PTEN基因转染对人膀胱癌细胞BIU-87中P13K—Akt信号通路的影响

第１　３卷第５期　２　０　０　８年９月　现代泌尿外科杂志　Ｘｉａｎｄａｉ　Ｍｉｎｉａｏ　Ｗａｉｋｅ　Ｚａｚｈｉ　、，Ｏ１．１３　ＮＯ．５　Ｓｅｐ．２００８　・论　文章编号：１００９—８２９１（２００８）０５—０３６５—０３　ＰＴＥＮ　基因转染对人膀胱癌细胞ＢＩＵ一８７中ＰＩ３Ｋ—Ａｋｔ信号通路的影响　张建华，程跃　３１５０１０）　（宁波市第一医院泌尿外科，宁波Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ＰＴＥＮ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｏｎ　ＰＩ３　Ｋ—Ａｋｔ　ｓｉｇｎａｌ　ｐａｔｈ　ｏｆ　ｂｌａｄｄｅｒ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ＢＩＵ－８７　Ｚｈａｎｇ　Ｊｉａｎｈｕａｎ，Ｃｈｅｎｇ　Ｙｕｅ　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｕｒｏｌｏｇｙ，Ｎｉｎｇｂｏ　Ｎｏ．１　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｎｉｎｇｂｏ　３１５０１０，Ｃｈｉｎａ）　ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ａｎｔｉ．ｏｎｃｏｇｅｎｅ　ＰＴＥＮ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｏｎ　ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｐａｔｈ　ｏｆ　ＰＩ３Ｋ—Ａｋｔ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｂｌａｄｄｅｒ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ＢＩＵ－８７．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ＰＴＥＮ　ａｎｄ　ｐＢｐ—ＰＴＥＮ，ｗａｓ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５口ａｎｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ．Ｐｌａｓｍｉｄ　ｗａｓ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ，ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｚｙｍｅ．　ｐＢｐ－ＰＴＥＮ　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ＢＩＵ一８７（ｐＢｐ—ＰＴＥＮ—ＢＩＵ８７），ａｎｄ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌ　ｃｌｏｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ａｎｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ．Ｗｉｔｈ　ｅｍｐｔｙ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ＢＩＵ－８７（ｐＢｐ－ＢＩＵ８７）ａｎｄ　ｎｏｒｍａｌ　ＢＩＵ一８７　ａｓ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐｓ．ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＰＴＥＮ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＲＴ・ＰＣＲ．　