不规则抗体筛选和鉴定标准操作规程

1.检验目的

不规则抗体筛选和鉴定可在交叉配合之前进行或一起进行，这样有利于患者抗体的早期确认及鉴定，发现临床上有意义的抗体，避免一些可能的情况而造成病情的延误。 2.检验方法

分盐水介质法、抗球蛋白法和微柱凝胶法。 3.检验原理

让待检者的血清与已知血型的试剂红细胞即筛选红细胞（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ套）起反应，以发现在37℃中有反应活性的抗体。这种抗体可引起新生儿溶血病、溶血性输血反应、或使输入的红细胞存活期缩短等。当不规则抗体筛选试验阳性后，再进行不规则抗体鉴定，即利用谱红细胞（11套鉴定细胞）与待检者的血清反应，根据反应结果判断机体所产生的同种抗体类别。 4.标本要求

受检者不抗凝静脉血4.0ml，分离血清，48小时内使用 5.试剂

5.1.筛选红细胞：由2或3人份的O型红细胞组成为一套试剂，每套试剂筛选红细胞中至少有以下常见的抗原：D、C、E、c、e、M、N、S、s、P、Lea、Leb、K、k、Fya、Fyb、Jka、Jkb等。每次用3套试剂（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）进行抗体筛选，见表1005-1。

5.2.鉴定谱细胞：除包括常见的抗原以外还有：Cw、Kpa、Kpb、Jsa、Jsb、Lua、Lub、Xr/mina等。每次用11套试剂进行抗体鉴定，见表1005-2。 5.3.抗球蛋白试剂：多特异性抗球蛋白血清（IgG、C3d）。 5.4.致敏红细胞（质控细胞）。 5.5.0.9%生理盐水。 5.6.Coombs微柱凝胶卡。 6.器材

试管、吸管、37℃水浴箱、台式离心机、滤纸、微量加样器等。 7.操作程序

7.1.盐水介质法

7.1.1．取受检者血清2滴于标记有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的3支小试管中。 7.1.2．对应加入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ套2%～5%筛选红细胞生理盐水悬液1滴，37℃孵育30分钟。

7.1.3.以3000r/min离心10秒，观察凝集和溶血情况，并记录反应情况于表1005-1中。如果抗体筛选试验阳性，继续做以下试验。

表1005-1 红细胞血型筛选细胞反应格局表

序血型系 Rh-hr Kell Duffy FybKill JkaLewis P LeaMNSs Luth Lub 号 基因 D C E c e K k FyaJkbLebP1 M N S s Lua + + + Ⅰ R1R1 Ⅱ R2R2 Ⅲ R1r1 + + 0 0 + + + + + 0 + + 0 0 + + + + 0 + + 0 + + 0 + 0 0 + + + 0 0 + 0 0 0 + + + 0 + + + 0 0 + + + 0 0 0 + 0 0 + 0 试验结果（盐水法、抗球蛋白法、微柱凝胶法） Ⅰ R1R1 Ⅱ R2R2 Ⅲ R1r1 注：＋为阳性；0为阴性

7.1.4再取受检者血清2滴于标记有1～11的11支小试管中。

7.1.5.在11支小试管中分别加入11套2%～5%鉴定谱细胞生理盐水悬液1滴，37℃孵育30分钟。

7.1.6.以3000r/min离心10秒，观察凝集和溶血情况，并

将反应情况记录于表1005-2中表1005-2 红细胞血型谱细胞反应格局表 序血型系 Rh-hr Kell Duffy Kill JkbLewis P LeaMNSs Luth 号 基因 D C E c e K k FyaFyb JkaLeb P1 M N S s Lua Lub + + 0 + + + + + + + + 0 + 0 + 0 + 0 + + 0 + 0 0 + + + 1 2 3 R1wR1 R1R1 R2R2 + + 0 0 + 0 + + + + 0 0 + + + 0 + 0 + + 0 0 + + 0 + + + 0 0 0 0 0 4 5 6 7 8 9 r′r r〞r r r r r Ror r r 0 + 0 + + + + + 0 0 + + + 0 + + 0 0 0 + + + 0 + 0 0 0 + + 0 + 0 + 0 0 + + 0 + 0 0 0 0 + + 0 + + 0 0 0 + + + + 0 0 0 0 + + 0 + 0 + + 0 + 0 + + + + 0 0 0 + + 0 0 + + + + 0 0 + + 0 + 0 0 0 0 + 0 0 0 + + + + 0 0 + + + + 0 0 0 + 0 + + 0 + 0 + 0 + 0 0 + + 0 + 0 + + + 0 + 0 + + 0 + 0 0 + + 0 0 + 0 + + + + + + + + + + + + + + 10 r r 11 r r 结 果（盐水法、抗球蛋白法、微柱凝胶法） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 R1wR1 R1R1 R2R2 r′r r〞r r r r r Ror r r 10 r r 11 r r 注：＋为阳性；0为阴性；W为弱阳性 7.2抗球蛋白法

