*CN102353778A*
(10)申请公布号 CN 102353778 A(43)申请公布日 2012.02.15
(12)发明专利申请
(21)申请号 201110189010.0(22)申请日 2011.07.07
(71)申请人贵州大学
地址550025 贵州省贵阳市贵州大学花溪北
校区科技处(72)发明人王开功 陈军义 程振涛 文明
周碧君 方英(74)专利代理机构贵阳中新专利商标事务所
52100
代理人吴无惧(51)Int.Cl.
G01N 33/569(2006.01)G01N 33/531(2006.01)
权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页
(54)发明名称
一种基于PRRSV GP5蛋白的iELISA试剂盒及制备方法(57)摘要
本发明公开了一种基于PRRSVGP5蛋白的iELISA试剂盒及制备方法，其组成包括：重组蛋白包被50~200μL、包被缓冲液25mL-40mL、酶标二抗300-500μL、1×PBST缓冲液800mL-1000mL、阳性对照1mL、阴性对照1mL、封闭缓冲液25mL-40mL、底物液A10mL-15mL、底物液B10mL-15mL和终止液10mL-15mL。本发明能监测猪血清PRRSVGP5蛋白抗体，将为PRRS疫苗免疫效果的评价，提供一种更加客观和有效的指标，减少了生产中PRRS疫苗免疫的盲目性，为PRRS的免疫防控提供技术支撑。CN 102353778 ACN 102353778 ACN 102353785 A
权 利 要 求 书
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1.一种基于PRRSV GP5蛋白的iELISA试剂盒，其特征在于：其组成包括：重组蛋白包被50~200μL、包被缓冲液25mL-40mL、酶标二抗300-500μL、1×PBST缓冲液800mL-1000mL、阳性对照1mL、阴性对照1mL、封闭缓冲液25mL-40mL、底物液A10mL-15mL、底物液B10mL-15mL和终止液10mL-15mL。
2.根据权利要求1所述一种基于PRRSV GP5蛋白的iELISA试剂盒，其特征在于：所述的重组蛋白包被为重组蛋白使用包被缓冲液稀释为1.8 mg/100μL ~3 mg/100μL；重组蛋白为PRRSV GP5基因通过大肠杆菌BL21（DE3）表达系统获得GP5蛋白，并通过His·Bind Purification Kit进行重组蛋白纯化，经SDS-PAGE分析后得到纯化目的蛋白；包被缓冲液为：Na2CO3 1.59 g、NaHCO3 2.93 g溶于去离子水中，定容至1000 mL，调至 p H 9.5～9.8。
3.根据权利要求1所述一种基于PRRSV GP5 蛋白的iELISA试剂盒，其特征在于：所述的酶标二抗为：羊抗猪IgG-HRP。
4.根据权利要求1所述一种基于PRRSV GP5蛋白的iELISA试剂盒，其特征在于：所述的1×PBST缓冲液为： NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g、KH2PO4 0.2 g、Na2HPO4·12H2O 2.9 g和Tween-20 0.5 mL溶于800 mL蒸馏水，调整pH为7.2～7.6，定容至1000 mL。
5.根据权利要求1所述一种基于PRRSV GP5蛋白的iELISA试剂盒，其特征在于：所述的阳性对照为通过PRRS分离毒临床感染猪获得的高免血清，使用时用血清稀释液按1:10～1:200倍稀释；所述的阴性对照为未感染且未免PRRS疫苗的猪血清，稀释度为1:10～1:200。
6.根据权利要求1所述一种基于PRRSV GP5 蛋白的iELISA试剂盒，其特征在于：所述的封闭缓冲液为：BSA0.3 g（0.1～0.5 g）溶于100 mL PBST缓冲液；所述底物液A为：Na2HPO4 14.60 g、柠檬酸 9.33 g和过氧化氢脲 0.52 g，溶于三蒸水，并定容至1000 mL，调至 p H 5.0～5.4；所述底物液B为：TMB 20mg和无水乙醇10 mL，加双蒸水至1 000 mL，过滤除菌，无菌分装。
7.根据权利要求1所述一种基于PRRSV GP5 蛋白的iELISA试剂盒，其特征在于：所述的终止液为：0.2 %～0.3% HF溶液。
