸易有限公司2013年3月
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目录：
1 系统的组成
系统组成……………………………………….………..………3 光路示意图………………………………………….…….……4 2 系统的使用
2.1 开机顺序…………………..…………….…….…………5 2.2 软件界面简介…………..…………….………..………7 2.3 在显微镜下观察样品.…………….……….….……8 2.4 采集共聚焦图像………..…………….………….…..9 2.5 XYZ三维扫描（Z-Stack）………………………..…11 2.6 时间序列扫描（Timeseries or xyt Scan）…15 2.7 波长扫描（xyλ Scan）…………………………..16 2.8 HyD检测器……..………………..………………...…….17 2.9 图像的保存及输出………..…………….…….…….18 2.10 关机………..…………….…………………………..……20 3 系统的维护..…………….…………………………….……21
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Leica SP8 系统组成图
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1 可见波长激光或白激光 2 声光调制器（AOTF） 3 红外激光（IR）* 4 电光调制器 5 紫外激光*
6 AOTF或直接调制器（DMOD） 7 STED 激光* 8 Setlight监控二极管 9 AOBS, 及其他选配件 10 用于FRAP的光束增强镜* 11 红外激光耦合
12 与CS2紫外光路耦合的紫外激光 13 STED激光耦合
14 全视野扫描镜及串行高速扫描镜选件
15 UVIS, HIVIS或VISIR的光路镀膜 16 扫描视场旋转镜（Abbe-Konig 旋转）* 17 在NND位置上的反射光检测器（RLD）* 18 物镜（可提供各种选择）*
19 在NND位置上的透射光检测器（TLD）* 20 正方型针孔 21 Fluorifier盘* 22 X1出口接口* 23 外置检测器* 24 色散棱镜 25 分开的荧光光谱
26 最多5个光电倍增管或4个HyD检测器 *选配组件
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2系统的使用
2.1 开机顺序 （硬件标号请参考前面的系统组成图）
（1）因为FSU和CSU硬件的电源控制 ）不同，请分别按照如下步骤开机：
FSU系统 依次打开“PC Microscope”、“Scanner Power”、“Laser Power”三个按钮，将“Laser Emission”上的激光开关钥匙旋至“On-1 CSU系统 先按电脑主机上的电源按钮启动电脑，再打开显微镜控制器 的开关，然后依次打开 “Scanner Power”、“Laser Power”两个按钮，将“Laser Emission”上的激光开关钥匙旋至“On-1 注意：显微镜控制器的开关 一般是常开的，在打开“PC Microscope”按钮后指示灯应该点亮，如果不亮，请打开其开关。 之后两个系统的操作一样 （2）打开荧光激发光源
（按绿色的Power按钮，如右图）
光源亮度调节旋钮
光闸
Power按钮
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（3）电脑进入操作系统界面后，双击电脑桌面“LAS AF”图标启
动共聚焦操作软件。
（4）进入配置选择界面后，在
“Configuration”下拉菜单中选择需要的配置；（其中带有“simulator”字样的为模拟方式，该方式不控制显微镜硬件，不能拍摄图像，适合处理数据）“Microscope”菜单中选择显微镜型号；（图中“Resonant”选项为快扫功能，可按需要打开或关闭，只有配备了快扫功能的系统才会显示该选项），点击“OK”，系统继续启动。
（5）在“Initialize Stage”提示界面选择是
否初始化载物台（如果选择“No”，则Tile scan、Mark&Find和Matrix功能不能使用）。
注意：如果配置的是手动载物台，则不会跳出该提示界面。
（6）系统自检完后，进入LAS AF操作界面，
点击界面最上方“Configuration”按钮进入配置界面→点击左边“Laser Config”按钮→打开所需激光（OFF→ON），Argon激光还需拖动右方滑块以调节激光输出功率
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2.2软件界面简介
功能界面切换：参数设定（Configration）、扫描取图（Acquire）、图像处理（Process）、定量测量（Quantify）
工具和文件管理界面切换：Experiments界面下显示当前拍摄和打开的图片，Acquisition下显示的是当前功能界面的功能按钮和参数
