红花玉兰MwZFP10基因的克隆及功能分析

ActaBot．Boreal．ＧOccident．Sin．

():/　　文章编号:１０００Ｇ４０２５２０１８０８Ｇ１３９２Ｇ０９　　　　　　　　　　　　　　　doi１０．７６０６．issn．１０００Ｇ４０２５．２０１８．０８．１３９２j

红花玉兰MwZFP１０基因的克隆及功能分析

(北京１湖北宜昌１北京林业大学林学院省部共建森林培育与保护教育部重点实验室,０００８３;２三峡大学生物技术研究中心,

梁　爽１,肖爱华１,马　江１,陈发菊２,桑子阳３,马履一１∗

)湖北五峰４４４３００２;３湖北五峰土家族自治县林业科学研究所,４３４１３

摘　要:该研究选取了湖北五峰地区红花玉兰新品种‘娇红１号’为研究材料,基于实验室前期对红花玉兰转录组().生物信息学分析显示,,类基因Mw开放ZFP１０GenBank登录号为MH０３７３１４MwZFP１０基因全长为１１１７bp,阅读框７编码２蛋白分子式为C分子量２理论等电点４．含有一２６b４１个氨基酸,S６．４kD,４２,p１１２８H１７６０N３２２O３８３１４,个C具有N端的QA２H２型锌指结构域.对比分析发现MwZFP１０属于SUPERMAN类锌指蛋白,LGGH和C端))、))富含亮氨酸的L(延伸链(和β转角(构成红花玉兰MwIDLXLR(K)L保守结构域.α螺旋(HhEeBtZFP１０蛋

测序差异显著表达基因中筛选到的６采用R４５bACE技术克隆得到１个SUPERMANp花发育相关的核心片段,

白的基本结构,蛋白的三级结构具有典型的锌指空间构型.Mw可能定位于细胞核中.ZFP１０蛋白为亲水性蛋白,半定量和实时荧光定量结果显示,叶片和苞片中均有表达,且花器官的雌蕊中表达量较高.MwZFP１０在花器官、过表达Mw叶片卷缩,花器官发育畸形等特征.研究认为,ZFP１０转基因拟南芥表现为植株矮小且不育,

MwZFP１０基因在植物花器官的生长和发育中起重要作用.关键词:红花玉兰;锌指蛋白;基因克隆;花器官;转基因中图分类号:Q７８５;Q７８６;Q７８９

文献标志码:A

CloninndFunctionIdentificationofMwZFP１０ga

GenefromManoliawuenensisgfg(,,,１KeaboratororSilvicultureandConservationofMinistrfEducationColleeofForestBeiinorestrniversityLyfyogyjgFyUy

１１１２３１∗

,MAJ,LIANGShuanXIAOAihuaianCHENFauSANGZianüig,g,jyg,MALy

;,,,H;Beiin０００８３,China２ThreeGoresUniversitBiotechnoloesearchCenterYichanubei４４３００２,China３Forestrjg１gygyRgy,Wu,H)ResearchInstituteofWufenountfenubei４４３４１３,ChinagCyg

:,AbstractInthisstudthenewseciesManoliawuenensis‘Jiaohono．１’wasselectedasthereＧypgNgfg,H)searchmaterialinWufenubei．ASUPERMANlikegeneMwZFP１０(GenBankaccessionMH０３７３１４g

,wasclonedwith３′RACEmethodbasedonthe６４５boreframentrelatedwithfloraldevelomentandpcgp

theframentwasfilteredoutfromdifferentiallxressedgenesbasedonpreＧLaboratorDNAlibrarfgyepycyoManoliawuenensis．BioinformaticsanalsisofMwZFP１０geneshowedthatthefulllenthofyggfgMwZFP１０cDNAwas１１１７bithanoenreadinrame(ORF)of７２６bncodin４１aminoacids．pwpgfpeg２TheproteinmolecularformulaisCSmolecularweihtis２６．４kDandisoelectricpointisg１１２８H１７６０N３２２O３８３１４,

:４．４２．TheproteincontainsaconserveddomaintheC２H２Ｇtezincfiner．Comarativeanalsisfoundypgpy

,thatMwZFP１０belonstotheSUPERMANＧlikezincfinerproteinwiththe“QALGGH”intheNtermiＧgg

