黄芩叶质量标准及起草说明

黄 芩 叶

Huangqinye

【来源】 本品为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥叶。夏季枝叶茂盛时采摘,或割取地上部分。将采下叶拣净茎枝，置蒸笼上蒸透,晒至半干时,搓揉使卷缩,再晒干。药材以身干、整齐、绿墨色,无茎枝者为佳。 【炮制】 取原药材，除去杂质及枝条。

【性状】 本品呈不规则条状或皱缩团状。绿黑色或黑色,叶片多破碎,完整叶先端钝或急尖,茎部圆形,全缘。气微香、味苦。

【鉴别】 （1）本品粉末呈黄绿色或灰绿色，非腺毛呈2～3细胞，细长，叶片表皮细胞及薄壁细胞散在。壁深波状，相互嵌合，直轴式气孔极多，非腺毛相对较少，上表皮细胞不规则形状，垂周壁波齿状，气孔较少；下表皮细胞不规则形，垂周，非腺毛细长众多，有2～3个细胞组成。

（2）取本品粉末0.1g，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取野黄芩苷对照品，加乙醇制成每lml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2020年版通则0502）试验，吸取上述两种溶液各1~2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲醇-甲酸-醋酸（4:2:7）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铁-1%铁溶液（1:4）与等量乙醇混合的溶液（临用新制），冷风吹干，立即检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

【检查】水分 不得过12.0%（中国药典2015年版通则0832第二法）。 总灰分 不得过9.0%（中国药典2015年版通则2302）。 杂质 不得过3.0%。（中国药典2015年版通则2301）。

【浸出物】 照醇溶性浸出物测定法（通则2201）项下的热浸法测定，用稀乙醇作溶剂，不得少于40.0%。

【含量测定】 照高效液相色谱法（中国药典2020年版四部通则0512）测定。

色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1%磷酸（38：62）为流动相，检测波长为335nm，柱温40℃。理论板数按野黄芩苷峰计算均应不低于3000。

对照品溶液的制备 取野黄芩苷对照品适量，精密称定，加60%乙醇制成每lml含40µg的溶液，即得。

供试品溶液的制备 取本品粉末（过二号筛）约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇50ml，密塞，称定重量，加热回流40分钟，放冷，再称定重量，用60%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5µl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品按干燥品计算，含野黄芩苷(C21H18O12)不得少于1.2%。 【性味】苦、寒。

【功能与主治】清利湿热。用于头晕目眩、目赤肿痛、咽干口渴。 【用法与用量】6～9g，或代茶饮。 【贮藏】置室内阴凉干燥处。

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黄芩叶质量标准草案起草说明

一、文献研究

（一）本草考证

《神农本草经》最早记载黄芩“生川谷”，而无植物产地及形态描述。苏颂《本草图经》中关于叶有载:“亦有独叶者，叶细长青色，两面相对。 ”《吴普本草》中有:“黄芩，二月生，赤黄叶，两两四四相值。”

《证类本草》引唐本草云：“黄芩叶细长，两叶相对，作丛生，亦有独茎者。”《图经本草》载：“苗长尺余，茎干粗如箸，叶从地四面作丛生，类紫草，高一尺许，亦有独茎者，叶细长青色，两两相对……”

《中国植物志》第65(2)卷（1977）描述黄芩叶:叶坚纸质，披针形至线状披针形，长1.5-4.5厘米，宽（0.3）0.5-1.2厘米，顶端钝，基部圆形，全缘，上面暗绿色，无毛或疏被贴生至开展的微柔毛，下面色较淡，无毛或沿中脉疏被微柔毛，密被下陷的腺点，侧脉4对，与中脉上面下陷下面凸出；叶柄短，长2毫米，腹凹背凸，被微柔毛。

（二）标准沿革

品种在历版炮制规范的收载情况，检验项目变化情况等。

黄芩叶最早收载于《北京市中药饮片炮制规范》1986年版。1985、1990、1995、2000、2005、2010、2015年版《中国药典》及《北京市中药饮片炮制规范》2008年版未收录。 二、标准研究情况

按照北京市炮制规范修订工作立项任务的要求，我单位对黄芩叶的质量标准进行了提高完善，增加了黄芩叶的显微鉴别、水分、总灰分、杂质和二氧化硫检查，还有含量测定。修订后的质量标准更完善，能更有效地控制黄芩叶的质量。现将标准起草工作情况说明如下： （一）仪器、对照物质与试剂：

高效液相色谱仪:LC-16,电热鼓风干燥箱:101-2A,箱式电阻炉：SX-4-10，电子天平：Practum224-1cn,生物显微镜：SMART。三用紫外分析仪WFH-203。

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野黄芩苷（批号批号110842-201709），由中国食品药品检定研究所提供， 试剂耗材：试剂均为分析纯。 （二）方法与结果 1、名称 黄芩叶 2、炮制