拍摄参数：包括图像像素Format、扫描速度speed、图像放大Zoom factor、视野旋转Rotation等。
三维扫描工具组，用于设定和显示三维扫描的Z轴范围，及其他辅助设定 光路显示及设置区域，从上向下直观显示了从激发到荧光检测的光路细节和关键设置 图像显示窗口 预设光路选择按钮 激光控制栏 分光镜选择按钮 物镜选择按钮 预览按钮，可用于开始和停止预览 拍摄图像按钮
叠加图像显示按钮，在使用两个或以上数量通道拍摄多色图像时，用于显示所有通道叠加后的图像
界面缩放调节滑块，左右拖动可以调节界面项目的显示比例
界面调整栏，左右拖动可调整光路设置区域与图形显示窗口的范围
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2.3在显微镜下观察样品
2.3.1选择物镜： 可通过显微镜主机右侧的物镜转换按钮，或软件中的“Objectives”按钮进行选择（如下图）。（在显微镜设置软件Leica AF Hardware Configurator 中可设定最下方的红圈中的按钮为干/油镜转换，在干/油镜之间切换时需要先按一下此按钮才能完成转换）
2.3.2明场观察：将样品置于载物台上，按显微镜左侧的TL/IL按钮打开明场光路（如右图）（因显微镜所处状态不同，有时候需要按两次才能打开），在明场条件下选择合适的视野。通过调焦按钮或旋钮调节至合适的z轴平面，通过显微镜主机左侧的“INT”功能键调节光强。 如果是电动载物台，需通过遥控手轮调节载物台的运动以选择合适的视野（如下图）。
2.3.3按显微镜前面板的荧光滤块选择按钮切换至荧光观察光路（如右图所示），其上的标注与荧光颜色的对应关系为：I3 -绿色，N2.1--红色，A—蓝色，有些配置的显微镜按钮对应的荧光颜色可能会有所不同，请以实际情况为准。
再按荧光光闸按钮（SHUTTER）打开荧光，进行样品的荧光观察。
2.3.4观察完毕后，按显微镜前面板上的
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“SHUTTER”按钮以保护样品
2.4采集共聚焦图像 2.4.1光路设置：
调用已有的设置：选择“Load/Save single setting”下拉菜单中已有的设置，激光波长及其输出功率、分光镜、检测波长范围、检测器 gain 及offset都会自动设置，包含几种最常用的荧光染料。选择某一设置后，可按样品的实际情况对参数进行优化（如后述），并以新的名称保存。（如右图）
修改已有设置：可改变所选激光、调节激光输出功率、改变分光镜、改变所选PMT、调节PMT 检测范围、调节PMT 的gain 或offset 等。如下图。
建立新的设置：也可从零开始建立新的设置。选择所需激光及其功率、适宜的分光镜、检测器及检测波长范围。
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分光镜选择原则：根据所用激光波长来选择合适的分光镜。
1 405激光选择Substrate；○2其○
他可见波长的激光根据其波长选择分光镜，如488激光可选择DD488/552、
3RT 15/85分TD488/552/638分光镜。○
光镜所有波长激光都可用，但是会损
失85%的激光能量和15%的荧光能量，一般在进行光谱扫描的时候选用。
Sequential Scan:若染料的发
射光谱有重叠，为减少串色，成像时每种染料要单独激发，或者说，每次只用一种激发光激发，并只检测一种染料。可用Sequential Scan来实现。（如右图）激活Sequential Scan功能，可在下面的Seq中分别设置各个染料的激发和检测光路。
2.4.2选择扫描模式
默认模式为xyz 扫描，是最常用的扫描模式，可用于xy 扫描和z 轴层切（xyz 扫描）。还可在下拉菜单中选择由x，y，z，t （时间）以及λ（波长）组合而成的多维扫描模式，如xzy，xyt，xyλ，xyzt，xyzλ，xyzλt 等。
2.4.3设置扫描参数
包括分辨率（format）、扫描速度（speed）、针孔大小（pinhole）、线平均（line average）、面平均（frame average）、累加（accumulation）及放大倍数（Zoom）等。（如右图）
分辨率：默认值为512×512。也可选择更低或更高分辨率。分辨率越高，所获取的图像文件越大，采图所需时间也越长。
扫描速度：默认值为400Hz。活细胞或运动的样品成像可能需要更快的速度。可选择双向扫描（Bidirectional X）来达到更高速度，这时可能需要进行相位校准（Phase correction）。
针孔大小：默认值为1AU。如果增大针孔直径，可增加信号强度，但是所获取图像的共聚焦效果会降低，光切厚度也会随之增加。
平均：用于降低背景噪音。分为线平均（Line average）和面平均（Frame average），可在下拉菜单中选择平均的次数。 累加：仅用于荧光非常弱的样品