收稿日期:修改稿收到日期:２０１８Ｇ０４Ｇ０５;２０１８Ｇ０６Ｇ０８

)基金项目:林业公益性行业科研专项(２０１５０４７０４

,:作者简介:梁　爽(女,硕士研究生,主要从事红花玉兰花发育分子机制研究.E１９９３－)Ｇmaillianshuan＠bfu．edu．cnggj

:m马履一,教授,博士生导师,主要从事森林培育研究.E∗通信作者:Ｇmailalui＠bfu．edu．cnyj

等:红花玉兰Mw８期　　　　　　　　　　　　　梁　爽,ZFP１０基因的克隆及功能分析１３９３

)),))naland“L(IDLXLR(K)L”intheCterminal．αＧhelix(Hhextendedchain(EeandβＧturn(BtconstiＧ

tutearethebasicstructureoftheprotein．Thetertiartructureoftheproteinhasaticalzincfinerysypgsatialconfiuration．Theproteinishdrohilicandmainllocalizedinthenucleus．ThesemiＧuantitativepgypyq

,PCRandquantitativerealＧtimePCRresultsshowedthatMwZFP１０wasexressedinfloraloransleafpg

,budsandbractsandthepistilexressionwashiherinfloralorans．MwZFP１０transenicArabidosispgggp,,m,thalianaischaracterizedbhortandsterileplantscurlineavesalformationoffloweroransetc．ysglg

ThegeneMwZFP１０planimortantroleinthefloralrowthanddeveloment．yapgp

:;;;KeordsManoliawuenensis;zincfinerproteinenecloninfloralorantransenesggggggfgyw　　C２H２类锌指蛋白是一类植物生长发育和

][达苹果的Md转基因烟草呈现植株矮SUP３基因,

响应逆境胁迫等过程的重要转录因子１

白的基因,在其的结构域QALNC２端和H２.SUPERＧMAN类基因是家族中的一类编码单锌指蛋

GGH和C端分别含有一个高度保守

L/IDLELRLG.SUPERＧMAN类基因广泛参与花器官发育、

植株生长、形态建成、激素及逆境响应等过程[

２Ｇ４]

(Arabidopsisthaliana.在拟南芥ERMAN类基因５)是首个克隆的SUPERMA,中,目S前U已PE发R现MA了N３３个UP[]

其N中类基因,基因,

具有抑制花器官原基细胞过度的功能,在控制雄蕊和心皮的边界形成中起作用.根据花发育的、二轮花器官中表达,而BAB功能基因在第C模型,A功能基因在第一二、三轮花器官中表达,轮表达[SUPERMANC功能基因则在第三、四

６]

.基因通过PETALA３和PISTIB类花器

官特征决定基因(ALLATA在雄蕊中的表达,进而影响雄蕊和雌蕊的分化[

７]

)在SUPERMAN基因的突变体中,第三轮花器官分.生组织细胞过度,从而影响了心皮的发育,最终在心皮位置形成了雄蕊[

８Ｇ９]

续克隆研究了AtZFP１、.R随后又BE、At在Z拟FP南１０芥、中At陆ＧFP１１、KNU和SAZ等基因.AtZFP１基因具有抑制细胞分化的能力,过表达AtZFP１基因使得拟

南芥愈伤不能进一步分化再生成小苗[

１０

]的RBE基因在花瓣原基的早期分化中起.重拟南要芥作用,在rbe突变体中,第二轮花器官发育缺陷,出现与萼片融合的现象,表明RBE能够控制第一轮和

第二轮花器官边界的形成[

１１Ｇ１２]

.拟南芥的KNU基因具有抑制细胞增殖,雌蕊的形成和发育的功

能[１３

]等植物中同样也存在有该类单锌指蛋白.在矮牵牛、水稻、杨树、棉花、苹果[

５]

以的PhSUP１基因与SUPERMAN相似,

可.及恢矮牵牛大豆复拟南芥的superman突变体表型[１４]

mZFP１基因在花瓣和雄蕊以及种子发.育大后豆期的表达升高[１５]

.陆地棉的GZFP基因在花器官中较其他器官表达增强,并参与植物的抗逆调节[

１６

].过表化、节间缩短、叶片卷缩和花色加深等表型,部分花

器官形态异常[

１７]

