猪瘟病毒E0和E2基因变异及猪瘟净化方法的研究

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猪瘟病毒E0和E2基因变异及猪瘟净化

方法的研究

韦冠东1，马 萍2，汤德元1*，张元鑫2，刘 霞2，曾智勇1，李 达1，李 谦1

(1.贵州大学动物科学学院， 贵州 贵阳 550025；2.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550008)

（上接2016年第6期106页）

 近年来，猪病毒性疾病已严重危害世界规模化养猪业，我国许多规模化猪场均不同程度受威胁，疾病的发生和流行日益严重，发病率越来越高，猪群发生疾病时多种病原混合感染和继发感染的情况越来越普遍，特别在诊断过程中难以鉴别野毒与疫苗毒，无法准确的判断是否存在野毒感染，给猪场临床病原学的准确诊断造成较大困难。Li Y[4] 等虽然建立了能区分猪瘟强、弱毒的复合套式RT-PCR检测方法，该方法特异性较好，且可以检测出0.04 pg的CSFV RNA，但方法较为复杂，不能良好的应用于基层临床检测中，本实验室刘智杰[5]已成功建立了常见猪繁殖障碍性疫病的6重PCR方法，王洪光分别建立的DNA病毒(PRV、PCV2和PPV)三重PCR方法

[6]

疫荧光抗体试验、病毒分离与鉴定试验和反转录聚合酶链式反应等五种方法。

应作指标，以判定第1次接种的病料中是否含有猪瘟病毒。试验组的试验结果判定见表1。

4.1.1 兔体交互免疫试验

将病猪的淋巴结、脾脏和肾脏磨碎后用无热原性的生理盐水作1:10稀释。将上述处理的样品肌肉注射3只健康家兔，每只5 mL，另设3只不注射病料而仅注射生理盐水的对照兔，24 h后，每隔6 h测体温1次，连续测温5 d。

接种样品5 d后对所有家兔静脉注射用无热原性的生理盐水稀释成1 mL含有100个兔体最小感染量的猪瘟兔化弱毒(淋巴、脾脏毒)，每只1 mL，同时增设两只仅注射猪瘟兔化弱毒的对照兔。24 h后，每隔6 h测体温一次，连续测温96 h，注射生理盐水和仅注射猪瘟兔化弱毒的两组对照兔分别2/3和2/2出现定型热或轻型热，试验成立。

判定标准：猪瘟强毒不引起家兔体温反应，但能使其产生免疫力，从而能抵抗猪瘟兔化弱毒的攻击。因此可以利用猪瘟兔化弱毒攻击后是否出现体温反

表1　兔体交互免疫验结果判定实

接种病料后

体温反应

－－＋＋对照兔

接种猪瘟兔化弱毒体温反应

－＋－＋＋

结果判定含猪瘟强毒、野毒不含任何猪瘟病毒含猪瘟兔化弱毒含非猪瘟病毒热原性

物质含猪瘟兔化弱毒

4.1.2  免疫酶染色试验

解剖检查时采病猪扁桃体、脾、肾、淋巴结作压印片或冰冻切片，同时设正常组织对照标本。标本自然干燥后，在2%戊二醛和甲醇等量混合液中固定10 min，干燥后，置冰箱内待检。

将标本侵入0.01%过氧化氢或0.01%叠氮钠的Tris-Hcl缓冲液中，室温下作用30 min。用pH7.4的0.02 mol/L磷酸缓冲盐水漂洗5次，每次3 min，风干。将标本置于湿盒内，滴加1:10酶标记抗体，覆盖标本面上，置37 ℃作用45 min。用pH7.4的0.02 mol/L磷酸缓冲盐水-1%吐温缓冲液漂洗5次，每次2～3 min。将标本放入DAB Tris-Hcl液内，置37 ℃作用3 min。用pH7.4的0.02 mol/L磷酸缓冲盐水漂洗5次，每次2～3 min，再用无水酒精，二甲苯脱水，封片检查。