8.如权利要求1-7任一项所述的一种基于PRRSV GP5 蛋白的iELISA试剂盒的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：
原核表达系统表达融合蛋白His-dGP5，并经His·Bind Purification Kit纯化得到融合蛋白，应用SDS-PAGE和Western-blotting分析其纯化效果及反应原性；
第二，步骤一的纯化融合蛋白His-dGP5作为包被抗原，进行抗原包被液浓度、抗原包被条件、封闭液、血清稀释度、封闭时间、酶标二抗稀释浓度和显色反应时间iELISA的条件的优化；
第三，取40份已知PRRS抗体阴性的猪血清，按步骤二确定的最佳反应条件，进行iELISA反应；样本OD630值≥阴性样本OD630值的平均值（X）+3（标准差），可在99%的水平上判为阳性，当样本OD630值＜阴性样本OD630值的平均值（X）+3（标准差）时，判为阴性。
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说 明 书
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一种基于PRRSV GP5蛋白的iELISA试剂盒及制备方法
技术领域
[0001]
本发明涉及一种基于PRRSV GP5 蛋白的iELISA试剂盒及制备方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起的猪的一种高度传染性疾病。自2006年我国爆发了由PRRSV变异株引起的高致病性猪繁殖与呼吸综合征（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome, HP-PRRS），其与经典猪繁殖与呼吸综合征相比，主要表现为：发病猪持续高温41℃以上；各年龄段猪均可出现急性死亡；母猪流产率可达30%以上；仔猪表现为发病率高达100%，死亡率高达50%以上。我国农业部于2008年底将其列为一类动物传染病。
[0003] 目前国内对PRRS的防控主要采取疫苗免疫为主，使猪群产生免疫抗体以抵御PRRS侵袭，降低养猪场的风险。而当前部分猪场在免疫PRRS疫苗后，猪群仍有PRRS发生。因此能合理客观及时评估猪场PRRS疫苗免疫效果，为猪群PRRS防控提供科学依据显得尤为重要。PRRS疫苗免疫机体后产生中和抗体及非中和抗体，其中中和抗体能够与病毒表面的抗原结合，从而阻止该病毒黏附机体靶细胞受体。故猪体内始终保持一定水平的PRRSV中和抗体，对于维持猪群健康具有重要意义。目前已经证明PRRSV结构蛋白中可以产生特异性中和抗体的有GP3、GP4和GP5蛋白，M蛋白也可能产生中和抗体，其中GP5蛋白被公认为是机体产生保护性体液免疫的主要蛋白。
[0004] 通过对国内市场使用的PRRS血清抗体检测试剂盒调查显示，主要有PRRS全病毒蛋白和N蛋白为抗原包被的ELISA检测试剂盒。前者可检测PRRSV的各种抗体水平，能够全面体现PRRSV抗体总水平；后者则检测PRRSV N蛋白的抗体，可以体现早期抗体及主要结构蛋白N抗体水平，但是均不能有效说明机体内特异性中和抗体水平，不能客观地体现机体抵抗病毒的能力和疫苗免疫效果。因此有必要开发出一种能检测PRRSV GP5蛋白产生的特异性抗体的商品化试剂盒。
[0002]
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，选取核苷酸同源性较高的HP PRRSV GZJL株，通过
PRRSV GP5基因原核表达载体的构建与表达，建立基于表达产物PRRSV GP5蛋白的iELISA方法，并进行条件优化，以便制备成商品化iELISA试剂盒。该iELISA试剂盒的发明，将为PRRS疫苗免疫效果的评价，提供一种更加客观和有效的指标，减少了生产中PRRS疫苗免疫的盲目性，为PRRS的免疫防控提供技术支撑。
[0006] 基于PRRSV GP5蛋白的iELISA试剂盒其组成包括：50~200μL重组蛋白包被、包被缓冲液25mL-40mL、酶标二抗300-500μL、1×PBST缓冲液800mL-1000mL、阳性对照1mL、阴性对照1mL、封闭缓冲液25mL-40mL、底物液A10mL-15mL、底物液B10mL-15mL和终止液
