第３２卷第１２期 ２０１０年ｌ２月 中国预防兽医学报 ＶＯＩ．３２．ＮＯ．１２ Ｄｅｃ． ２Ｏ１０ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００８—０５８９．２０１０．１２．０９ ＴＴＶ１与ＴＴＶ２ ＳＹＢＲ—Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧光ＰＣＲ 检测方法的建立和应用 陈 欣 ，符 芳 ，王 伟 ，李雪松 ，李海忠 ，宋淑萍 ，李 曦 （１．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨１５０００１；２．哈尔滨师范大学，黑龙江哈尔滨１５０００１） 摘要：为建立输血性传播病毒（ＴＴＶ）基因１型（ＴＴＶ１）和ＴＴＶ基因２型（ＴＴＶ２）的检测方法，本研究根据 ＴＴＶ１与ＴＴＶ２基因的非编码区域序列差异，设计了２对特异引物，建立了鉴别ＴＴｖ１和ＴＴｖ２的ＳＹＢＲ．Ｇｒｅｅｎ Ｉ 实时荧光ＰＣＲ方法。分别进行了特异性、敏感性及重复性检验，结果表明：重组质粒建立的标准曲线相关系数 为９９％；可以同时鉴别检测ＴＴＶ１和ＴＴＶ２，检测ＰＣＶ２和ＰＲＲＳＶ阳性样品均呈阴性，表明该方法具有良好的 特异性；最低检出量为１０ ｃｏｐｉｅｓ／ｐ￣Ｌ；重复试验结果显示，ＴＴＶ１组内和组间变异系数分别为０．１４％和０．７４％； ＴＴＶ２组内和组间变异系数均为０．１３％；检测现地采集的１８９份样品，ＴＴＶ１阳性率３２．３％，ＴＴＶ２阳性率６．３％， ＴＴＶ１和ＴＴＶ２混合感染的阳性率２８．６％。ＴＴＶ检测方法的建立为猪群ＴＴｖ病的流行病学调查提供了有效的手段。 关键词：ＳＹＢＲ．Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧光ＰＣＲ；ＴＴＶ１；ＴＴＶ２ 中图分类号：￥８５２．６５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８—０５８９（２０１０）１２．０９４８．０４ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｄｕｐｌｅｘ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ Ｔｏｒｑｕｅ Ｔｅｎｏ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｔｙｐｅ １ ａｎｄ ２ ＣＨＥＮ Ｘｉｎ ，ＦＵ Ｆａｎｇ ，ＷＡＮＧ Ｗｅｉ ，ＬＩ Ｘｕｅ－ｓｏｎｇ ，ＬＩ Ｈａｉ—ｚｈｏｎｇ ，ＳＯＮＧ Ｓｈｕ—ｐｉｎｇ ，ＬＩ Ｘｉ （１．Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｗｉｎｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａ￣ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｒｂｉｎ １５０００１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｈａ￣ｉｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ １５００００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｄｕｐｌｅｘ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｔ ｔｈｅ ＵＴＲ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ Ｔｏｒｑｕｅ Ｔｅｎｏ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｔｙｐｅ １ ａｎｄ ２（ＴＴＶｌ ａｎｄ ＴＴＶ２）．Ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｃｏｕｌｄ ｓｐｅｃｉｉｆｃａｌｌｙ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｃＤＮＡｓ ｏｒ ＤＮＡ ｏｆ ＴＴＶｌ ａｎｄ ＴＴＶ２．ｂｕｔ ｎｏｔ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｔａｉｎｓ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｕｓ ａｎｄ ｐｏｒｃｉｒｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｕｓ ２．Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｒｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｗａｓ １０ ｃｏｐｉｅｓ／￣Ｌ ｆｏｒ ＴＴＶ１ ａｎｄ ＴＴＶ２．