红花玉兰(M.agnoliawufengensis在湖北五峰发现的木兰科植物新种,其为落叶高大)是２００４年乔木,花杯型,先叶开放,花色内外全红,花被片倒阔

卵形,数目１８]

红花玉兰种质资源９(~１２)

、瓣[育苗技术.课题组前期先后展开了、抗逆性研究以及花器官特征决定基因的功能的研究[

１９Ｇ２４]

性是红花玉兰最具观赏价值的性状,.系统地开展红花器官多样花玉兰花器官发育相关基因的研究,并运用到育种生产实践中,对红花玉兰花型改良与种质创新具有重要的学术意义和应用价值.红花玉兰‘娇红１号’是通过采取红花玉兰接穗嫁接的方式从高海拔地区到低海拔平原地区进行引种繁育,将原生母树优良的观赏性状固定下来培育而获得的新品种.本研究从红花玉兰新品种‘娇红１号’中克隆得到一个

iSCdUaPmERplifMAicatN类基因ionofcDNMwAeZFndPs１)０方,通过法获R得A了CE该(r基ap因Ｇ学分析了DS(codinMwgseZq

FuePn１c０e)的全序长列序结列构,并信通息过、

理生化物性信质息,采用半定量和实时荧光定量PCR的方法分析其在红花玉兰花器官各组织的表达模式,并通过转基因功能分析进一步探究了MwZFP１０基因在植物花

器官发育中的功能.

１．　材料和方法

１１　试验材料及处理方法

２,０分别采１７年３集~红５月在湖北五峰红花玉兰苗木繁育基地花玉兰‘娇红片、雄蕊、雌蕊以及叶片和苞片.１号’的花芽、花被经液氮速冻后置于

－取试剂８０℃冰箱保存.采用盒(艾德莱,北京E)A提SY取sp红in植物总花玉兰花R芽NA提的总R国N)A和,１并使用％凝胶Na电no泳Dr检op测２００R０N(verseTranscriptionSystem逆转录系统ATh的erm质oS量c.ie采nti用fic(Promeg

R,ae美Ｇ

,SZG１３９４西　北　植　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３８卷

１．２　方　法１．２．１　红花玉兰MwZFP１０基因的克隆　根据红花玉兰转录组测序差异显著表达基因数据库中已获得的MwZFP１０基因６４５b′ＧRACE引p片段设计３物３′ＧRACEＧMwZFP１０ＧF１和３′ＧRACEＧMwZFP１０Ｇ

美国)对总RNA逆转录合成第一链cDNA.

(:////httwww．ch．embnet．orsoftwareTMＧpg

)分析MwPRED_form．htmlZFP１０蛋白的跨膜结:///构域;利用SinalP４．１(httwww．cbs．dtu．dkgp

:////)用Protscale(httweb．exas．orrotscaleppygp

分析Mw利用TMZFP１０蛋白疏水性;redServerp

(.参照３表１)F２′ＧFullRACECoreSetwithPriＧ

TM

,大连)中的meScritRTase试剂盒(TaKaRap

//)预测MwservicesSinalPZFP１０蛋白的信号肽区g

:///域;利用SOPMA(httnsaＧbil．ibc．frciＧppppg/)分别预测Mwas．orinteractiveZFP１０蛋白的pyg

二级结构和三级结构;利用WoLFPSORT(htＧ:////Server(httwww．cbs．dtu．dkservicesNetＧp

/)预测MwPhosZFP１０蛋白磷酸化位点.蕊、叶片和苞片的总R并分别以２μNA,NAg总R

末端未知RACE克隆方法扩增MwZFP１０基因３′Ｇ

序列.５末端序列和３末端序列比对和拼接后,′Ｇ′Ｇ获得MwZFP１０基因序列全长.

/_a?p)binnsautomat．lae＝nsa_soma．htmlppgpp

://和SWISSＧMODEL工具(httswissmodel．exＧp

１．２．２　红花玉兰MwZFP１０基因序列结构分析以

及系统发育分析　利用DNAMAN软件对/)上进行核酸序列的同源性分析.将nih．ovgMwZFP１０基因的蛋白序列在NCBI数据库中执行

MwZFP１０基因cDNA序列进行编码区预测.利

(://用BLAST工具在NCBIhttsblast．ncbi．nlm．p

:///)预测tswww．enscrit．comwolfＧsort．htmlpgpp

MwZFP１０基因的亚细胞定位.利用NetPhos３．１１．２．４　红花玉兰MwZFP１０基因表达模式分析　分别提取红花玉兰‘娇红１号’的花被片、雌蕊、雄

://BlastP搜索(httsblast．ncbi．nlm．nih．ov/pg

).选取来源于不同被子植物的１Blast．ci２个SUＧg同时,采用B对MwioEdit软件,ZFP１０蛋白进行结

构域分析.

