一种酿酒酵母菌在白酒生产中的强化应用

DOI：10.13746/j.njkj.2019214

一种酿酒酵母菌在白酒生产中的强化应用

22

何宏魁1，，李冬冬1，刘国英1，，李晓欢1，李

2

兰1，曹润洁1，李安军1，

（1.安徽古井贡酒股份有限公司，安徽亳州236820；2.安徽省固态发酵工程技术研究中心，安徽亳州236820）

摘

要：从大曲中分离得到1株酵母菌。经分子鉴定该菌为酿酒酵母，通过对该菌株的发酵代谢产物

进行分析，结果表明，该菌株的主要代谢产物为乙醇，其含量占代谢产物总量的40.24%，同时也代谢出较多的3-甲基丁醇、辛酸乙酯等香气成分。将该酵母菌制备成酵母曲应用于白酒的生产中，可以提高白酒的出酒率，提升白酒品质。

关键词：酿酒酵母；代谢产物；酵母曲；酿酒中图分类号：TS262.3；TS261.1

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2019）12-0093-05

EnhancedApplicationofSaccharomycescerevisiae

intheProductionofBaijiu

HEHongkui1,2,LIDongdong1,LIUGuoying1,2,LIXiaohuan1,LILan1,CAORunjie1andLIAnjun1,2

(1.GujingGongjiuCo.Ltd.,Bozhou,Anhui236820;2.AnhuiEngineeringResearch

CenterofSolid-stateBrewing,Bozhou,Anhui236820,China)

Abstract:InthisstudyweisolatedayeaststrainfromDaqu.ThestrainwasidentifiedasSaccharomycescerevisiaebymolecularidentification.Themetabolitesofthestrainwereanalyzed.Theresultsshowedthatthemainmetaboliteofthestrainwasethanol,ac-countingfor40.24%ofallthemetabolites.Italsoproducedvariousaromacomponents,suchas3-methylbutanolandethyloctano-ate.TheyeaststarterpreparedbythisstrainwasusedinBaijiuproduction,andtheliquoryieldandliquorqualitygotimproved.(Trans.byHUANGXiaoli)

Keywords:Saccharomycescerevisiae;metabolites;yeaststarter;liquor-making

酿酒微生物在白酒生产过程中起着极其重要的作用，从大曲的生产到窖池发酵，都有酿酒微生物的参与，其中酵母菌作为主要的酿酒微生物之一存在于大曲中[1]，在白酒酿酒过程中起着至关重要的作用。随着现代生物工程技术的发展，功能性酵母菌逐渐被发现，如酿酒酵母(Saccharomyces)、假丝酵母(Candida)、接合酵母(Zygosaccaromyces)、伊萨酵母(Issatchonkia)、扣囊复膜酵母（Saccharo-mycopsisfibuligera）和异常毕赤酵母（Pichiaanom-ala）、柠檬形接合酵母(Zygosaccaromycescidrci)、东方伊萨酵母(Issatchonkiaorientalis)、毕赤酵母(Pich-收稿日期：2019-04-28

iaburtonii)、汉逊酵母(Hanseniaspora)[2-6]等。这些酵母分别起着酿酒和生香的作用。

以从安徽古井贡酒桃花曲中分离出的1株酿酒酵母菌为研究对象，分析菌株生长代谢特征，探究在白酒发酵过程中添加强化此菌株对白酒生产带来的影响。11.1

材料与方法材料、试剂及仪器

菌株：从古井桃花曲中分离出的1株酵母菌。试剂：酵母菌基因组DNA提取试剂盒（天根）、Taq酶（生工）。

作者简介：何宏魁，男，硕士，高级工程师，副主任，主要从事酿酒微生物、酿酒工艺等研究和科研项目管理。通讯作者：李安军，男，硕士，正高级工程师，安徽古井贡酒股份有限公司总工程师。