Ａｆｔｅｒ　ＰＴＥＮ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｂｌａｄｄｅｒ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ＢＩＵ一８７，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｐ１１０　（ｃａｔａｌｙｚｉｎｇ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ｏｆ　ＰＩ３Ｋ），ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ　Ｐ１　１０，Ａｋｔ　ａｎｄ　ｐｈｏｓｐｈ０ｒｙｌａｔｅｄ　Ａｋｔ　ｗｅｒｅ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ｗｉｔｈ　ｎｏｒｍａｌ　ＢＩＵ一８７　ｃｅｌｌ　ａｎｄ　ｅｍｐｔｙ　ｐｌａｍｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ａｓ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａｌｌ　ｃｅｉｌｓ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｇｒｏｕｐｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　Ｐ１　１０　ａｎｄ　Ａｋｔ，　ｂｕｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈＯｒｙｌａｔｅｄ　Ｐ１　１０　ａｎｄ　ｐｈｏｓｐｈＯｒｙｌａｔｅｄ　Ａｋｔ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｗｅａｋｅｒ　ｉｎ　ＰＴＥＮ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｔｈａｎ　ｔｈｏｓｅ　ｉｎ　ｏｔｈｅｒ　ｔｗｏ　ｇｒｏｕｐｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＰＴＥＮ　ｍｉｇｈｔ　ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅ　ＰＩ３Ｋ—Ａｋｔ　ｓｉｇｎａｌ　ｐａｔｈ　ａｓ　ａ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ｔｈｅ　ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｐａｔｈ，ＰＴＥＮ・ＰＩ３Ｋ—Ａｋｔ，ｍｉｇｈｔ　ｂｅ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ＰＴＥＮ　ｆｕｎｃｔｏｎｓ．　ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ：ｂｌａｄｄｅｒ　ｃａｎｃｅｒ；ＰＴＥＮ；ＰＩ３Ｋ；Ａｋｔ　摘要：目的研究抑癌基因ＰＴＥＮ转染对人膀胱癌细胞ＢＩＵ一８７中ＰＩ３Ｋ—Ａｋｔ信号通路的作用。方法　将携有ＰＴＥＮ基因的重　组真核表达质粒ｐＢｐ－ＰＴＥＮ转化大肠杆菌ＤＨ５ａ并扩增，抽提纯化质粒并进行酶切鉴定，ｐＢｐ－ＰＴＥＮ体外转染ＢＩＵ一８７细胞　（ｐＢｐ－ＰＴＥＮ—ＢＩＵ８７），筛选稳定转染的细胞并扩增培养，以转染了空质粒ｐＢｐ的ＢＩＵ一８７细胞（ｐＢｐ—ＢＩｕ８７）和正常ＢＩＵ－８７细胞为　对照，用ＲＴ—ＰＣＲ检测ＰＴＥＮ的表达情况。将ＰＴＥＮ基因的真核表达质粒转染膀胱癌细胞ＢＩＵ一８７（ｐＢｐ—ＰＴＥＮ—ＢＩＵ８７），以　ＢＩＵ８７细胞和ｐＢｐ－ＢＩＵ８７细胞为对照，应用Ｗｅｓｔｅｒ　ｂｌｏｔ方法检测三组细胞Ｐ１１０（ＰＩ３Ｋ的催化亚单位）、磷酸化Ｐ１１０、Ａｋｔ和磷　酸化Ａｋｔ表达的情况。