Ｔｅｓｔｅｄ ｏｎ ＤＮＡ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ １８９ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｐｉｇｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｕｐｌｅｘ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ３２．３％ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｆｏｒ ＴＴＶ１．６－３％ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｆｏｒ ＴＴＶ２ ａｎｄ ２８．６％ｆｏｒ ＣＯ—ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＴＶ１ ａｎｄ ＴＴＶ２． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ；ＴＴＶ１：ＴＴＶ２ 输血性传播病毒（Ｔｏｒｑｕｅ Ｔｅｎｏ ｖｉｒｕｓ／Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｖｉｒｕｓ，ＴＴＶ）是一种与手术及输血后发生 人肝炎病高度相关的病毒…，通过水平传播和垂直 传播两种途径感染，其中输血是ＴＴＶ传播的重要传 ＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ 播途径之一ｍ 。根据ＯＲＦ１的序列差异，可将ＴＴＶ 分为５个基因群（ＴＴＶ１￣ＴＴＶ５）ｔｓｌ，其中，仅ＴＴＶ１和 ＴＴＶ２在猪群中检测到，猪源ＴＴＶ可以污染猪源疫 苗及生物制品，因此受到该行业的重视＿５＿。相关报 收稿日期：２０１０—０５．２１ 基金项目：黑龙江省自然基金重点项目（ＺＪＮ０５０３—０２） 作者简介：陈欣（１９８５一），女，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，主要从事兽医传染病及其病原生物学和分子免疫学 研究． 通信作者：Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｘｉ＠ｈｖｒｉ．ａｃ．ｃｎ 第１２期 陈欣，等．ＴＴｖｌ与ＴＴＶ２ ＳＹＢＲ—Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧光ＰＣＲ检测方法的建立和应用 ９４９ 道证实，ＴＴＶ在猪群中广泛存在，并与某些猪病的 发生有明显的相关性【ｌ６）。ＭａｒｔｅｌｌｉＦ等对意大利南部 １７９头健康猪的血清进行ＰＣＲ检测，育肥猪、分娩 育肥猪和断乳仔猪ＴＴＶ阳性率分别为４０．１％、 １ １．０％和５７．４％【”］。Ｔａｋａｃｓ等对１６６头成年猪和断 乳仔猪的血清样本检测，成年猪ＴＴＶ阳性率为３０％， 断乳仔猪为７３％ｌｌ４］。Ｔｕｉｊａ等对西班牙猪群中仔猪 断乳后多系统衰竭综合症（ＰＭＷＳ）阳性猪群、阴性 猪群进行ＴＴＶ调查时发现，ＰＭＷＳ阳性猪群中， ＴＴＶ的感染率明显高于ＰＭＷＳ阴性猪群ｆｌ２］。我国７ 个省份猪群的流行病学调查结果表明，ＴＴＶ已在我 国猪群中普遍存在，成为一个不可忽视的新病原ｆ６１。 本实验采用ＳＹＢＲ．Ｇｒｅｅｎ １实时荧光ＰＣＲ方法， 根据ＴＴＶＩ、ＴＴＶ２的非编码区域（ＵＴＲ）基因序列的 差异，设计２对特异引物，建立了同时检测ＴＴＶ１ 和ＴＴＶ２的ＳＹＢＲ－Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧光ＰＣＲ方法，为 猪群ＴＴＶ病的流行病学调查提供了有效的手段。 １材料和方法 １．１ 病料及病毒株 １８９份组织脏器、全血样品随 机采自黑龙江、吉林不同地区的５个大中型猪场； 猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）经典株Ｃｈｌ—ａ、高 致病株ＨｕＮ４和猪圆环病毒（ＰＣＶ１ ２型ＰＣＶ２ ８７１均 由本实验室保存。 １．２主要试剂 血液／细胞／组织ＤＮＡ提取试剂 盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技有限 公司；ＡｘｙＰｒｅｐ总ＲＮＡ小量制备试剂盒购自爱思进 生物技术有限公司；Ｍ—ＭＬＶ和ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ均购自ＴａＫａＲａ公司。 １．３病毒核酸的提取按照ＤＮＡ提取试剂盒说明 书提取病料ＤＮＡ；按照ＡｘｙＰｒｅｐ总ＲＮＡ小量制备 试剂盒说明书提取病毒总ＲＮＡ，常规方法进行逆转 录以获得ｃＤＮＡ。 １．４引物设计与合成将ＧｅｎＢａｎｋ登录的ＴＴｖ１和 ＴＴＶ２的基因序列进行同源性比较，应用Ｏｌｉｇｏ６．０ 软件，于ＵＴＲ区域设计２对特异性引物（表１），引 物由上海生工生物工程服务有限公司合成。 １．５标准品的制备 以病料ＤＮＡ为模板，进行 ＰＣＲ扩增，１００ Ｌ体系反应条件为：９４℃５ ｍｉｎ； ９４℃３０ Ｓ、５０℃３０ Ｓ、７２℃３０ Ｓ，３０个循环；７２℃ ３ ｍｉｎ。ＰＣＲ产物经试剂盒回收并测序，与ｐＭＤ１８．Ｔ 载体连接，获得ｐＭＤ．ＴＴＶ１和ｐＭＤ—ＴＴＶ２阳性质粒 作为标准品备用。 