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仪器设备：SX-70高压灭菌锅，IMH400-S生化培养箱、MaxQ485HP振荡培养箱、PCR仪、Water-sI-Class/XevoTQD气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）、Agilent60A气相色谱。1.2

试验用培养基

YPD培养基：葡萄糖20g，胰蛋白胨20g，酵母膏10g，蒸馏水1000mL，pH5.0～5.5，115℃灭菌20min。

液态发酵培养基：糖度为12Bx的高粱糖化液。

固态培养基：新鲜干燥的麸皮、玉米粉。孟加拉红培养基（成品），121℃灭菌30min。1.3试验方法1.3.1

分子生物学鉴定

根据酵母菌分类学研究标准方法做分子鉴定。酵母核基因组的提取使用酵母基因组DNA提取试剂盒，按照说明书操作。

使用引物NL1和NL4进行26SrDNAD1/D2区的扩增。PCR反应体系（50μL）：50mg/L模板2μL，10μmol/L上下游引物各1μL，dNTP5μL，buffer5μL，Taq酶0.5μL，最后添加ddH2O定容50μL。反应条件：94℃/3min；94℃/1min，55℃/1min，72℃/1min，30个循环；72℃/10min。PCR产物北京擎科新业生物技术有限公司测序，测序结果在NCBI的Genbank数据库中进行比对。1.3.2

酵母发酵的制备

将菌株接种到孟加拉红固体培养基上，28℃培养2～3d活化；然后用接种环将活化后的菌株转接到20mLYPD培养基的三角瓶中，于28℃120r/min培养24h；取酵母菌种子液接种到装有250mL高粱发酵培养基的三角瓶中，装液量10mL，在120r/min，28℃条件下摇床培养72h。1.3.3

发酵代谢产物分析

（1）气相色谱分析条件

分流进样，分流比60∶1，进样口温度：230℃；升温程序：35℃保持3min，然后以5℃/min程序升温至100℃，不保持，再以10℃/min升温至195℃，保持18min。

（2）气相质谱联用仪分析条件进样不分流，流速0.9mL/min；进样口温度：230℃；升温程序：35℃保持4min；以2℃/min升温到60℃不保持，以6℃/min升温到180℃保持15min。1.3.4

酵母曲的制备及其理化分析

（1）酵母曲的制备

将试管中的酵母菌接种到装有250mL的YPD液体培养基中，28℃、120r/min摇床培养48h。然后将培养好的种子液转接到3LYPD液体培养基，28℃、120r/min摇床培养48h。最后转接到固态培养基（麸皮与水1∶1，高压灭菌处理），品温控制在30℃，培养36h。

（2）酵母曲理化分析

菌落数测定：根据国家标准GB47.2—2010。发酵力测定：参考企业标准QJ/GJ08.01—2017。1.3.5

酵母曲强化发酵酿酒试验

根据实际情况，制定酿酒试验方案，实验共20个窖池（实验组10个，对照组10个）。

实验一：实验组大米查一加1kg酿酒酵母曲强化发酵；对照班组按照正常工艺操作，不添加酵母曲。

实验二：实验组大米查一、大米查二各加1kg酿酒酵母曲强化发酵；对照班组按照正常工艺操作，不添加酵母曲。2结果与分析2.1

发酵代谢产物分析

将酵母菌发酵液代谢的挥发性产物采用顶空气相色谱与质谱联用（HS-SPME-GC-MS）技术进行分析，其总离子流图谱如图1所示，代谢产物分析结果见表1。

图1

酵母液态发酵产物HS-SPME-GC-MS

分析总离子流图

何宏魁，李冬冬，刘国英，李晓欢，李

表1

峰号1

2345671011121314151617181920212223242526272829303132333435363738394041424344474849

保留时间(min)6.5358.67515.33315.71221.19224.5726.27.28427.48228.08228.34828.129.05329.35729.4829.81829.88130.60930.63530.97631.37731.51632.07432.63332.71932.86533.06833.13934.16234.51534.66834.75834.9835.78535.93536.36736.66337.01937.80238.37638.85239.539.84239.9240.723.76344.805.93747.729