采用MEPERMAN同源蛋白,GA６．０软件的邻位

)近邻法(构建蛋白氨基酸序列的系统发育树.NJ

PCR方法检测MwZFP１０基因在红花玉兰花被片、

雌蕊、雄蕊、叶片和苞片中的组织表达特异性;半定量RTＧPCRMwZFP１０基因的引物为RTＧ

并以红花玉兰MwZFP１０ＧF和RTＧMwZFP１０ＧR,

为模板逆转录合成第一链cDNA.通过半定量RTＧ

１．２．３　红花玉兰MwZFP１０生物信息学分析　利

:////)用ExPAShttweb．exas．orrotaramy(ppygpp分析Mw利ZFP１０蛋白的理化特性和氨基酸组成;

表１　引物序列

(,.采用实时荧光定量P北京)StarMixGenStarCR

引物为RActin基因作为内参,TＧMwactinＧF、RTＧ

,所用试剂为２×T表１)MwactinＧR(aCRqP

３′RACEＧMwZFP１０ＧF１３′RACEＧMwZFP１０ＧF２MwZFP１０BamHIＧFMwZFP１０SacIＧR

引物Primer

Table１　Primerseuencesq

CCGAAGACACTGGCAATGTTATGG

CGGGATCCATGGTTGTTGAACTTGGTCTACTTCGAGCTCTTACTGCGGCGATGGCCGTTGTCCCCCGTCAACTGGGACTTGGGTTTCTGTTCATTGACCCAACACGAGAAACTGATCCATCGTCTTCATCCGCATCT

)序列Seuence(５′→３′q

RTＧMwZFP１０ＧFQMwZFP１０ＧF

RTＧMwZFP１０ＧRQMwZFP１０ＧR

CGAAGACACTGGCAATGTTATGGGCGCCGTGACCTGACAGATGCTCTTATAAGAACATCCCGTCCTCCTTACTG

RTＧMwactinＧFQMwactinＧF

GAAGATGCGGATGAAGACGATGGAT

RTＧMwactinＧRQMwactinＧRMwZFP１０ＧFMwZFP１０ＧR

CAGACTCGTCATACTCCGCCTTTG

ACCGGAATCAAGCACAATACCTGT

TTACTGCGGCGATGGCCGTTGTCCC

ATGGTTGTTGAACTTGGTCTACTT

等:红花玉兰Mw８期　　　　　　　　　　　　　梁　爽,ZFP１０基因的克隆及功能分析１３９５

技术(分析MwRTＧPCR)ZFP１０基因在不同部位q玉兰A引物为QMwctin基因作为内参,actinＧF和

,表１)所用试剂为FQMwactinＧR(astStartUniverＧ,,重复３火３０s７２℃延伸１min５个循环.实时荧

－ΔΔCt

光定量数据分析采用２法计算MwZFP１０基因

的相对表达量.实时荧光定量MwZFP１０基因的引物为QMw并以红花ZFP１０ＧF和QMwZFP１０ＧR,

IDLELRLG.在不同来源的SUPERMAN类蛋白

之间,除了这２个结构域及其附近的碱基序列高度保守之外,其他序列均呈现高度差异.系统进化分AtZFP１１、AtZFP１０、GZFP、RBE蛋白共聚于一个分支,GmZFP１、AtZFP１和KNU共聚于另一分支析显示,MwZFP１０蛋白与PhSUP１、SlSUP、SUP、

(,.反应程序德国)salSYBRGreenMasterRoche

,为:９５℃５min预变性后,９５℃保持３０s５８℃退

２．３　MwZFP１０蛋白理化性质分析

(.红花玉兰Mw图３)ZFP１０与拟南芥AtZFP１０

聚为一类,因此命名该基因为MwZFP１０.

各器官的相对表达量.