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2.4.4预览图像
点击软件Acquire界面左下方的“Live”按钮以预览图像（下图），图像将显示在右侧的显示屏上。
预览开始后，“Live”按钮变为“Stop”，点击“Stop”按钮可停止预览。
注意：一旦预览开始，激光开始照射样品，为减少对样品的伤害，应快速操作，尽量减少预览的时间。
建议：点击Live按钮之前，可调节format至512×512，speed至600Hz以获得较快的刷新频率。
1找到最适合观察的焦平面；○2使图像亮度动预览应达到以下目的：○
态范围达到最佳。
可通过调节控制面板的“Z Position”旋钮找到最适合观察的焦平面（如下图）；或者调节遥控手轮或显微镜镜体上的调焦旋钮（见第8页图）。
图像亮度动态范围可通过调节激光输出功率（见第9页图）、Smart Gain和Smart Offset（见上图）。
参数的调整原则： （1）Smart Gain的调节：增大则信号和噪音都增强，减小则信号和噪音均减小。一般情况下，Gain值的正常范围为500—1000；
（2）Smart Offset的调节：可扣除背景噪音，但标本信号也有一定程度的扣除。原则上，在保证图像质量的前提下，Digital Offset值越接近于0越好；
（3）另外，对于每个通道，需要灵活调节激光的强度：激光强度越高，则信号越强，同时标本更容易被漂白或淬灭。当PMT gain值高于800或HyD gain值大于100%时荧光图片亮度还是不够时，可以考虑适当增加激光强度。在做活细胞或者光切时，应尽量减少激光强度，原则上，在保证图像质量的前提下，激光强度越低越好。
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图像亮度动态范围的判断方法：
理想的荧光图像中应该只有少数像素点达到饱和，可通过位于图像左侧的LUT按钮进行观察。。LUT 按钮（下图红圈）可在LUT （即指定的荧光颜色，也称伪彩）、“Glow Over Under （GlowOU）”和灰度图三档之间切换。在GlowOU 模式中，灰度值达到饱和的像素点显示为蓝色，而灰度值为0的像素点显示为绿色。调节Smart Gain使图像中仅少数像素点呈蓝色，调节Smart Offset来降低图像的背景。荧光图像Smart Offset的默认值为0%，通常应将其调为负值以使图像背景呈绿色。下图中B图亮度及背景值设置均未达最优化值，调节Smart Gain和Smart Offset后，达到C图中的效果，部分信号呈蓝色，而背景呈绿色。
对于HyD检测器，其背景噪声很低，无需通过调节Smart Gain来降低背景。
对透射光图像，同样可以调节透射光PMT 的电压和偏移值来进行优化，有时可将Smart Offset调至高于0%以增加对比度。
如果启用了Sequential Scan，在应该在每个扫描序列（Seq）分别通过预览来调整图像亮度。
2.4.5采集图像
对于单通道染色，或多通道染色同时扫描，单击“Capture Image”按钮采集图像。对于序列扫描，或多维图像扫描，单击”Start”按钮进行图像采集。（见下图）在此之前可改变扫描分辨率、线/面平均次数等扫描参数。
扫描分辨率的设置原则：
通常情况下，采集图像时，为充分利用物镜的分辨能力，可直接点击“Optimize xy Format”按钮（如下图），由系统自动设置最佳分辨率。
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根据Nyquist 采样原则，像素点大小（Pixel Size）应为物镜侧向分辨率（即xy 平面分辨率）的2/5~1/2。物镜分辨率可点击物镜参数表按钮从弹出的界面读取，像素点大小可在采图参数设置界面获得。像素点随扫描分辨率增大和放大倍数（zoom）增加而减小。与高倍物镜相比，低倍物镜需要更高的扫描分辨率。
2.5 XYZ三维扫描（Z-Stack）
xyz 扫描模式为默认采图模式，加上Z轴扫描多个层面，适合观察样品中目标的空间分布。
现有的LAS AF软件3.0和3.1版本Z-Stack的设置界面不同（如下图所示），但是基本采图流程类似。
2.5.1选择Z轴驱动方式
根据不同的系统配置，可以点击Z轴驱动方式按钮选择“z-Galvo”或者“z-Wide”方式：
“z-Wide”：使用显微镜固有的Z轴调节方式，倒置显微镜调节物镜的升降，正置显微镜调节载物台的升降，可通过显微镜镜体的调焦旋钮和遥控手轮的调焦旋钮控制。
“z-Galvo”：使用选配的SuperZ进行精细的Z轴调节，只能通过控制面板的“Z Position”旋钮控制。
2.5.2 设置光路参数，方法同前。 2.5.3 设置Z轴范围
点击“Live”进行图像预览，调节z 轴至层切所需的起点，点击扫描起始设置按钮定义层切起点，调节z 轴至层切所需的终点，点击扫描结束设置按钮定义
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层切终点，点击“Stop”终止图像预览。
2.5.4 Z轴参数调整