表１ 用于扩增ＴＴＶ１、ＴＴｖ２特异序列的引物 Ｔａｂｌｅ ｌ ｓｅｑＩｌ舶ｃｅ Ｏｆｌｎｉｍ￣ｆｏｒ Ａｍｐｌｉｆｉｅｎｌｉｏｎ ｏｆ ＴⅣ１ ａｎｄ ｒｒ、，２ １．６ 熔解曲线的建立将ｐＭＤ．ＴＴＶ１和ｐＭＤ．ＴＴＶ２ 标准品按照１ ０９～１０ｏ倍比稀释作为模板，通过特异 引物进行ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧光ＰＣＲ反应。反应 条件为：９５℃１０ Ｓ；９５℃５ Ｓ、５２℃２５ Ｓ、７２℃ ２０ Ｓ。４０个循环。Ｒｏｔｏｒ．ｇｅｎｅ３０００荧光定量ＰＣＲ仪 收集荧光信号，建立熔解曲线。 １．７ 特异性试验 分别以ＰＲＲＳＶ的ＨｕＮ４株、 ＣＨ．１ａ株、ＰＣＶ２ ８７１株的ｃＤＮＡ和ＤＮＡ、ｐＭＤ．ＴＴＶ１ 和ｐＭＤ．ＴＴＶ２阳性标准品为模板，同时设置阴性对 照，按照１．６方法进行ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧光ＰＣＲ 特异性检测。 １。８敏感性试验将ＴＴＶ１和ＴＴＶ２标准品按照 １Ｏ ～ｌ０。倍比稀释分别作为模板，进行ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧光ＰＣＲ敏感性检测。 １．９重复性试验将同一批次的两个阳性标准品， 分别稀释为１０ ｃｏｐｉｅｓ／ｉｘＬ，进行ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时 荧光ＰＣＲ，根据其Ｔｍ值差异，计算组内重复试验 变异系数（ｃｖ）；将不同批次的两个阳性标准品，分 别稀释为１０ ｃｏｐｉｅｓ／ｉｘＬ，每间隔７ ｄ进行ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧光ＰＣＲ检测，根据其Ｔｍ值，计算 组间重复试验ＣＶ值。 １．１０样品检测应用建立的ＳＹＢＲ．Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧 光ＰＣＲ鉴别ＴＴＶｌ和ＴＶ２的检测方法，检测采集自 黑龙江、吉林５个大中型猪场猪只的组织脏器、全 血样品共计１８９份，对结果进行统计学分析。 ２ 结 果 ２．１ 标准曲线的建立 以ｐＭＤ—ＴＴＶ１和ｐＭＤ— ＴＴＶ２标准质粒为模板，进行ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧 光ＰＣＲ。扩增结果显示，当ｃｔ值≤３０，阴性对照无 扩增，动力学曲线呈现指数扩增时，Ｔｍｌ在７９℃± Ｏ．２５℃（ｐＭＤ—ＴＴＶ２）出现特异的荧光信号，判定其 ９５０ 中国预防兽医学报 为ＴＴＶ２阳性；Ｔｍ２在８２℃±０．２５℃（ｐＭＤ— ＴＴＶ１）出现特异性的扩增信号时，判定其为ＴＴＶ１ 阳性ｆ图１）。 ｌｌ＿ 八 丌 ／Ｎ．ｑ ’Ｃ ’ ／二＼／＼＼ 、、． ｔｈｒｅｓｈ‘，Ｈ 一 一 ７６ ７７ ７８ ７９ ８０ ８ｌ ８２ ８３ ８４ ８５ ８６ ８７ ８８ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ℃ 注：ＮＴＣ：无模板对照 Ｎｏｔｅ：Ｎｏ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌ，ＮＴＣ 图１ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ试验熔解曲线图 Ｆｉｇ．１ Ｉｍａｇｅ ｏｆｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ ｏｆｔｈｅ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ２．２ 特异性试验 以ＰＲＲＳＶ的ＨｕＮ４株、ＣＨ—ｌａ 株、ＰＣＶ２ ８７１株的ｃＤＮＡ乖口ＤＮＡ、ＴＴＶＩ和ＴＴｖ２ 阳性标准品为模板，无模板为阴性对照，ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧光ＰＣＲ特异性检测结果表明，仅 ＴＴＶ１和ＴＴＶ２阳性标准品呈阳性，其余样品检测结 果均为阴性（图２）。 ｄＦ／ｄ ０６ 。 ０５ ０４ ／＿ 一 ８ ｇ ０３ ＴＴｖ ０２ ＼ｌ Ｏ１ — ＼ Ｃ ｌ ｃ。 一 ｖｚ ， ０ Ⅷ ‘、 ＞‘—一、、—／、、—一 Ｏ ｆ ７６ ７７ ７８ ７９ ８０ Ｉ２ ｊ ８４ Ｏ ／ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ℃ 图２ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｒｅａ１．ｔｉｍｅ ＰＣＲ试验特异性试验结果 Ｆｉｇ．２ Ｓｐｅｅｉｉｆｃｔｅｓｔ ｏｆ ｈｔｅ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｒⅣｌ ａｎｄ ＴＴＶ２ ２．３敏感性试验将ＴＴＶ１和ＴＴＶ２标准品按照 １０。～１０ｏ倍比稀释作为模板，进行ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ实 时荧光ＰＣＲ，最低检出量为１０ ｃｏｐｉｅｓ／ｐ．Ｌ（表２）。 ２。４ 重复性试验 组内重复性试验结果表明， ＴＴＶ１的Ｔｍｌ ＣＶ值为０．