[0005]
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说 明 书
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10mL-15mL。
[0007] 所述的重组蛋白包被为重组蛋白使用包被缓冲液稀释为1.8 mg/100μL ~3 mg/100μL；重组蛋白为PRRSV GP5基因通过大肠杆菌BL21（DE3）表达系统获得GP5蛋白，并通过His·Bind Purification Kit进行重组蛋白纯化，经SDS-PAGE分析后得到纯化目的蛋白；包被缓冲液为：Na2CO3 1.59 g、NaHCO3 2.93 g溶于去离子水中，定容至1000 mL，调至 p H 9.5～9.8。
[0008] 所述的酶标二抗为：羊抗猪IgG-HRP。[0009] 所述的1×PBST缓冲液为： NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g、KH2PO4 0.2 g、Na2HPO4·12H2O 2.9 g、Tween-20 0.5 mL溶于800 mL蒸馏水，调整pH为7.2～7.6，定容至1000 mL。[0010] 所述的阳性对照为通过PRRS分离毒临床感染猪获得的高免血清，使用时用血清稀释液按1:10～1:200倍稀释；所述的阴性对照为未感染且未免PRRS疫苗的猪血清，稀释度为1:10～1:200。
[0011] 所述的封闭缓冲液为：BSA0.3 g（0.1～0.5 g）溶于100 mL PBST缓冲液；所述底物液A为：Na2HPO4 14.60 g、柠檬酸 9.33 g和过氧化氢脲 0.52 g，溶于三蒸水，并定容至1000 mL，调至 p H 5.0～5.4；所述底物液B为：TMB 20mg和无水乙醇10 mL，加双蒸水至1 000 mL，过滤除菌，无菌分装。[0012] 所述的终止液为：0.2 %～0.3% HF溶液。
[0013] 基于PRRSV GP5 蛋白的iELISA试剂盒的制备方法，它包括以下步骤：
第一，原核表达系统表达融合蛋白His-dGP5，并经His·Bind Purification Kit纯化得到融合蛋白，应用SDS-PAGE和Western-blotting分析其纯化效果及反应原性；
第二，步骤一的纯化融合蛋白His-dGP5作为包被抗原，进行抗原包被液浓度、抗原包被条件、封闭液、血清稀释度、封闭时间、酶标二抗稀释浓度和显色反应时间iELISA的条件的优化；
第三，取40份已知PRRS抗体阴性的猪血清，按步骤二确定的最佳反应条件，进行iELISA反应。样本OD630值≥阴性样本OD630值的平均值（X）+3（标准差），可在99%的水平上判为阳性，当样本OD630值＜阴性样本OD630值的平均值（X）+3（标准差）时，判为阴性。[0014] 本发明有益效果：本发明方法适用于检测猪血清PRRSV GP5 IgG，能够体现机体内中和抗体水平，将为PRRS疫苗免疫效果的评价，提供一种更加客观和有效的指标，减少了生产中PRRS疫苗免疫的盲目性，为PRRS的免疫防控提供技术支撑。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：
（1）效果好：GP5抗体水平能够较好的体现机体抵抗PRRSV侵袭和疫苗免疫效果，减少了生产中PRRS疫苗免疫的盲目性，降低猪场的生产成本。[0015] （2）相对于进口的全病毒包被ELISA试剂盒约5000元的销售价格，本发
明的PRRSV GP5 蛋白的iELISA试剂盒单个成本价仅500元，能够极大降低PRRS血清抗体监测成本。附图说明
[0016]
图1为本发明的PRRSV GP5蛋白的iELISA试剂盒制备生产流程图。
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说 明 书
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具体实施方式
[0017] 本发明的实施例：