取原药材、除去杂质及枝条。 3、性状

3.1饮片收集情况 饮片信息见表1。 编号 品名 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

黄芩叶 黄芩叶 黄芩叶 黄芩叶 黄芩叶 黄芩叶 黄芩叶 黄芩叶 黄芩叶 黄芩叶 黄芩叶 黄芩叶 黄芩叶 黄芩叶 黄芩叶

来源

产地

批号

3

3.2性状描述

本品呈不规则条状或皱缩团状。绿黑色或黑色,叶片多破碎,完整叶先端钝或急尖,茎部圆形,全缘。气微香、味苦。

图1黄芩叶饮片图

1号样品（x x x x）

4

2号样品（x x x x）

3号样品（x x x x）

4号样品（x x x x）

5

5号样品（x x x x ）

4、鉴别 4.1显微鉴别 新增内容

照显微鉴别法（中国药典2015年版通则2001）测定黄芩叶粉末见图2。

图2黄芩叶粉末显微图

非腺毛 气孔

6

上表皮细胞 下表皮细胞

叶片薄壁细胞 叶片表皮细胞

7

4.2薄层鉴别 新增内容

按《中国药典》2015年版通则0502研究，薄层色谱图图3。

8

9

10

11

12

13

14

图3 黄芩叶薄层色谱图

5、【检查】水分、总灰分、杂质：为新增内容。

水分、总灰分

照水分测定法（中国药典2015年版通则0832第二法），总灰分测定法

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和酸不溶性灰分测定法（中国药典2015年版通则2302），二氧化硫残留量（中国药典2015年版通则2331）。

分别对黄芩叶进行了水分、总灰分、杂质、二氧化硫残留量的测定。结果见表2。

根据13批黄芩叶测定结果，参考中国药典收载的叶类药材的灰分数据，考虑到黄芩叶采收、处理过程中的难度，不同批次样品总灰分测定结果差异悬殊。

表2 黄芩叶水分、总灰分、杂质和二氧化硫残留量测定结果 样品 （批次）

6、【浸出物】以稀乙醇为溶剂热浸法测定浸出物，为新增内容。

照醇溶性浸出物测定法（中国药典2015年版四部通则2201）项下的热浸法测定，用乙醇作溶剂，结果见表3。 说明限度制订依据及暂定限度。

水分（%） 总灰分（%） 杂质（%）

二氧化硫残留量（mg/kg）

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根据《中国药典》浸出物项下的测定方法，采用热浸法，选择乙醇作为溶剂对黄芩叶浸出物进行测定，结果如下。

表3 浸出物测定结果

编号

浸出物测定 结果（%）

7、【含量测定】采用高效液相色谱法测定黄芩叶中野黄芩苷的含量，并进行方法学验证，为新增内容。

不得少于40.0%

实验部分

一、 样品收集情况

黄芩叶研究样品收集情况见表1。

表1 研究样品收集情况

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样品编号 样01 样02 样03 样04 样05 样06 样07 样08 样09 样10 样11 样12 样13

一、鉴别实验 1.试样与试剂：

企业名称 批号 对照品：野黄芩苷（批号110842-201709）纯度91.7%由中国药品生物制品检定所提供。

聚酰胺薄层板：国药集团化学试剂有限公司。 试剂：均为分析纯。 2. 实验与结果 2.1 显微鉴别： 显微鉴别图见图1。

2.2 黄芩叶中野黄芩苷的薄层色谱

为新增内容。按正文供试品溶液制备方法制备，展开及检视条件同正文。实验结果表明，薄层色谱斑点清晰，重现性好，故收入正文。耐用性考察低温和高湿环境中的色谱情况，结果较好。薄层色谱图及耐用性考察见图2。

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图2-1 黄芩叶中野黄芩苷的薄层色谱图（常温） （聚酰胺薄层板，温度：24℃ 相对相对湿度：40％） 1~7.样01~样07 8. 野黄芩苷对照品 9~14. 样08~样13

图2-2 黄芩叶中野黄芩苷的薄层色谱图（低温） （聚酰胺薄层板，温度：4℃ 相对相对湿度：50％） 1~7.样01~样07 8. 野黄芩苷对照品 9~14. 样08~样13

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图2-3 黄芩叶中野黄芩苷的薄层色谱图（高湿） （聚酰胺薄层板，温度：24℃ 相对相对湿度：75％） 1~7.样01~样07 8. 野黄芩苷对照品 9~14. 样08~样13