１４％，ＴＴＶ２的Ｔｍ２ ＣＶ值 为０．１３％（表３）；组间重复性试验的结果表明， ＴＴｖ１的Ｔｍｌ ＣＶ值为０．７４％，ＴＴＶ２的Ｔｍ２ ＣＶ值 为０．１３％（表４）。 表２ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧光ＰＣＲ的敏感性试验结果 Ｔａｂｌｅ ２ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆｔｈｅ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｅｒａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ 表３ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧光ＰＣＲ的组内 重复性实验结果 Ｔａｂｌｅ ３ Ｉｎｌｒａ－ａｓｓａｙ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆｔｈｅ ＳⅦＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ 表４ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧光ＰＣＲ的组间 重复性实验结果 Ｔａｂｌｅ ４ Ｈｎｔｅｒ－ａｓｓａｙ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆｔｈｅ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ２．５ 样品检测结果应用本研究建立的ＳＹＢＲ—Ｇｒｅｅｎ Ｉ 实时荧光ＰＣＲ鉴别ＴＴＶ１、ＴＴＶ２方法，检测采集 自黑龙江、吉林５个大中型猪场猪的组织脏器和全 血样品共计１８９份（表５）。 表５ 运用本方法进行样品检测的结果 Ｔａｂｌｅ ５ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＳＹＢＲ－Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｒｅａｌｔｉｍｅ．ＰＣＲ ３ 讨 论 目前，主要根据ＴＴＶ１和ＴＴＶ２基凶组的差异， 建立了普通ＰＣＲｔ 、半套式ＰＣＲ［ ］、套式ＰＣＲ［ 和 滚环扩增…］等方法检测ＴＴＶ，相比较而言，普通 ＰＣＲ易出现假阳性结果，敏感性较差；半套式 ＰＣＲ、套式ＰＣＲ和滚环扩增，耗时较长，自动化程 度较低。Ａｎｄｒｅｓｓ等根据探针法，建立了ＴａｑＭａｎ实 时ＰＣＲ方法，鉴别诊断ＴＴＶ１和ＴＴＶ２ ］。该方法 第１２期 陈 欣，等ＴＴＶ１与ＴＴＶ２ ＳＹＢＲ—Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧光ＰＣＲ检测方法的建立和应用 ９５１ 敏感性试验结果表明，最低检出量１０ ｃｏｐｉｅｓ／ｔｘＬ，扩 增效率为９９％，ＴＴｖ１的组问和组内ＣＶ分别为１．７％ 和２．１％，ＴＴＶ２的组间和组内ＣＶ分别为ｌ２．７％和 １０．３％。 本研究应用荧光法建立的同时检测ＴＴｖ１、 ＴＴＶ２的实时荧光ＰＣＲ方法，通过特异性、敏感性 和重复性试验验证，结果表明，不同的Ｔｍ值区分 判定ＴＴｖｌ和ＴＴＶ２，经分析结果具有较大的差异 （７９℃±Ｏ．２５℃，８２℃±０．２５℃）。其敏感性及扩增 效率等同于已建立的ＴａｑＭａｎ法。重复性试验表明， 本方法的ＴＴｖｌ组问和组内ＣＶ值分别为０．１４％和 ０．７４％，ＴＴＶ２组内和组间变异系数均为０．１３％。 比较ＴａｑＭａｎ法，具有更为良好的稳定性。另外， 相对于探针法而言，荧光法成本更加低廉，而且根 据其标记原理，并不会由于单个碱基的改变而导致 假阴性结果，凶此，具有更为优异的可应用性。该 方法的建立为猪群ＴＴＶ病的流行病学调查提供了有 效的手段。 参考文献 Ｎｌｓｈｉｚａｗａ Ｔ，Ｏｋａｍｏｔｏ Ｈ．Ｋｏｎｉｓｈｌ Ｋ．ｅｔ ａ１．Ａ ｎｏｖｅｌ ＤＮＡ ｖｉｒｕｓ （ＴＴＶ）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｐｏｓｔｔｒａｎｓ－ ｆｕｓｉｏｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｏｆ ｔｍｋｎｏｗｎ ｅｔｉｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，１９９７，２４１（１）：９２—９７． ［２］ Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｇｕｉｎｏ Ｌ，Ｋｅｋａｒａｉｎｅｎ Ｔ，Ｓｅｇａｌｅｓ Ｊ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｔｏｒｑｕｅ ｔｅｎｏ ｖｉｒｕｓ（ＴＴＶ）ｖｅｒｔｉｃａｌ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｉｎ ｓｗｉｎｅ【Ｊ］Ｔｈｅｒｉ－ ｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ２００９，７ｌ ｆ９１：１３９０—１３９５． ［３］ Ｐｏｚｚｕｔｏ Ｙ，Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｂ，Ｍｅｅｈａｎ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｉｎ ｕｔｅｒｏ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｔｏｒｑｕｅ ｔｅｎｏ ｖｉｒｕｓｅｓ［Ｊ】ｌ Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００９．