判定标准：用普通生物显微镜检查判定结果，如细胞浆染成深褐色为阳性；黄色或无色为阴性，正常对照标本应为阴性。猪瘟兔化弱毒接种的猪组织细胞浆呈微褐色，与强毒株感染有明显区别。

与RNA病毒

(PRRSV和SIV)的二重RT-PCR方法[7]，并建立猪呼吸道病毒性疫病六重PCR方法[8]，该多重RT-PCR方法的成功应用，为规模化猪场疫病流行病学调查提供技术支撑，也为猪常见疫病的快速诊断及猪场成功实现疫病净化提供了技术保障。

4.1  现阶段猪瘟常用诊断技术    

猪瘟诊断技术的发展及相关商品化诊断试剂盒的普遍应用，为实现猪瘟的净化提供了必要的技术支持。主要用于猪瘟病毒和抗原的诊断技术有：兔体交互免疫试验、免疫酶染色试验、直接免

4.1.3 病毒分离与鉴定试验

将2 g扁桃体或脾脏或肾脏剪成小块，加上灭菌砂在乳钵中研成匀浆，用Hank’s液或MEM配成20%悬液，加青霉素(使最终浓度为500 U/mL)和链霉素(使最终浓度为500 U/mL)，室温下放置1 h，以3 000 r/min离心15 min取用上清液。

注：“＋”表示多于或等于2/3的动物有体温反

应，“—”表示无体温反应。

资助项目：贵州省2014年农业攻关项目资助[黔科合NY字(2014)3055号]

作者简介：韦冠东(1990-)，男，硕士研究生，主要从事动物传染病病原分子病毒学的科研学习。

*通讯作者：汤德元(1964-)，男，教授，博士，硕士生导师，主要从事动物传染病病原分子生物学和中西兽医结合的教学科研工作。E-mail：tdyuan@163.com

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 SWINE INDUSTRY SCIENCE  2016年33卷第7期猪业科学 

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将PK15单层细胞用胰酶消化分散浆液，4 ℃，1 000 g离心15 min，取保障，也为早期淘汰野毒阳性感染猪群后，以800 r/min离心10 min，用不含上清液转入无RNA酶污染的离心管而建立阴性净化猪群提供技术支撑。

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的5%胎牛中，备用；全血采用脱纤抗凝备用；细目前猪瘟预防广泛采用猪瘟兔化弱血清的MEM配成每毫升含2×106个胞培养物冻融3次备用；其他样品酌毒疫苗免疫，不同国家地区使用不同的细胞的悬液。九份细胞悬液加一份病料情处理。同时设阴阳对照。提取RNA猪瘟兔化弱毒株有LPC株(Lapinized 悬液接种于带有细胞飞片的转瓶或微量后，进行反转录聚合酶链式反应。取Philippines Coronel)、Riems C株细胞培养板。另设不加病料的对照若干6～10μLPCR产物在0.8%琼脂糖凝(Chinese)、HCLV株(Hog Cholera 瓶(孔)，于接种后1 d、2 d、3 d，分胶中进行电泳，缓冲液为0.5×TBE，Lapinized Virus)、C株(Chinese C 别从2个接种瓶(孔)和一个对照瓶100 v，40 min。

strain)。通过对HCLV株、C株、LPC(孔)中，取出细胞片用用Hank’s液判定标准：出现预测条带为阳性，株疫苗病毒全长cDNA序列比对分析发或MEM洗涤2次，每次5 min，用冷无条带出现为阴性。

现：在猪瘟疫苗毒基因组的3'NTR中无水丙酮固定10 min。进行免疫酶染色兔体交互免疫试验、免疫酶染色试均存在有12-13 nt的富含T的插入序或荧光抗体染色、镜检并判定结果。

验、直接免疫荧光抗体试验、病毒分离列，该插入序列在猪瘟病毒野毒株中缺判定标准：根据染色方法，镜检结与鉴定试验和反转录聚合酶链式反应等失，可作为猪瘟兔化弱毒疫苗株的一个果参照免疫酶染色或荧光抗体染色。