【含量测定】

1.样品、仪器与试剂、试药

仪器：岛津LC-20A高效液相色谱仪 色谱柱：

ZHY-584：COSMOSIL Packed Column 5C18-MS-Ⅱ，5μm，4.6mm×250mm ZHY-367：Phenomenex Luna C18，5μm，4.6mm×250mm ZHY-427：Waters XbridgeⓇ Shield RP18，5μm， 4.6mm×250mm ZHY-583：Agela Technologies Venusil MP C18，5μm， 4.6mm×250mm 对照品：野黄芩苷（批号110842-201709）纯度91.7%由中国药品生物制品检定所提供

试剂：甲醇、乙腈为色谱纯；磷酸、冰醋酸、甲酸为优级纯，其它试剂均为分析纯；水为超纯水。 2. 方法与结果

2.1 色谱分析条件的选择

在黄芩叶含量测定研究中，我们尝试采用多个不流动相比例，经过对甲醇、乙腈、甲酸、醋酸、乙酸等流动相的比较，采用COSMOSIL Packed Column 5C18-MS-Ⅱ，5μm，4.6mm×250mm，流动相：以甲醇- 0.1%磷酸溶液（38:62）为流动相，野黄芩苷紫外最大吸收为335nm，故确定检测波长为335nm。流速

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1.0ml/min；柱温：40℃。 2.1.1 流动相中磷酸浓度的比较

流动相中选用0.1%磷酸溶液、0.1%磷酸溶液、0.2%磷酸溶液、0.3%磷酸溶液、0.4%磷酸溶液进行比较，色谱图结果区别较小，故选择甲醇-0.1%磷酸溶液作为流动相，色谱图比较见图3-1。

图3-1 流动相中磷酸浓度的比较

2.1.1 柱温的比较

分别选择柱温30℃、35℃、40℃进行比较，色谱图结果40℃分离较好，野黄芩苷峰纯度较高，故选择柱温40℃，色谱图比较见图3-2。

图3-2 柱温的比较

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2.2 实验条件的选择

（1） 提取溶剂的选择 选用甲醇、90%甲醇、80％甲醇、70％甲醇、50％甲醇、30％甲醇、无水乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、稀乙醇、30％乙醇各50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，以相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。结果见表2。

表2 不同溶媒提取测定结果

溶剂

比例% 100 90 80 70 60 50 30 100 90 80 70 60 50 30

相对峰面积 4585360 8586500 9210444 11506106 123091 125362 12758087 峰形差 3536212 6201075 11032928 12871391 127616 12773048

1430000012300000103000008300000630000043000002300000300000甲醇

乙醇

根据以上测定结果，选择60％乙醇作为测定样品的提取溶剂。

（2） 提取方法及提取时间的选择 以60％乙醇为溶剂，提取方法分别采用超声提取10、20、30、40分钟、加热回流提取20、40、60、80、90分钟，放冷，60％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。依法测定峰面积，结果见表3。

表3 不同提取方法及提取时间测定结果

方法 时间min 相对峰面积

10 6267168 20 6312282

超声

30 45588 40 15766 20 6577770 40 6661511

回流

60 66367 90 6594762

22

670000066000006500000000006300000620000061000006000000

CS10CS20CS30CS40HL20HL40HL60HL90ME100ME090ME080ME070ME060ME050ME030ET100ET090ET080ET070ET060ET050ET030

根据以上测定结果，选择回流提取40分钟作为前处理方法。 2.3 黄芩叶中野黄芩苷的液相色谱图

按已考察的各项条件对黄芩叶中野黄芩苷进行色谱分离，与野黄芩苷对照品进行比较，黄芩叶供试品中相应色谱峰保留时间、紫外吸收图谱及峰纯度均与对照品相同。色谱图见图4。

图4-1 野黄芩苷对照品色谱图及紫外吸收、纯度图

图4-2 黄芩叶供试品色谱图及紫外吸收、纯度图

23

2.4 线性关系考察

称取野黄芩苷对照品22.06mg，置100ml量瓶中，加60%乙醇溶解并稀释至刻度，精密量取2ml置10ml量瓶中，加60%乙醇至刻度，摇匀，作为对照品溶液。分别精密量取对照品溶液1、3、5、7、10、15μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，野黄芩苷回归方程为：y = 3,791,656 x - 4,812，相关系数r=0.99999（n=6）。结果表明野黄芩苷在0.04046g～0.60687g范围内呈良好的线性关系，结果见表4，标准曲线图见图5。

表4 野黄芩苷线性关系考察

进样量（μg） 0.04046 0.12137 0.20229 0.28321 0.40458 0.60687

峰面积

150717 456960 760309 1065069 1529608 22979

250000020000001500000100000050000000.000000.100000.200000.300000.400000.500000.600000.70000y = 3,791,656 x -4,812 R² = 0.99999 图5 野黄芩苷标准曲线图

2.5 稳定性试验

取按上述方法进行制备的供试品溶液（样10），分别于配制后0、4、8、12、20、24小时，依法测定峰面积，结果表明，供试品溶液在24小时内基本稳定。野黄芩苷RSD 为0.37%（n=7）。结果见表5。