基于PRRSV GP5蛋白的iELISA试剂盒原料组成为：PRRS标准阳性和标准阴性血清；重组蛋白为PRRSV GP5基因通过大肠杆菌BL21（DE3）表达系统获得GP5蛋白，并通过His·Bind Purification Kit进行重组蛋白纯化，经SDS-PAGE分析后得到纯化目的蛋白，使用包被缓冲液稀释为1.8 mg/100μL ~3 mg/100μL；包被缓冲液：Na2CO3 1.59g、NaHCO3 2.93g溶于去离子水中，定容至1000mL，调至 p H9.6；酶标二抗：羊抗猪IgG-HRP；1×PBST缓冲液： NaCl 8.0g、KCl 0.2g、KH2PO4 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、Tween-20 0.5mL溶于800mL蒸馏水，调整pH为7.4，定容至1000mL；封闭缓冲液：BSA0.3g溶于10mL PBST缓冲液；底物液A：Na2HPO4 14.60g、柠檬酸 9.33 g、过氧化氢脲 0.52 g，溶于三蒸水，并定容至1 000 mL，调至 pH 5.2；底物液B：TMB 20mg、无水乙醇10 mL，加双蒸水至1 000 mL，过滤除菌，无菌分装；终止液：0.25% HF溶液；
如图1所示意，本发明的iELISA试剂盒的制备方法为： 第二，原核表达系统表达融合蛋白His-dGP5，并经His·Bind Purification Kit纯化得到融合蛋白浓度为2.4 mg/mL，应用SDS-PAGE和Western-blotting分析其纯化效果及反应原性；
第二，步骤一的纯化融合蛋白His-dGP5作为包被抗原 iELISA的条件优化为：iELISA方法最佳反应条件为：抗原包被液浓度1.0μg/100μL；血清稀释度1:10；抗原包被条件37℃ 1h再室温12h；封闭液0.1%BSA，封闭时间1h；酶标二抗稀释浓度1:2000；显色反应时间15min；
第三，取40份已知PRRS抗体阴性的猪血清，按步骤二确定的最佳反应条件，进行iELISA反应。样本OD630值≥阴性样本OD630值的平均值（X）+3（标准差）＝0.285，可在99%的水平上判为阳性；因此当样本OD630值≥0.285时，判为阳性；当样本OD630值＜0.285时，判为阴性；
第四，基于重组PRRSV GP5蛋白间接ELISA试剂盒的最佳使用步骤与方法确定①以2.4 mg/100μL重组PRRSV GP5蛋白包被ELISA反应板，4℃作用12h-16h后，应用PBST洗涤ELISA反应板5次；②以0.3mg/100μL的BSA溶液封闭ELISA反应板，37℃，封闭1h-3h后，应用PBST洗涤ELISA反应板5次；③将待检血清用PBST做1∶10倍稀释，按100μL加入ELISA反应板，37℃作用1h后，应用PBS洗涤ELISA反应板5次；④将羊抗猪IgG-HRP用PBST做1:2000倍稀释，按100μL加入ELISA反应板，37℃作用1h后，应用PBST洗涤ELISA反应板5次；⑤将底物液A和B各50μL加入ELISA反应板，避光室温显色15min，加入50μL终止液，立即在酶标仪630nm波长下读取OD值。⑥试验结果判定标准为样本OD630值(样本OD630值＞阴性样本OD630值的平均值（X）+3标准差（SD）)≥0.285为阳性，OD630值＜0.285为阴性；
第五，应用步骤三建立的iELISA方法，检测PRRS标准阳性血清的OD630值为1.232；猪圆环病毒病标准阳性血清、猪瘟标准阳性血清、猪伪狂犬病标准阳性血清、猪细小病毒病标准阳性血清、猪乙型脑炎准阳性血清的OD630值为0.112～0.245，确定特异性良好；
第六，应用步骤三建立的iELISA方法，批内及批间重复性试验变异系数为均≤15.0%，
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确定该iELISA批内重复性及批间重复性良好；
第七，应用步骤三建立的iELISA方法，检测368份中和试验检测的临床猪血清样本，阳性率为55.4%（204/368），确定其临床适用性良好；
第八，步骤五、步骤六和步骤七合格即制得基于PRRSV GP5蛋白的iELISA试剂盒以上第一至第七步骤中按照原料配比进行。
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