结果　３种细胞Ｐｌ１Ｏ和Ａｋｔ蛋白总水平没有变化，但磷酸化Ｐ１１Ｏ和磷酸化Ａｋｔ在ＰＴＥＮ转染细胞中　的表达明显弱于对照组。姑论ＰＴＥＮ是通过对ＰＩ３Ｋ—Ａｋｔ信号传导途径的负而抑制肿瘤的形成。ＰＴＥＮ—ＰＩ３Ｋ—Ａｋｔ途径　可能是ＰＴＥＮ抑癌作用的重要机制。　关键词：膀胱癌；ＰＴＥＮ；三磷酸酰肌醇激酶；Ａｋｔ　中圈分类号：Ｒ７３７．１４　文献标识码：Ａ　ＰＴＥＮ是迄今为止发现的第一个具有磷酸酶活性　酸酰肌醇激酶（ＰＩ３Ｋ）、蛋白激酶Ｂ（Ａｋｔ／ＰＫＢ）及其他　的抑癌基因，它通过发挥磷酸酶作用，降低多种信号传　下游信号分子，以促进细胞的增殖，抑制凋亡并对细　导途径的关键酶的磷酸化水平，阻断信号传导通路，以　胞周期起正作用，导致细胞恶性转化。本实验检　抑制细胞的生长、黏附、铺展和迁移，诱导凋亡，从而对　测ＰＴＥＮ基因转染前后膀胱癌细胞Ｐ１１０（ＰＩ３Ｋ的催　肿瘤的生长、侵袭和转移产生负性调节作用。ＰＩ３Ｋ－　化亚单位）、磷酸化Ｐｌｌ０、Ａｋｔ和磷酸化Ａｋｔ的表达　Ａｋｔ途径是蛋白激酶偶联受体介导的一条重要的信号　情况，以期证明ＰＴＥＮ可能通过ＰＩ３Ｋ—Ａｋｔ信号传导　转导通路，细胞外信号分子通过磷酸化依次激活三磷　途径起抑癌作用。　收稿日期：２００７—１０—２３　修回日期：２００８—０１一ｌＯ　１材料与方法　基金项目：２００７年浙江省医药卫生科学研究基金（Ｎｏ．２００７Ａ１７１）　作者简介：张建华（１９７７一），男（汉族），博士，主治医师．　１．１　主要材料和试剂　人膀胱癌细胞系ＢＩＵ一８７从　Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇ７７０２２３＠１２６．ｃｏｒｎ　武汉同济医院妇科肿瘤实验室引入，ｐＢｐ—ＰＴＥＮ及　重庆维普 http://www.cqvip.com

现代泌尿外科杂志第13卷pBabep—uro(pB，p)空质粒由武汉同济医a院骨科冯尔2宥博士惠赠DH5。大肠杆菌菌株来自武汉同济医学和大量质粒抽提纯化试剂盒、结果1)，院生化教研室(宝生物工程2000(In、Trizol质粒鉴定证实含有PTEN基因(图证实PTEN转染后稳定表达(图2)。RTPCR—(上海华舜生物工程有限公司)性内切酶EcoRIine三种细胞P110，大连有限公司)脂质体、Lipofectam和Akt的Westernblot阳性条带强度相似提示转和磷酸化Akt的阳性条vitrogen公司)、PCR引物(上海赛百盛公染前后PTENP110和Akt蛋白的总水平无明显变化；，司)通用RTPCR试剂盒(北京博大泰克生物基因转染后磷酸化，P110技术有限公司)12．带明显较对照组弱说明PTEN3)。转染导致PllO和细菌的转化和扩增培养。氯化钙法制备感受态大，Akt的磷酸化水平降低(图肠杆菌DH5a于EP管中加人质粒和感受态DH5a，混匀后至水浴中热休克再加入无抗生素LB培养基孵育LB。从EP管中取菌液接种于含氨苄青霉素的，，。琼脂平板上培养过夜LB挑取单个菌落转入含氨，，，苄青霉素的一培养基中振摇过夜至饱和生长。70℃．冰箱保存13质粒的抽提纯化和酶切鉴定LB，取质粒转化的菌。液到含氨苄青霉素的pBpPTEN培养基中振摇过夜，按大量质粒抽提纯化试剂盒说明书的步骤提取并纯化或pBp。将纯化的质粒，DNA8。—，于紫外分。光光度计上检测纯度A1。。。A／：。。一1．2符合要求BIULipo琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切．DNA片段6，图M一1：pBpPTEN—酶切鉴定结果4基因转染和细胞筛选在80，L板中接种孑Marker；1：pBpPTEN；2：pBp87细胞培养至满，70％％按脂质体pBpPTEN—fectamine2000说明书的步骤将一或空质，粒pBp导入BIU87细胞转染，24h，后换液并于荧光显微镜下观察继续培养，48h加嘌呤霉素筛选并扩增培养1．。5RTPCR—提取细胞R。NA后按通用RTPCR，试剂盒步骤进行操作m反应条件退火m：94℃预变性1m5，510in，94℃32变性，50S，58℃50。