．２．５　基因表达载体的构建及拟南芥转化　选择

MwBI１Z２F１作为基因表达载体.首先通过P１０基因编码区的上、下游分别引入PCR扩增在BamH和SacI酶切位点,随后利用性内切酶BamH和SacIMwZFP１０(基因NewEng

landBiolabs,美国)对上述分别进行双酶切P,并将酶切后的目的基因片段重新CR产物和pBI１２１植物表达载体连接至建重组p质BI粒１２３１载体的５S∷MwXZbFaPI和１０.SmaI位点之间,构MwZFP１０基因表

达载体构建所用的引物为MwMwZFP１０BamHIＧF和

重组ZF质P１粒０S).菌,并通过农３５aS∷cIＧR杆菌Mw(表介导Z１F的P１花０随后通过液氮冻融法将转化序浸染G法V３转１０化１ＧC９０农杆

olＧ０野

生型拟南芥[２５

].T１代种子在含有霉素的叶片及生长MS培养基上筛选点呈绿色且根２周后,

将长势良好５

０μg/mL卡那、真叶部可深入培养基的植株(中培养初步鉴定为阳性转基因苗(白天２２℃１６h,黑)移栽到人工光照培养箱周后分别提取初步筛选的阳性转基因苗的夜２０℃８h)D.N培A养,

并２进行目的基因的PZCFR检测.阳性转基因植株鉴定的引物为MwP１０ＧF和MwZFP１０Ｇ表P１C)R.．　R(

结果与分析

１　红花玉兰MwZFP１０基因的克隆与序列分析

利用RACE克隆技术从红花玉兰中获得了UPERMAN同源基因,命名为ankMwZFP１０登录号为得的MwZFP１０MH基因０３c７３D１N４A.序列共序列分析结果表明,Ge１１１７bp

,包括,

n获Ｇ

３８bp的UT２R　,蛋白序列比对与系统发育分析

编码５′２Ｇ４U１T个氨基酸和R、７２６bp的１O个终止密码子RF和２５３bp的(图．１３′)Ｇ.蛋白序列比对结果显示(图蛋白的２),在MwZFP１０

蛋白典N末端和型的高度C末端分别含有保守的结构域S:UQPAELRGMAGHN类和

子式是ProCtParam分析结果显示MwZFP１０蛋白的分k１１２８H１７６０N３２２O３８３S１４,

蛋白质分子量为２６．４(DLe,u等),电含量分别为点为４．４２１,２富．４含％和丝９氨．１酸％(,S并包含er)和３亮３氨个负酸电荷氨基酸残基和分析显示,酪氨酸(氨酸(亲水性位点均匀分布Asn２１６)分值T１７个正电荷氨基酸残基;疏水性最yr１,小３１推测该蛋白为亲水性蛋白为)－分值最大为３．５４４,疏２水．１性５６位,天冬点(和图

４不含有跨膜结,A).TMTHMM分析结果显示构域(图示,在MwZFP１０蛋白中４,没B)有.信Sig号naMw肽lPZ分FP析１０蛋白

结果显结构域(

图C),推测其不属于分泌蛋白.NetPhos分析结果显

４,示MwZFP１０蛋白有１８个可能的蛋白磷酸化起始密码子和终止密码子用下划线标记,加粗字母为p图oly

１A尾巴,加粗字体且下划线标记为氨基酸保守序列Ini　MwZFP１０基因的核酸序列与氨基酸序列

utniadteirolninceodd,otnh(eAbTolGd)laetntdertseramreinpaotilonAtcoadilo,nt(hTAA)areFiga．c１id　Nconuservedseq

uenceisundey

rlinedandbeoaldminoaccliedostiedq

euesnecq

eueonfceMwanZddFPed１u０cedaminoI１p

I２２SB１２１３９６西　北　植　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３８卷

););););GmZFP１．大豆(NP_００１２３７７３２．１GZFP．陆地棉(AAZ７９４７０．２KNU．拟南芥(NP_１９６９０５．１LIF．矮牵牛(BAB５８８９７．１););););红花玉兰(MwZFP１０．MH０３７３１４PhSUP１．矮牵牛(AB１１７７４９RBE．拟南芥(OAO９４８７４．１SAZ．拟南芥(NM_１１７８９１

););框内示意SSlSUP．白麦瓶草(BAH５９４３２．１SUP．拟南芥(AAC４９１１６．１UPERMAN类蛋白的保守序列.