表5 溶液稳定性试验结果

（h） 峰面积

0 709087

4 715320

8 711433

12 714143

16 715271

20 714666

24 716713

平均 713805

RSD（%）

0.37

2.6 重复性试验

按正文方法，取同一批样品（样09），平行制备6份进行测定，结果见表6。

表6 重复性试验结果（mg/g）

24

1 2 3 4 5 6 平均 RSD（%）

1.23

野黄芩苷 18.14 18.18 18.17 18.30 18.71 18.11 18.27

2.7 准确度试验与范围的确定

采用加样回收法，精密称取已知含量的同一批样品（样09，野黄芩苷含量为18.27mg/g）①取约0.05g精密加入对照品溶液（含野黄芩苷0.01011mg/ml）50ml；②取约0.05g精密加入对照品溶液（含野黄芩苷0.02022mg/ml）50ml；③取约0.05g精密加入对照品溶液（含野黄芩苷0.04044mg/ml）50ml，照【含量测定】项下操作，各平行制备3份，依法测定，结果表明本方法具有良好的准确度，数据见表7。

表7 加样回收试验

峰面积 537638

530943 532595 7238 7166 727810 1107269 1110830 1109694

取样量 测得总量 加入量 样品含量 回收率 (mg) (mg) (mg) (mg) (%) 50.24 50.11 49.99 50.60 50. 50.70 50.16 50.55 50.40

1.4341 1.4162 1.4206 1.9443 1.9115 1.9413 2.9535 2.9630 2.9599

0.5057

0.9178 0.91 0.9132 0.9244 0.9233 0.9262 0.9163 0.9234 0.9207

平均 (%)

RSD (%)

1.0115

2.0230

102.087 99.026 100.331 100.842

97.709 100.30 1.25 100.3 100.704 100.821 100.807

通过以上范围考察试验，结果表明样品中野黄芩苷含量在28.324mg/g～59.26mg/g的范围内，测定结果准确性较好。 2.8 样品测定

照上述前处理方法及色谱条件处理其他样品，测定其他样品共13批，结果见表9及图15。

表8 样品中野黄芩苷含量测定结果

批号 野黄芩苷（%） 样01 2.28 样02 2.29 样03 1.52 样04 1.55 样05 1.55 样06 1.56 样07 1.96

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样08 样09 样10 样11 样12 样13 2.16 1.93 3.18 3.19 3.05 3.13

根据以上13批次样品的测定结果，暂定本品按干燥品计算，含野黄芩苷(C21H18O12)不得少于1.2%。 2.9 耐用性考察

采用样09的供试品溶液，按正文色谱条件，分别采用三种不同品牌的色谱柱，测定野黄芩苷的含量，结果RSD为0.57%，耐用性较好。结果数据见表13，耐用性考察色谱图见图6。

耐用性考察所用色谱柱分别为：

ZHY-367：Phenomenex Luna C18，5μm，4.6mm×250mm ZHY-427：Waters XbridgeⓇ Shield RP18，5μm， 4.6mm×250mm ZHY-583：Agela Technologies Venusil MP C18，5μm， 4.6mm×250mm

表9 野黄芩苷含量测定耐用性考察结果 柱号 ZHY-584 ZHY-367 ZHY-427 ZHY-583

uV数据1:Z15005H367D7.lcd 检测器A:335nm80000数据2:Z15005H367Y1.lcd 检测器A:335nm750007000065000600005500050000450004000035000300002500020000150001000050000-5000-10000含量（mg/g） 平均（mg/g） RSD（%） 18.268 18.320 18.082 18.255

18.23

0.57

0.02.55.07.510.012.515.017.520.022.525.027.530.032.5min

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图6-1 色谱柱ZHY-367黄芩叶供试品与野黄芩苷对照品色谱图

8500080000750007000065000600005500050000450004000035000300002500020000150001000050000uV数据1:Z15005H422D7.lcd 检测器A:335nm数据2:Z15005H422Y1.lcd 检测器A:335nm0.02.55.07.510.012.515.017.520.022.525.027.530.032.5min

图6-2 色谱柱ZHY-427黄芩叶供试品与野黄芩苷对照品色谱图

uV数据1:Z15005H583D7.lcd 检测器A:335nm90000数据2:Z15005H583Y1.lcd 检测器A:335nm85000800007500070000650006000055000500004500040000350003000025000200001500010000500000.02.55.07.510.012.515.017.520.022.525.027.530.032.5min

图6-3 色谱柱ZHY-583黄芩叶供试品与野黄芩苷对照品色谱图 以上结果表明，测定结果基本不受影响，所建立的野黄芩苷含量测定方法可用于日常检验。

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