S，72℃延伸in循环为5'周72℃再延伸8inPTEN’，一的上游引物下游引物为2385r_TTTGTGGTCTGCCAGCTA3一GGTTCATTCTCTGGATCAGA3。’，扩增片段为5，_CCG图M：2：PTEN510bpGactin作内参照其上游引物为，的RTPCR电泳结果A5—Marker；1BIU87；2：pBpBIU87；3，4：pB~PTENBIU87CAGGATGCAGAAGGAGAT3一’，下游引物为’GTCAAGAAAGGGTGTAACGCAACT3’，扩增片PTEN—段为238bpBIU87)一。将pBpPTEN转染细胞(pBpBIU87)、pBp转染细胞(pBp和未转染细胞1，(BIU87)的PCR产物分别经2％琼脂糖凝胶电泳2341234溴化乙啶染色凝胶分析系统观察，。1．6W，esternblot制作凝胶(SDS聚丙烯酰胺凝胶)后凝胶板安置于电泳槽将处理好的样品加入槽，内。电泳后取出凝胶进行半干式电转移胶中的蛋，，。图3a：P110和Akt；的Western：blot；dt：结果白质将转移至膜上干燥分析结果，。最后行免疫显色。膜置滤纸上Pll0b：磷酸化P110c；Ak：磷酸化Akt—1：BIU87；2：pBpBIU87；3、4pBpPTENBIU87重庆维普 http://www.cqvip.com

５期　张建华，程　跃．ＰＴＥＮ基因转染对人膀胱癌细胞ＢＩＵ－８７中ＰＩ３Ｋ—Ａｋｔ信号通路的影响　３６７　３讨　论　ＰＴＥＮ又称ＭＭＡＣ１或ＴＥＰ１，是１９９７年克隆到　的一种新的肿瘤抑制基因，定位于人类染色体１０ｑ２３，　有９个外显子和８个内含子，ＰＴＥＮ的ｃＤＮＡ包含一　由１　２０９个核苷酸组成的开放阅读框，其翻译的蛋白由　４０３个氨基酸组成，是一种磷酸酶＿１］。ＰＴＥＮ蛋白具有　与蛋白酪氨酸磷酸酶和蛋白丝氨酸／苏氨酸磷酸酶催　化中心同源的序列，同时还具有脂质磷酸酶作用，故同　时具有蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶，称之为双重特异性　磷酸酶［２］。现已发现在多种类型的原发性恶性肿瘤和　各种肿瘤细胞株中ＰＴＥＮ存在有较高频率的缺失或突　变，出现表达缺失，如胶质细胞瘤、Ｃｏｗｄｅｎ综合征、乳　腺癌、宫颈癌和前列腺癌等。研究发现，ＰＴＥＮ的表达　缺失与这些肿瘤的进程和预后相关，然而ＰＴＥＮ的作　用途径至今并未完全清楚。　ＰＩ３Ｋ—Ａｋｔ途径是蛋白激酶偶联受体介导的一条　重要的信号转导通路＿３。］。细胞外信号分子如生长因　子结合受体后磷酸化ＰＩ３Ｋ，活化后的ＰＩ３Ｋ通过对　膜脂质和ＰＩＰ　的磷酸化反应产生ＰＩＰ。，ＰＩＰ。是细胞　生长中重要的信号分子，它结合Ａｋｔ并使之定　位于胞膜，Ａｋｔ发生构象改变，易于被磷酸化激活。　Ａｋｔ是一种高度保守的蛋白质丝氨酸／苏氨酸磷酸化　激酶，被认为是原癌基因之一，通过对凋亡蛋白　的磷酸化而抑制细胞的凋亡。活化的Ａｋｔ作用于其　下游底物，促进细胞的增殖，抑制凋亡并对细胞周期　起正作用。　本实验用脂质体转染的方法将外源性ＰＴＥＮ导　人人膀胱癌细胞系ＢＩＵ＿８７，ＲＴ＿ＰＣＲ证实其在ＢＩＬ卜８７　中稳定表达。应用Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ方法，以未转染细胞　和空质粒转染细胞为对照，检测ＰＴＥＮ阳性、稳定转染　的细胞克隆中Ｐ１１Ｏ、磷酸化Ｐｌ１０、Ａｋｔ和磷酸化Ａｋｔ　的表达情况。结果证实转染ＰＴＥＮ后，Ｐｌｌ０和Ａｋｔ总　蛋白表达水平无变化，而磷酸化Ｐ１１Ｏ和磷酸化Ａｋｔ的　表达水平明显降低。这说明ＰＴＥＮ通过它的脂质磷酸　酶作用降低了ＰＩ３Ｋ和Ａｋｔ的磷酸化水平，阻断ＰＩ３Ｋ－　Ａｋｔ路径，抑制Ａｋｔ及其下游激酶的活性，抑制细胞增　殖，促进细胞的凋亡，从而抑制肿瘤的发生发展，也就　是说ＰＴＥＮ是通过对ＰＩ３Ｋ—Ａｋｔ信号传导途径的负调　控而抑制肿瘤形成的。Ｔｏｎｋｓ等　发现，每种保持　ＰＴＥＮ蛋白功能丧失的突变都同时丧失了脂质磷酸酶　活性，但其蛋白磷酸酶活性仍表达。