相似性:黑色＝１粉色≥７蓝色≥５００％;５％;０％

);););hbrida(AB１１７７４９RBE．Arabidosisthaliana(OAO９４８７４．１SAZ．Arabidosisthaliana(NM_１１７８９１SlSUP．Sileneypp););latiolia(BAH５９４３２．１SUP．Arabidosisthaliana(AAC４９１１６．１Theboxindicatestheconservedseuenceofqfp:SUPERMANlikezincfinerprotein．ConservedpercentBlack＝１００％;Pink≥７５％;Blue≥５０％g

(););Mw);NP_１９６９０５．１LIF．Petuniahbrida(BAB５８８９７．１ZFP１０．Manoliawuenensis(MH０３７３１４PhSUP１．Petuniaygfg););GmZFP１．Glcinemax(NP_００１２３７７３２．１GZFP．Gossiumhirsutum(AAZ７９４７０．２KNU．Arabidosisthalianayypp图２　MwZFP１０及同源蛋白的多序列比对

Fi．２　MultileseuencealinmentofMwZFP１０andhomoloicalproteinsgpqgg

计算方法为邻位相连法.每个分支上的数字表示１０MEGA６．０用于构建系统发育树,００次重复搜索的置信度MEGA６．０isaliedtoconstructthetreebeihborＧoininethod．NumbersonbranchesindicatebootstrappyNgjgmp

图３　MwZFP１０蛋白与其他植物相关蛋白氨基酸序列的系统进化分析

estimatesfor１０００relicateanalsispy

Fi．３　PhloeneticanalsisofMwZFP１０proteinwithotherrelatedproteinsindifferentplantsgygy

等:红花玉兰Mw８期　　　　　　　　　　　　　梁　爽,ZFP１０基因的克隆及功能分析１３９７

)表示综合结果;图中第一条横线(A．Protscale工具预测蛋白疏水性;B．MwZFP１０的跨膜结构分析,１．０~１．２

C．MwZFP１０的信号肽预测(CＧscore表示剪切位置分值,SＧscore表示信号肽分值,YＧscore表示综合

;剪切位置分值)D．MwZFP１０的磷酸化位点预测

();Thefirsthorizontalline１．０－１．２inthegrahreresentsthecomrehensiveresultC．SinaletideanalsisofMwZFP１０pppgppy

);combinedcleavaesitescoreD．PredictedphoshorlationsiteforMwZFP１０betPhos３．１ServergpyyN,,binalP４．１(CＧscoremeanscleavaesitescoreSＧscoremeanssinaletidescoreYＧscoremeansySgggpp

;A．HdrohobicanalsisofMwZFP１０brotscaleB．TransmembraneanalsisofMwZFP１０bredSerer．ypyyPyyTMp

图４　MwZFP１０蛋白的理化性质分析

Fi．４PhsicochemicalroertiesofMwZFP１０gypp

()()()螺旋;延伸链;转角hHh．αＧeEe．tBt．Ｇβ

()m;()m;()mhHheansalhahelixeEeeansextendedstrandtBteansbetaturnp

图５　MwZFP１０蛋白的二级结构预测

.S位点(图４,螺旋D)OPMA分析结果显示αＧ

(),))延伸链(和β转角(构成了红花玉兰HhEeＧBt

位点,包括１４个Ser位点,３个Thr位点和１个Try

Fi．５　SecondartructurepredictionofMwZFP１０proteingys

MwZFP１０蛋白的基本结构,分别占２０．３３％、

).SW图５２１．９９％和７．４７％(ISSMODEL分析结果显示MwZFP１０蛋白呈现典型的锌指空间构型

１３９８西　北　植　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３８卷

().亚细胞定位预测结果显示Mw图６ZFP１０蛋白

:::细胞核分数明显高于细胞nucl１１;cte１;extr１,y质及其他部位,推测其可能定位在细胞核中.２．４　MwZFP１０组织表达特异性分析定量分析结果(图７)显示,MwZFP１０在红花玉兰花被片、雌蕊、雄蕊、叶片和苞片中均有表达,而且其表达主要集中在雌蕊、叶片和苞片中,表明该基因可能参与了雌蕊、苞片和叶片的发育.