１３７（３－４）： ３７５．３７９． ［４］ Ｍｕｓｈａｈｗａｒ Ｉ Ｋ，Ｅｒｋｅｒ Ｊ Ｃ，Ｍｕｅｒｈｏｆｆ Ａ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＴ ｖｉｕｒｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｎｅｗ ｖｉｒｕｓ ｆａｍｉｌｙ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｈｕｍａｎｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， １９９９，９６（６）：３１７７．３１８２ ［５］ Ｋｅｋａｒａｉｎｅｎ Ｔ，Ｍａｒｔｉｎｗｚ Ｇ Ｌ，Ｓｅｇａｌｅｓ Ｊ．Ｓｗｉｎｅ ｔｏｒｑｕｅ ｔｅｎｏ ｖｉｕｒｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｉｇ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｖａｃｃｉｎｅｓ，ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏ— ｒｙ ｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｄｒｕｇｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｏｒｉ— ｇｉｎ【Ｊ］Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，２００９，９０：６４８—６５３ ［６］ 王礞礞，周艳君，童光志，等．我国猪群中１ｖｒｖ的鉴定及 其分子流行病学分析『Ｊ］．中国预防兽医学报，２００９，３１ （１ ｏ）：７５１－７５６． 【７】 Ｂｒａｓｓａｒｄ Ｊ，Ｇａｇｎｅ Ｍ Ｊ，Ｌａｍｏｕｒｅｕｘ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ａｎｄ ｐｏｒｃｉｎｅ ｔｏｒｑｕｅ ｔｅｎｏ ｖｉｕｒｓ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｆｅｃｅｓ【Ｊ］． Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００８，１２６（１－３）：２７１・２７６． 【８］ Ｄｅｖａｌｌｅ Ｓ．Ｎｉｅｌ Ｃ．Ｄｉｓｔｉｒｂｕｔｉｏｎ ｏｆ丁『Ｖ ｇｅｎｏｍｉｃ ｇｒｏｕｐｓ １—５ ｉｎ Ｂｒｉｚｉｌｉａｎ ｂｌｏｏｄ ｄｏｎｏｒｓ，ＨＢＶ ｃａｒｒｉｅｒｓ，ａｎｄ ＨＩＶ－１ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ【Ｊ】．Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ，２００４，７２（１）：１６６—１７３． ［９］ Ｏｋａｍｏｔｏ Ｈ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｍ，Ｎｉｓｈｉｚａｗａ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｈａｒａｃ— ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＴ ｖｉｒｕｓｅｓ（ＴＴＶｓ）ｉｎ ｐｉｇｓ，ｃａｔｓ ａｎｄ ｄｏｇｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｌａｔｅｄｎｅｓｓ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｅｓ－ｓｐｅｃｉｉｆｃ ＴＴｖｓ ｉｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ ａｎｄ ｔｕｐａｉａｓ 【Ｊ］．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，２００２，８３：ｌ２９ｌ—ｌ２９７． ［１０］ Ｓｅｇａｌｅｓ Ｊ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｇ Ｌ，Ｃｏｒｔｅｙ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｓｗｉｎｅ ｔｏｒｑｕｅｔｅｎｏ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｇｒｏｕｐｓ １ ａｎｄ ２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ １９８５ ｔｏ ２００５ ｉｎ Ｓｐａｉｎ（Ｊ］Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００９，１３４（３—４）： Ｉ９９．