7.2.1.如果盐水法（1）～（3）抗体筛选试验阴性，继续做以下试验。 7.2.2.再振摇试管，使管底红细胞重新悬浮，用生理盐水洗涤3次。 7.2.3.最后一次洗涤后，弃去全部盐水，将试管边缘盐水用滤纸吸干。 7.2.4.立即加入多特异性抗球蛋白血清1滴，混匀。

7.2.5以3000r/min离心10秒，轻轻悬浮细胞，肉眼观察凝集和溶血情况，并用显微镜确证，记录结果于表1005-1中。

7.2.6.如果抗体筛选试验阳性，再取受检者血清2滴于标记有1～11的11

支小试管中。

7.2.7.在11支小试管中分别加入11套鉴定谱细胞悬液1滴和多特异性抗球蛋白血清1滴，37℃孵育30分钟。

7.2.8.以3000r/min离心10秒，观察凝集和溶血情况，并将反应情况记录于表1005-2中。

7.3.微柱凝胶法(强生卡)

7.3.1.在Coombs微柱凝胶卡上标记Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，分别加入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ套筛选红细胞40µl和被检血清40µl。

7.3.2.将Coombs微柱凝胶卡置于微柱凝胶孵育器内，孵育15分钟。 7.3.3.取出微柱凝胶卡观察结果，并记录于表1005-1中。

7.3.4.如果抗体筛选试验阳性，将11套鉴定谱细胞对应加入标记有1～11的微柱凝胶卡中各40µl。

7.3.5.然后，再各加入被检血清40µl。

7.3.6.重复操作7.3.2.和7.3.3，观察结果，并记录于表1005-2中。 8.结果判断

8.1.必须记录观察到的每个细胞样本的凝集强度或溶血现象。

8.2.盐水法和抗球蛋白法以±～＋＋＋＋为阳性凝集结果；微柱凝胶法中抗原抗体复合物浮在微柱凝胶卡表面或胶中，为阳性反应；沉于尖底部为阴性反应，见图1005-1。

图1005-1 微柱凝胶法结果判断

8.3.抗球蛋白法阴性无凝集，应加入致敏红细胞（质控细胞）1滴，混匀后以1000r/min离心15秒，观察结果，若凝集表示试验结果为阴性；若不凝集，

表示抗球蛋白血清可能失效，试验无意义。

8.4.盐水法和抗球蛋白法判断溶血和凝集的终点必须准确和前后一致，如果溶血和凝集都存在，离心后要立即观察上清液的情况，然后轻轻地把细胞摇散以观察凝集。

8.5.红细胞血型筛选细胞和谱细胞反应格局见表1005-1和1005-2。 9.注意事项

9.1.每种试验必须做自身对照，即待检者自身血清和自身红细胞反应，无凝集则试验有效；若有凝集则提示存在自身免疫抗体。

9.2.抗体筛选阳性后，要用生理盐水洗涤红细胞3次，离心后再观察结果，避免假阳性反应。

9.3.根据反应凝集强度±～＋＋＋＋记为阳性结果，表示待检者血清中有不规则抗体，结合谱细胞反应格局，确定抗体特性；无凝集表示待检者血清中无不规则抗体。

9.4.抗球蛋白法或微柱凝胶法出现凝集，而盐水法无凝集，则提示不规则抗体为IgG性质。

9.5.方法选择：盐水介质检测法和非盐水介质检测法，后者包括抗球蛋白法、聚凝胺法、酶法、低离子介质法、微柱凝胶法等，本试验运用盐水介质、抗球蛋白法和微柱凝胶法。