此时xyz 层切菜单中显示的“z-step size”（相邻两个光切面的间距）和“Nr. of steps”（层切数目）为系统的优化值（“system optimized”）。也可点击“Nr. of steps”左侧的按钮，然后对相邻光切面间距或层切数目进行自定义。
2.5.4 采图
选择合适的分辨率和扫描线速度，点击”Start”进行xyz 图像的采集。 采图完毕后，3.1版本的点击清除已设位置按钮，3.0版本的分别点击扫描起始和结束位置设置按钮，使其变为灰色，使Z轴位置重新处于未定义状态，以免影响下次采图。
2.5.5 3D展示
拍摄完3D图像之后，在图像显示窗口右侧会多出3个用于3D图像显示的按钮： 最大亮度投影按钮（Maximum projection）: 将所有Z平面的图像信息选取最亮的点集中显示在一层，相当于将多层图像压成一层，多用于集中显示跨越多个层面的结构信息。
正交剖面方式按钮（Orthogonal section）: 分别以XY、YZ、XZ三个方向显示指定位置的剖面信息，如下图，多用于观察结构在3D空间内的定位。
3D立体模式按钮（Open in 3D viewer）: 打开3D可视化模块，以直观方式展
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示3D结构，如下图，该模块功能强大，有多种参数可以调整显示方式，亦可以将所观察到的图像输出成视频。
2.6时间序列扫描（Timeseries or xyt Scan）
时间序列扫描多用于活细胞成像，记录动态过程。
2.6.1 在“Acquire”菜单栏的“Acquisition”中选择xyt 扫描模式后，将出现xyt 扫描菜单，如右图。
2.6.2 设置光路参数，方法同前。 2.6.3 定义“Time Interval”，即采集相邻两帧图像所需的时间间隔，也可选择最小值“Minimize”。
2.6.4 按采图需要选择“Acquire until stopped”、“Duration”或“Frames”。
若选择“Acquire until stopped”，则图像将持续采集，直至手动终止。
若选择“Duration”，可定义采图所需的总时间。 若选择“Frames”，可定义所需的图像帧数。 2.6.5 选择合适的分辨率和扫描线速度，点击“Start”进行时间序列图像的采集。
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2.7波长扫描（xyλ Scan）
波长扫描常用于自发荧光或新染料发射
光谱的检测，如果有串色严重的标本需要进行“Spectrum Dye Seperation”，必须进行波长扫描。
2.7.1 在“Acquire”菜单栏的“Acquisition”中选择xyλ 扫描模式后，将
出现波长扫描菜单，同时检测通道变为如下方式：
2.7.2 选择合适的激发光和分光镜，分光镜一般选择RT 15/85。
2.7.3 定义“Detection Begin”（需检测的发射谱起点）和“Detection End”
（需检测的发射谱终点）。起点所在波长应大于激发波长。
2.7.4 定义“Detection Band Width”（接收的带宽），通常为10nm。如果图
像较暗，可以增加带宽，但是光谱数据的精度会降低。
2.7.5 定义“No. of Detection steps”（采集的帧数）或“λ-Detection Stepsize”
（波长步进）。波长步进不应大于接收带宽。
2.7.6 选择所用PMT检测器（或HyD检测器）。
2.7.7 选择合适的分辨率和扫描速度，点击“Start”进行发射波长图像的
采集。
2.7.8 扫描结束后，可保存发射光谱信息。操作路径为：
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“Quantify→Tools→Stack Profile”，如下图：
在图像窗口的右下角，拖动波长λ滑块，显示的图像会随之变化，选取有典型结构的一张；
在图像窗口上方选项画图工具，圈一个典型区域，中间的Graphs窗口即显示出该区域的发射光亮度随波长变化的曲线（上图中的绿色曲线）；
在上图所示位置点击鼠标右键，弹出的选项中有一个“Export to Dye Data Base”的选项，点击，弹出命名新染料的对话框；
输入染料名称、激发波长（最大发射波长系统会自动计算出，也可以自己修改）、备注信息等，点击“OK”，新染料数据即被存入系统的染料数据库。
可以通过“Configuration/Dye Database”去查看，加入数据库的染料可用于以后采图的参考。
2.8 HyD检测器
HyD检测器是高性能的检测器，比PMT更灵敏响应速度更快，并且有更多的功能。HyD检测器有三种操作模式可供选择：
Standard：标准模式，跟PMT一样，检测到的信号直接显示为图像，可通过调节SmartGain来调节图像亮度。