２０７． Ｎｉｅｌ Ｃ，Ｄｉｎｉｚ－Ｍｅｎｄｅｓ Ｌ，Ｄｅｖａｌｌｅ Ｓ．Ｒｏｌｌｉｎｇ～ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｒｑｕｅ ｔｅｎｏ ｖｉｒｕｓ（ＴＴＶ）ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｓｗｉｎｅ ｓｅｒａ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｗｉｎｅ Ｔｒ、，ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ ［Ｊ］．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，２００５，８６：１３４３—１３４７． ［１２］ Ｋｅｋａｒａｉｎｅｎ Ｔ，Ｓｉｂｉｌａ Ｍ，Ｓｅｇａｌｅｓ Ｊ．Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｓｗｉｎｅ ｔｏｒｑｕｅ ｔｅｎｏ ｖｉｕｒｓ ｉｎ ｐｏｓｔ－－ｗｅａｎｉｎｇ ｍｕｌｔｉ－ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｗａｓｔｉｎｇ ｓｙｎ￣ｏｍｅ （ＰＭＷＳ）一ａｆｆｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｎｏｎ—ＰＭＷＳ－ａｆｆｅｃｔｅｄ ｐｉｇｓ ｉｎ Ｓｐａｉｎ［Ｊ］．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，２００６，８７：８３３・８３７． 【１３】 Ｍａｒｔｅｌｌｉ Ｆ，Ｃａｐｒｉｏｌｉ Ａ，Ｄｉ Ｂ Ｉ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｗｉｎｅ ｔｏｒｑｕｅ ｔｅｎｏ ｖｉｕｒｓ ｉｎ Ｉｔａｌｉａｎ ｐｉｇ ｈｅｒｄｓ［Ｊ］．Ｊ Ｖｅｔ Ｍｅｄ Ｂ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｖｅｔ Ｐｕｂｌｉｅ Ｈｅａｌｔｈ，２００６，５３（５）：２３４－２３８． ［１４】 Ｔａｋａｃｓ Ｍ，Ｄｅｎｃｓ Ａ，Ｃｓｉｓｚａｒ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｆｉｒｓｔ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｓｗｉｎｅ ｔｏｒｑｕｅ ｔｅｎｏ ｖｉｒｕｓ（ＴＴＶ）ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ ｉｎ Ｈｕｎｇａｒｙ：ｓｈｏｒｔ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｃｔａ Ｖｅｔ Ｈｕｎｇ，２００８，５６ ｆ４１：５４７—５５３． ［ｉ５］ Ｇａｌｌｅｉ Ａ，Ｐｅｓｃｈ Ｓ，Ｅｓｋｉｎｇ Ｗ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｐｏｒｃｉｎｅ ｔｏｒｑｕｅ ｔｅｎｏ ｖｉｕｒｓ： Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ｌｏａｄｓ ｂｙ ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｌｆｉｐｌｅｘ ＲＴ—ＰＣＲ，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｏｇｒｏｕｐｓ １ ｏｒ ２，ａｎｄ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｆｕｌｌ・ｌｅｎｇｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ［Ｊ】 Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００９，２１． ［１６］ Ｅｌｌｉｓ Ｊ Ａ，ＡＩｌａｎ Ｇ，Ｋｒａｋｏｗｋａ Ｓ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ１ ｐｏｒｃｉｎｅ ｔｏｒｑｕｅ ｔｅｎｏ ｖｉｕｒｓ ｏｎ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｕｒｓ ｔｙｐｅ ２－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｏｓｔｗｅａｎｉｎｇ ｗａｓｔｉｎｇ ｓ￣＆ｏｍｅ ｉｎ ｇｎｏｔｏｂｉｏｔｉｃ ｐｉｇｓ ［Ｊｊ＇Ａｍ Ｊ Ｖｅｔ Ｒｅｓ，２００８，６９（１２）：１６０８—１６１４． （本文编辑：杨朋欣）