面积2385053131248615174062025343943614501627516234521401115313158327820061661305062093380096612026153180010557752480265017347627131438635739245266843210234529097102383816594236377200015182342015238123383222129246527566851942801021228067447239445034279918439419441810213813762228477062001110047361006747115

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酵母菌液态发酵产物HS-SPME-GC-MS分析结果

百分比含量(%)

0.6040.240.390.5119.0.410.060.103.880.150.510.030.530.100.030.130.270.060.130.190.040.151.330.050.130.260.420.110.050.460.040.060.061.180.170.670.070.2015.330.090.050.050.260.102.150.160.250.251.19

物质名称

乙酸乙酯乙醇

2-甲基丙醇

乙酸-3-甲基丁酯3-甲基丁醇庚酸乙酯己酸丁酯三甲基吡嗪辛酸乙酯

己酸-3-甲基丁酯乙酸

2,3-二甲基-5-乙基吡嗪四甲基吡嗪

2,4-二烯基己酸乙酯1-(2-呋喃基)-乙酮苯醛

壬酸乙酯2,3-丁二醇辛醇

2-甲基丙酸2,3-丁二醇己酸己酯己酸乙酯

4-烯基癸酸乙酯苯甲酸糠醛

2-甲基十一酸9-烯基癸酸乙酯3-甲硫基丙醇甲氧基苯基丙酮环十烷

3,7-二甲基-6-烯基辛醇2-甲基-2-十二醇乙酸苯乙酯十二酸乙酯己酸

2-甲氧基苯酚苯丙酸乙酯苯乙醇庚酸

苯并噻脞苯酚

3,7,11-三甲基-1,6,10-三烯基-3-十二醇十四酸乙酯辛酸壬酸

2-甲氧基-4-乙烯基苯酚棕榈酸乙酯癸酸

匹配度(%)

958856749098728790728190919683959886804774909695609550439591809850839590969493867091959196919598

由表1可以看出，该酿酒菌株发酵产物中，主要代谢产物是乙醇，代谢比例占40.24%，是白酒的

主体成分。其次代谢19.%的3-甲基丁醇和15.33%的苯乙醇。3-甲基丁醇和苯乙醇均是白酒

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中重要的风味成分。其中3-甲基丁醇具有果香，可以增加酒体的醇甜感，让酒体更丰满[7]；苯乙醇是米香型白酒的主体香味成分之一[8]。该酵母菌株还代谢出其他挥发性香味物质，如辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、辛酸等，这些香气成分，在白酒香气形成中扮演着重要角色。在浓香型白酒的主体香味成分中，辛酸乙酯的绝对含量并不高，但其香气强度贡献值比传统观点认为的四大酯中的乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯均要大，仅次于己酸乙酯，呈现较强的果香味。2.2

分子生物学鉴定结果

测序得到的26SrDNA基因序列，保留其可靠的587bp序列进行系统发育分析。序列如下：CCCCGGGCATGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAAACACG-GACCAAAAAGTTAAA

通过NCBI的BLAST比对，该菌株的序列与酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）的序列相似性为100%。2.3

酵母曲理化分析

该酵母菌株制备的酵母曲，每1g绝干功能曲中，酵母菌数量为8.1×108～11.6×108cfu。同时对酿酒功能曲进行发酵力检测，将其曲浸出液稀释

1000倍后，发酵力依然为213.6g/100g·72h。2.4

酵母曲强化发酵酿酒试验

根据实验方案，对实验组和对照组窖池升温情况进行测量对比，结果如图2所示。

图2酿酒实验组和对照组窖池温度变化

由图2可以看出，从窖池温度变化曲线来看，符合浓香型白酒发酵温度变化规律。实验组较对照组相比，实验组升温较快，顶温高出1～2℃，且中挺时间长2d左右，到缓落时期，实验组温度下降相对较慢。