Counting：光子计数模式，以每个像素点所检测到的光子数显示为该像素点的亮度，此时检测器的Gain为一个定值，通过长时间的检测使图像显现出来。常用于非常弱的荧光样本的成像。使用此模式采图时，需使用累加（accumulation）功能来使采集到的图像达到合适的亮度。
BrightR：如果视野中有非常亮的结构，但是又需要将较暗的结构显示出来时，
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适合用此模式，此模式会在较为暗的部分使用稍多一些的动态范围，如右图。
注意：HyD检测器非常灵敏，如果收集到过强的光信号会影响其寿命，系统有一个安全机制对此进行保护，如果信号过强，会先有声音报警，如果操作者未采取措施，会自动关闭检测器，同时弹出如下的提示窗口：
此时应点击“Stop”停止预览，降低激光功率，调低SmartGain值，重新预览。
特别注意：
1使用HyD成像时，一开始激光功率不要设置太高，应从低开始慢慢增加；○ 2不要用HyD检测反射光，因为一般情况下，反射光亮度要大大强于荧光。○
2.9图像文件的保存及输出
2.9.1图像文件的操作：
“Acquire”的”Experiment”下显示采集的所有图像文件名称，默认本次开机后采集的所有图像都放在一个文件夹下，右键点击文件名，可进行多种操作。如下图：
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选择“Save Experiment”即可将当前文件夹下的所有图片保存为一个文件，文件保存格式为*.lif 原始文件，只能通过Leica LAS AF、LAS AF Lite 或其他专业图像数据处理软件打开。
2.9.2图像文件的输出：
右键点击图像文件名，选择”Export”进行图像输出，可输出成图片（.tiff 或.jpeg），三维或多维图像还可输出成电影（QuickTime、.avi、MPEG-4、WMV等）。如右图。所得文件可用普通图像浏览软件打开。
选择”As Tiff”或”As JPEG”，出现如下图的对话框，可选择输出路径、所需标尺及位置等。确定后，点击”OK”，即可将图像输出至指定路径。
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2.9.3图像采集参数的观察及恢复：
右键点击图像文件名，选择”Properties of…”，即显示该图像采集时的所有参数设置信息，如图8-5。
点击”Apply Settings”，即可恢复该图像采集时的参数设置。点击”Save as...”，可将所有参数信息输出成.xml文件并存至指定路径。
2.10 关机
（1） 保存已采集的图像。
（2） 在LAS AF软件Configuration”→“Laser Config”界面关闭所有激光。 （3） 关闭显微镜荧光电源。
（4） 若使用过油镜，需用无水乙醚与无水乙醇混合液（体积比7：3）或无水乙醇清洁镜头。
（5）关闭LAS AF 软件。 （6） 将电脑桌右侧“Laser Power”按钮右侧的激光开关钥匙（Laser Emission）逆时针旋转90度至“On-0”位置。
（7） 关闭“Scanner Power”按钮。 （8） 在电脑上进行图像数据的输出。
（9） 关闭电脑后，关闭“PC Microscope”按钮（CSU系统需关闭显微镜控制器开关）。
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（10） 风扇停止后（关闭激光开关钥匙约5分钟后），关闭“Laser Power”按钮。（CSU系统可直接关闭“Laser Power”按钮，无需等待风扇停止）。记录关机时间、仪器状况等信息。
3系统的维护
（1）保持室温为18-25℃，相对湿度40-60%，尽量保证室内环境的清洁。 （2）严格遵守激光器的开、关流程。
（3）如荧光光源为汞灯，则打开电源后需等10-15min方可使用；如荧光光源为金属卤素灯，则打开电源后可直接使用。无论哪种灯作为光源，打开后20min以上才能关闭。
（4）如需用到“Mark and Find”、“Tile Scan”、“Matrix”等要求载物台精确定位的功能时，在启动软件后选择进行载物台初始化，否则也可不做初始化。在初始化过程中，载物台会向四周运动，因此需保证周围没有物品阻碍其运动。
（5）若使用过油镜，需用蘸有无水乙醇的擦镜纸清洁此物镜；若使用过水镜，也需用干擦镜纸轻轻吸干上面的水渍。
（6）关机前，尽量将当前物镜转换为低倍物镜并调至最低位，可最大程度保护物镜。
（7）输出数据时，使用光盘刻录数据而非移动存储设备可更好的防止电脑中毒。
（8）避免空调直接对着显微镜吹风。
（9）拍摄图像时，应避免震动、环境光线、手机信号等的干扰。
如欲了解LEICA SP8的更多详细应用，可按在软件界面按“F1”键，点击界面上出现的“？”圆形按钮打开帮助系统。
也可浏览以下网站：
http://www.leica-microsystems.com/science-lab/
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