２．５　MwZFP１０转基因功能分析为了进一步分析MwZFP１０基因花发育的功能,构建了Mw并ZFP１０基因正义表达载体,将其转化拟南芥进行功能分析.经过抗生素(KaＧ

)筛选和P共获得６株３namcinCR鉴定后,５S∷y

其中６株拟南芥呈现出显MwZFP１０转基因植株,著的表型改变.图８显示,与野生型拟南芥相比,过表达Mw叶片卷ZFP１０基因拟南芥呈现植株矮小,缩并极度缩小;同时花序分枝减少,部分花瓣严重缩小,雄蕊数量减少甚至缺失,雌蕊膨大甚至增加至２).个,不能正常结实(图８

实时荧光定量PA．半定量PCR分析;B．CR分析

Fi．６　TertiartructurepredictionofMwZFP１０proteingys

图６　MwZFP１０蛋白三级结构预测

;A．ThesemiＧuantitCRanalsisB．QuantitativeqyPy

图７　MwZFP１０基因的组织表达模式分析

RealＧtimePCRanalsisy

Fi．７　TissueexressionprofileofMwZFP１０genegp

转基因拟南芥花器官;野生型拟南芥花器官;转基因拟南芥整体植株;野生型拟南芥整体植株A~C．D．E．F．

;;;A－CshowthefloraloransoftransenicplantDisthefloraloransofthewildＧteEistheplantofthetransenicgggypg

图８　转MwZFP１０基因和野生型拟南芥表型差异分析

FistheplantofthewildＧteyp

Fi．８　PhenoticdifferencesbetweenthepositivetransenicArabidosisandwildＧtegypgypp等:红花玉兰Mw８期　　　　　　　　　　　　　梁　爽,ZFP１０基因的克隆及功能分析１３９９

３　讨　论

器官的发育有密切关系.SUPERMAN类基因广泛参与花器官发育、植株生长、形态建成、激素

]２Ｇ４

.在S及逆境响应等过程[UPERMAN基因家族

花器官多样性是红花玉兰最具观赏价值的性

状,系统地开展红花玉兰花器官发育相关基因的研究并运用到育种生产实践中,对红花玉兰花型改良与种质创新具有重要的学术意义和应用价值.

中,除了T其他SAC１以及SAZ外,UPERMAN基因均会影响植物花器官的发育.功能分析显示,过表达Mw叶片卷ZFP１０基因拟南芥呈现植株矮小,缩并极度缩小;同时花序分枝减少,部分花瓣严重缩小,雄蕊数量减少甚至缺失,雌蕊膨大甚至增加至２个,不能正常结实,其表型变化与拟南芥SUP基因SUPERMAN类基因是C２H２家族中的一类

编码单锌指蛋白的基因,在植物花发育的过程中起重要作用,该蛋白的共同点是在其N端和C端分别

含有一个高度保守的结构域,分别是/IDLELRLG.不同来源的SUPERQMAALNG类GH和蛋白之间,除了这两个结构域及其附近的碱基序列高度保守之外,其他序列均呈现高度差异,因此它们的生理功能也表现出较大差异.本研究进行序列比对发现MwZFP１０蛋白含有的及其附近的碱基序列决定与目的基因结合过程中作GN端和.N端C端的保守基序SU:P的C２H２Ｇtyp

e(QQEAARLLMAGGGGN类蛋白特有HH和)锌I指DL结E构LR域Ｇ用,C端的富含亮氨酸的序列为反馈抑制区序列.半定量RTＧPCR分析显示MwZFP１０基因在雌蕊、苞片和叶片中呈现高表达,这表明该基因与花

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eＧ的过表达呈现高度相似.过表达拟南芥SUP基因,会导致拟南芥花瓣和雄蕊数量减少,雄蕊甚至全

部缺失,雌蕊数量增加[７]

.MwZFP１０在花器官的

雌蕊中表达较高而且过表达拟南芥的雌蕊发育异常出现２个雌蕊,这可能与MwZFP１０参与花发育过程中抑制细胞的分化有关,与SUPERMAN基因在拟南芥中心皮的形成的作用有一定的相似性.SUPERMAN类转录因子对植物花发育以及

植物的抗逆性产生影响,随着对不同物种的SUＧERMAN类基因的研究,其对于植物生长发育的机制也会更加清晰.

ontrollingflowerdevelop

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Arabidopsis(编辑:宋亚珍)