这一发现表明脂　质磷酸酶活性对于抑制细胞生长起着关键作用，而　ＰＴＥＮ＿ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ通路是脂质磷酸酶作用的最重要途　径，因此，可以说ＰＴＥＮ—ＰＩ３Ｋ—Ａｋｔ通路是ＰＴＥＮ的主　要作用机制。　ＰＴＥＮ可能通过对ＰＩ３Ｋ—Ａｋｔ信号传导途径的　负而抑制肿瘤的形成，这是对肿瘤抑制的新见　解。然而人们对ＰＴＥＮ作用及机制的认识还处于初　步阶段，ＰＴＥＮ的具体作用底物及其相互之间的关　系，ＰＴＥＮ的表达与肿瘤分期分级的关系及对临床预　后影响等尚有待进一步研究。考虑到在人类肿瘤中　此类突变的高发频率，直接针对这一途径组分的新药　或现行药会有治疗上的巨大优势。　参考文献　［１］Ｗｕ　Ｘ，Ｏｂａｔａ　Ｔ，Ｋｈａｎ　Ｑ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙＩｉｎｏｓｉｔｏｌ一３　ｋｉ－　ｎａｓｅ　ｐａｔｈｗａｙ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｂｌａｄｄｅｒ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ｉｎｖａｓｉｏｎ　ＥＪ］．ＢＪＵ　Ｉｎｔ，　２００４，９３（１）：１４３．１５Ｏ．　［－２］Ｊａｎａｓ　ＭＬ，Ｈｏｄｓｏｎ　Ｄ，Ｓｔａｍａｔａｋｉ　ｚ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｅｌｅｔｉｎｇ　ｐｌ１０｛ｄｅｌｔａ）ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＴＥＮ—ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　Ｂ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ３．Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００８，１８０（２）：７３９．７４６．　Ｅ３３Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ　ＲＣ，Ｄｕｒｄｅｎ　ＤＬ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ｄｉｓｅａｓｅ：ｔｈｅ　ＰＩ３Ｋ．　Ａｋｔ・－ＰＴＥＮ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｎｏｄｅ－・－ａｎ　ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ　ｐｏｉｎｔ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　ｂｒａｉｎ　ｔｕｍｏｒｓ　ｒＪ］．Ｎａｔ　Ｃｌｉｎ　Ｐｒａｃｔ　Ｎｅｕｒｏｌ，２００７，３　（１２）：６８２．６９３．　［４］Ｚｈａｎｇ　Ｘ，Ｊｉｎ　Ｂ，Ｈｕａｎｇ　Ｃ．Ｔｈｅ　ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ　ｐａｔｈｗａｙ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ　ｔｒａｎｓｃ　ｒｉｐｔｉ０ｎａｌ　ｆａｃｔｏｒｓ　ａｓ　ｔａｒｇｅｔｓ　ｆｏｒ　ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎ—　ｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｔａｒｇｅｔｓ，２００７，７（４）：３０５・３１６．　［５］Ｔｏｎｋｓ　ＮＫ，Ｍｙｅｒｓ　ＭＰ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ａｓｓｅｔｓ　ｏｆ　ａ　ｔｕｍｏｒ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８６（５４４７）：２０９６－２０９７．　（编辑邱芬）