薄膜过滤法

复方氨林巴比妥注射液 无菌检查方法学验证

山东圣鲁制药有限公司

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无菌检查方法学验证

一、 验证目的

根据《中国药典》2010年版要求，在建立无菌检查法时，需要进

行验证，为保证产品质量，根据药典要求对复方氨林巴比妥注射液无菌检查法进行验证。通过验证，证明所采用的方法适合于该无菌检查. 二、 试验所用的主要仪器及设备 序号 1 2 3 4 仪器名称 集菌仪 LRH—250生化培养箱 电热恒温培养箱 净化工作台 生产单位 杭州盈天科学仪器有限公司 上海实验仪器厂有限公司 上海锦屏仪器仪表有限公司通州分公司 吴江市绿叶空调净化有限公司 三、 验证

1、 测试环境条件

所有检查在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域隔离系统中进行，其全过程严格遵守无菌操作，能防止微生物污染。单向流空气区、工作台面及环境已定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证，符合要求。

2、 培养基的适用性试验

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无菌性检查 每批培养基随机取5支，培养14天，应无菌生长

结果见下表 培养基 培养天数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 硫乙醇酸盐流体培养基（30—35℃） 1 2 3 4 5 － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － 改良马丁培养基（23—28℃） 1 2 3 4 5 － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － － 结果符合规定。 2．2灵敏度检查 2．2．1 菌种及来源 检验用的培养基菌种以及试剂

名称及代号 金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26 003］ 山东省药检所 铜绿假单胞菌［CMCC（B）10 104］ 生孢梭菌［CMCC（B） 941］ 枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63 501］ 白色念珠菌［CMCC（F）98 001］ 山东省药检所 山东省药检所 山东省药检所 山东省药检所 来源 批号 第3代 第3代 第3代 第3代 第3代 精品文档，欢迎下载

可编辑 黑曲霉［CMCC（F）98 003］ 硫乙醇酸盐流体培养基 改良马丁培养基 营养琼脂 山东省药检所 青岛骏科生物有限公司 北京三药科技开发公司 北京三药科技开发公司 第3代 100208 100308 100312 2．2．2硫乙醇酸盐流体培养基灵敏度检查 菌液制备

菌种制备 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌 硫乙醇酸盐 流体培养基 营养琼脂 培养基 30℃—35℃ 24小时 培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每ml含菌数小于100cfu的菌悬液 50 50 接种至 培养温度 培养时间 菌悬液制备 菌悬液菌 落数 40 60 培养基的接种

接种菌液管 培养天数 1 2 3 结论 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌 1 + + + 2 + + + 1 + + + 2 + + + 1 + + + 符合规定 2 + + + 1 + + + 2 + + + 空白对照 - - - 2．2．3改良马丁培养基灵敏度检查 菌液制备

菌种 名称 白色念珠菌 精品文档，欢迎下载

接种至 培养温度 培养时间 菌悬液制备 培养物用0.9%无菌 菌悬液菌落数 改良马丁培养基 23℃—28℃ 36小时 氯化钠溶液制成每ml含菌数小于100cfu的菌悬液 30 可编辑 加3-5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液黑曲霉 改良马丁琼脂斜面培养基 23℃—28℃ 5天 至无菌试管内，0.9%无菌化钠溶液制成每ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。 20

培养基的接种

接种菌液管 培养天数 1 2 3 4 5 结论 1 + + + + + 白色念珠菌 2 + + + + + 1 + + + + + 符合规定 黑曲霉 2 + + + + + 空白对照 - - - - - 2．2．4结果 空白对照管无菌生长，加菌的培养基管均生长良好，该培养基的 灵敏度检查符合规定。 四、方法学验证试验

薄膜过滤法 将 1004041 1004042 1004051 三批样品30支，作为供试品，按薄膜法过滤，用冲洗液冲洗三次，每次100ml，在最后一次的冲洗液中加入配制好的试验菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐培养基改良马丁培养基中，另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照，按规定温度培养。接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢菌、生孢梭菌培养管，在30—35℃培养5天。接种白色念珠菌、黑曲霉培养管，在23—28℃培养5天。

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方法学验证检测结果

培养基 培养天数 1 2 3 4 5 硫乙醇酸盐流体培养基 金黄色葡萄球菌 供试品 对照 铜绿假单胞菌 供试品 对照 枯草芽孢杆菌 供试品 对照 生孢梭菌 供试品 对照 均有少量菌落生长 均有少量菌落生长 均有少量菌落生长 均有少量菌落生长 均有少量菌落生长 菌落均生长良好 菌落均生长良好 菌落均生长良好 菌落均生长良好 培养基 培养天数 1 2 3 4 5 白色念珠菌 供试品 对照 供试品 菌落均生长良好 菌落均生长良好 菌落均生长良好 菌落均生长良好 菌落均生长良好 菌落均生长良好 菌落均生长良好 菌落均生长良好 菌落均生长良好 菌落均生长良好 菌落均生长良好 改良马丁培养基 黑曲霉 对照 均有少量菌落生成 菌落均生长良好 菌落均生长良好 菌落均生长良好 菌落均生长良好 菌落均生长良好 菌落均生长良好 菌落均生长良好 菌落均生长良好 菌落均生长良好

结论：上述试验表明，该供试品在该检查量和检查条件下无抑菌作用，该品种

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可在此条件下进行无菌检测。

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五、供试品无菌检查 取稳定性考察的复方氨林巴比妥样品，批号为： 1004041 1004042 1004051各20支，按《中国药典》2010年版进行薄膜过滤法检查，阳性对照管按规定的温度培养菌48—72小时内应正常生长、阴性对照管、供试品管按规定的温度培养14天均为澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定。经检测三批样品均符合规定。

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