5种方法主要用于猪瘟病毒和抗原的诊遗传标记。因此，依据猪瘟兔化弱毒疫4.1.4 直接免疫荧光抗体

断，以发现带毒猪和自然感染猪；猪瘟苗株3'NTR序列差异，能够建立一种群体检疫中，待检可疑猪不少于3单抗酶联免疫吸附试验和荧光抗体病毒可快速鉴别猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒例，其中至少2例为早期患猪，活体取中和试验主要用于猪瘟抗体的检测和免疫苗株的RT-PCR诊断技术。

扁桃体或剖杀后摘取扁桃体。后期病猪疫效果的评估，其中，单抗酶联免疫吸参

照NCBI中

上

传

的：

剖杀后采扁桃体、淋巴结、脾脏和肾脏。附试验组要用于猪瘟抗体的鉴别诊断，Alfort/187(X8739)、ALD(D49532)、个体检疫时，可活体取扁桃体或剖杀可可区别诊断猪瘟自然感染猪，免疫猪，Shimen(AF092448)、HCLV疫苗株以猪采扁桃体、淋巴结、脾脏和肾脏。强、弱毒抗体阳性猪及猪瘟抗体阴性猪。(AF531433)和C株疫苗株(Z46258)等所采组织样品应为新鲜且为猪瘟疫苗免这些技术的应用为实施猪瘟与猪伪狂犬22个猪瘟病毒的基因序列，分析结果疫21 d之后。采样后应尽快冷藏送检，病的净化提供了技术保障，将猪瘟作为发现猪瘟疫苗株3' NTR富含T的插入如当日不能送出，应冻结保存，避免组优先防治的疫病，通过兽医系统工作者序列。应用DNAStar等软件设计单一织腐败、自溶，影响结果。

和广大猪场经营管理者的共同努力，对与多重RT-PCR引物，单一RT-PCR将样品组织块修切出1 cm× 1 cm猪瘟的净化是可以实现的。

是分别在插入序列的上下两端设计2对的小块，不经任何固定处理，直接冻贴4.2  区分猪瘟野毒和疫苗毒的单一

特异性引物，分别用该对引物对猪瘟野于冰冻切片机的冰冻切片托上，进行切RT-PCR检测技术的建立

毒与疫苗毒进行RT-PCR扩增，因疫片，切片厚度要求5～7 μm。将切片本实验室李达在上述研究的基础苗毒基因序列多一组该T的插入序列而展贴与0.8～1.0 mm厚的洁净载玻片上建立了区分猪瘟野毒和疫苗毒的单一出现在进行PCR扩增时疫苗毒比野毒偏上，也可将样片组织直接作压印片或涂RT-PCR检测技术和二重RT-PCR(专大的条带，可鉴别猪瘟强弱毒株(表2)。

片，同时设正常对照片。将切片置于无利号：CN104673939A )检测技术，该方单一RNA病毒RT-PCR反应，常水丙酮中固定15 min。取出立即放入法为猪瘟净化的成功检测、筛选、淘汰规反应体系为25 μL，2×1 step Buffer 0.01 mol/L，pH7.2的磷酸缓冲盐水中，和制定科学合理的净化方案提供了技术

12.5 μL、上下游引物各1 μL，模板各

轻轻漂洗3次。取出，自然干燥后，尽表2　扩增目的片段的引物

快进行荧光抗体染色。

    方法

病毒

目的基因

      引物序列(5′- 3′)

片段大小/bp

判定标准：于荧光显微镜视野中，F1：5'-ACCCTATTGTAGATAACACTA -3'

 140见扁桃体隐窝上皮细胞或肾曲小管上皮单一RT-PCR5'-AAAGTGCTGTTAAAAATGAGTG -3'检测方法CSFV保守基因R1：F2：5'-GTAGCAAGACTGGAAATAGGTA -3'细胞浆内呈现明亮的黄绿色荧光，或脾、R2：5'-AAAGTGCTGTTAAAAATGAGTG-3'  372淋巴结胞浆内有黄绿色荧光剂判为猪瘟表3　扩增目的片段的引物