根据试验方案，对实验组和对照组对应窖池出酒率进行统计和分析，结果如图3所示。

图3实验组与对照组出酒率、名酒率对比

由图3可以看出，实验一组与对照一组相比较，出酒率提高了1.67%，名酒率提高了0.%；实验二组与对照二组相比较，出酒率提高了2.31%，名酒率提高了0.62%；实验二组与实验一组相比较，其出酒率较实验一略高，名酒率无差异。

对酒样进行气相分析，统计结果如图4所示。由图4可知，实验组的酒样中己酸乙酯、乙缩醛、己酸、总酸含量均高于对照组，而乙酸乙酯、乳

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将酿酒酵母制备成曲后，发酵力明显强于大曲，并且具有一定的酯化力。将此酵母曲与大曲共同混合组配，用于酿酒生产，发现添加酿酒曲后，窖池的升温较快，并且顶温要比对照组高出1～2℃，且整个发酵过程中试验组的酒醅升温都略高于对照组。试验组的出酒率也高于对照组2%左右。实验组的酒样中己酸乙酯、乙缩醛、己酸、总酸含量均高于对照组；乙缩醛是浓香型白酒老熟和质量的

图4

实验组与对照酒样成分含量

重要标志之一，也是有别于低档酒的指标之一[9]；而乙酸乙酯、乳酸乙酯含量低于对照组，尤其是乳酸乙酯降低明显；各组实验之间相比较，实验二总酯含量最高。可见，添加了本株功能酿酒酵母菌株可以起到“增己降乳”的作用，使酒体酯类比例更协调，进一步提高了基酒的品质。参考文献：

酸乙酯含量低于对照组，尤其是乳酸乙酯降低明显，两个实验组的乳酸乙酯分别降低了19.3%、21.4%；各组实验之间相比较，实验二总酯含量最高为832.5mg/100mL。

取本次实验混合酒样进行专业品评，结果如表2所示。

表2

对照

酒样实验酒样排序

酿酒实验混合酒样品评结果

评语

窖香浓郁,味较净窖香浓郁,协调爽净

窖香浓郁,醇香舒适,香味协调窖香浓郁,醇香舒适,余味悠长

酒样编号详细方案

1实验一3实验二2实验一4实验二4＞2＞3＞1

[1][2][3]

汤有宏.高温曲中酵母菌的分离及耐热性研究[J].酿酒,2012,39(5)：35-37.

赵爽,杨春霞,徐曼,等.浓香型白酒生产中酿酒微生物研究进展[J].食品与发酵科技,2012,48(1)：24-29.周庆伍,汤斌,李安军.基于纯种分离技术对古井贡酒桃花曲微生物进行分离鉴定的研究[J].酿酒科技,2016(3)：37-41.

由表2可知，添加优良酿酒酵母曲的实验方案一和方案二的酒样较对照组酒样，酒质更优，且实验方案二的酒样优于实验方案一酒样。3

讨论

利用分子鉴定技术对古井桃花曲中1株酵母菌进行鉴定，该菌株为酿酒酵母(Saccharomyces)。对其发酵代谢产物进行分析结果表明，该酵母菌发酵产生多种挥发性风味物质，本次共检测出49种挥发性风味物质，主要包括醇类、酯类、酚类、酸类等。其中醇类物质含有10种，相对含量高达76.51%，尤其是乙醇、3-甲基丁醇、苯乙醇，相对含量为75.46%。

[4][5][6][7]

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洋河股份2019年前三季净利71亿元

本刊讯：据《中国白酒网》报道，江苏洋河股份(002304)10月29日晚间披露三季报，公司2019年前三季度实现营收210.98亿元，同比增长0.63%；净利润71.46亿元，同比增长1.53%；每股收益4.74元。其中，第三季度净利润15.65亿元，同比下滑23.07%。（江源荐，黄筱鹂编辑）

来源：中国白酒网

2019-10-29