病毒感染阳性。正常对照片细胞内应无方法

病毒

目的基因       引物序列(5′- 3′)

片段大小/bp

黄绿色荧光。

疫苗毒F1：5'-AGTAAGTAGCAAGACCGGGAAT-3' 2784.1.5 反转录聚合酶链式反应

二重RT-PCRR1:5'-GGCGATAAATAAAAAAGAAAAAAAAG-3'按1∶5(质量浓度比)，取待检组检测方法CSFV野毒F2：5'- AGATTCCAGTGGTGAGAGGGGTA -3'R2：5'- GCCGGCGCTAAATAAATAAAAAAT -3'  641织和 MEM液于研钵中充分研磨制成匀

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加康—有效控制呼吸道疾病猪群保健

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1 μL，PrimeScript One Step Enzyme 免疫应尽可能安排在配种前1个月和产《种畜种禽合格证》和《检疫合格证明》，Mix 1 μL，RNase free H2O 8.5 μL。后1个月内进行；新生仔猪有条件应采引进后隔离饲养45 d以上经检测合格反应程序：50 ℃ 40 min；95 ℃ 5 min；用超前免疫，即出生后哺乳前接种猪瘟后才可混群饲养。 

95 ℃ 30 s；57℃ 30 s；72 ℃ 45 s，共活疫苗1头份，间隔2 h后再进行哺乳，6) 建立种猪场、生猪供精站和周边进行35个循环；72℃ 10 min。取28日龄后进行强化免疫，接种猪瘟活环境的消毒制度，减少环境中的猪瘟病5 μL RT-PCR产物于1％琼脂糖凝胶疫苗2头份，60日龄时进行三免，接种毒数量。种猪场、生猪人工授精站的粪上进行电泳测定。

猪瘟活疫苗4头份。对于一般污染场建尿要及时清理和处理，猪场的死胎、流判定标准：用建立的单一RT-议针对种公猪、种母猪及后备猪与上述产物、弱仔猪要高温处理，及时清除猪PCR方法中1号引物与2号引物分别免疫程序相同；而对新生仔猪28日龄场存在的传染源。通过从种猪场、生猪对采集的猪扁桃体进行单一RT-PCR首免，接种猪瘟活疫苗2头份，60日龄人工授精站源头抓起，利用实验室检测扩增，并取5 μL RT-PCR产物于1%时进行二免，接种猪瘟活疫苗4头份。技术，淘汰带毒种猪，切断猪瘟流行的琼脂糖凝胶电泳测定，若140 bp处出免疫接种需参照疫苗产品说明书规范操恶性循环锁链，同时利用安全、高效、现条带，判定为野毒感染；372 bp处出作，且做到一猪一个针头。

优质的猪瘟兔脾淋疫苗或高效细胞苗，现条带为疫苗毒。

2）猪瘟血清学调查：种猪群采取提高群体免疫水平和确保免疫效果，逐4.3  区分猪瘟野毒和疫苗毒的二重逐头100%定期检测其抗原(一次/半步培育出健康的种猪群和后备种猪群。RT-PCR检测技术的建立

年)，哺乳仔猪、保育猪、育肥猪抽样同时，加大改善生态环境力度，最终实二重RT-PCR是根据上述插入序5%(一次/半年)，抗原阳性猪进行隔现种猪瘟净化目标。

列特点，分别在各保守区设计一组二离淘汰。同时全场按10%比例每个季度参考文献

重猪瘟鉴别引物(表3)，该方法可对临抽血作抗体检测，对抗体阴性猪群加强[1] 王晓燕．福建省两个规模化猪场猪瘟和

床病料进行快速、准确的诊断，对规免疫一次，3周后进行抗体检测，仍不伪狂犬病净化技术应用[D]．福州：福建模化猪场猪瘟的净化具有十分重要的合格猪进行隔离淘汰。

农林大学，2012．

[2] 王琴，涂长春，黄保续，等. 猪瘟流行

参考价值。

3）猪瘟ELISA法检测抗原，以种病学信息系统(CSF info)的建立及应用最佳二重RT-PCR反应体系为猪场为单位，各种猪场要在2～3 d内[A]. 中国畜牧兽医学会. 中国畜牧兽医50 μL，2×1 step Buffer 25 μL、模板完成猪的采血并分离血清，所有的血清学会2006学术年会论文集(下册)[C].各4 μL，上下游引物量(各1 μL )，量于-20 ℃冰冻保存(3 d内能检测完中国畜牧兽医学会:2006:4.

[3] 涂长春. 中国猪瘟流行病学现状与防制

PrimeScript One Step Enzyme Mix 的可放于2～8℃冷藏保存)，采血过研究[D].北京：中国农业大学,2004.2 μL，RNase free H2O 15 

μL。RT-程及样品要防止污染并正规标记，可疑[4] LI Y，ZHAO J J，LI N，et al. A 

PCR 反应条件：50 ℃ 40 min；95 ℃ 样品还可进行病原学检测，对检测阳性multiplex nested RT-PCR for the 5 min；94 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 45 s，猪进行扑杀或淘汰处理。

detection and differentiation of wild-type viruses from C-strain vaccine 共进行 35 个循环；72 ℃延伸10 min。

4）RT-PCR法检测猪瘟抗原，种of classical swine fever virus [J]. 判定标准：用建立的二重RT-猪群通过扁桃体采样器械采集扁桃体进Journal of Virological Methods，PCR方法中引物对采集的猪扁桃体进行检测，对检测阳性猪扑杀或淘汰处2007，143 (1)：16-22.

行RT-PCR扩增，并取5 μLRT-理；母猪所生产的弱仔猪、死胎、流产[5] 刘志杰，曾智勇，汤德元，等. 猪繁殖

障碍病毒性疫病六重PCR检测方法的PCR产物于1%琼脂糖凝胶上进行电泳胎儿应及时收集，取其扁桃体、脾脏、建立及应用[J].畜牧兽医学报，2012，测定，若278 bp处出现条带，判定为肾脏和淋巴结等猪瘟病毒侵害器官组43(9):1429-1436.

疫苗毒；641 bp处出现条带为野毒感染。

织，采用本实验建立的RT-PCR(专利[6] 王洪光，李绍洪，汤德元，等.  PRV、

5  猪瘟净化方案步骤

号：CN104673939A)法做猪瘟病原诊PCV2与PPV三重PCR检测方法的建在本实验室建立的区分猪瘟野毒和断，根据阳性结果淘汰种猪。对于生产立与初步应用[J]. 畜牧与兽医，2015，47(1):5-8.

疫苗毒的单一和双重RT-PCR检测技记录不佳的种猪，收集所产仔猪的脐带[7] 王洪光，汤德元，曾智勇，等. 猪繁

术的基础上，我们制定出的猪瘟净化具血，收集后做猪瘟抗体检测，根据抗体殖与呼吸综合征病毒与猪流感病毒二重体步骤如下：

阳性结果，淘汰种猪。

RT-PCR检测方法的建立[J]. 猪业科1）建立合理的免疫程序：对于严5) 后备猪群混群前应严格检测，猪学，2014，31(8):98-100.

[8] 王洪光. 猪呼吸道病毒性疫病多重PCR

重污染场建议针对种公猪、种母猪及后瘟抗原检测阴性，后备猪才可进入猪方法的建立与应用研究[D].贵阳：贵州备猪每年至少免疫2次，接种猪瘟活疫场。对引种要严格把关，引进的种猪必大学，2015.

苗剂量每头不少于6头份，其中种母猪

须是从无猪瘟的猪场引进，该猪场具有

(收稿日期：2016-04-05)

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