前言：α-淀粉酶能随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等
还原糖，所得产物的还原性末端葡萄糖单位碳原子为α构型，同时该酶能使淀粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶。耐酸性α-淀粉酶是在酸性条件下水解淀粉的酶类，其最适pH在4.0左右。通过黑曲霉发酵生产α-淀粉酶的实验过程，熟悉发酵罐的构造和使用方法。初步了解发酵生产的原理和常规发酵参数的检测方法。整个实验按照“菌种的培养 空消 实消接种 发酵 放罐”的发酵过程进行。在整个发酵的过程中，每隔6h取一次发酵液样品检测其pH值、酶活、残糖量及生物量四个生理指标。最后将所测数据进行整理、分析，可以得出整个发酵过程各物质的生成和消耗的变化规律以及如何调整培养条件来提高发酵生产的效率，对大工业生产具有重要的指导意义。
黑曲霉发酵生产α-淀粉酶
关键词：黑曲霉 α-淀粉酶 发酵 pH值 酶活 残糖量 生物量。
一，材料与方法：
1.材料: 菌种：黑曲霉
培养基：已配制好的培养基。
试剂：（1）碘液：称取0.5g I2 和5.0gKI 研磨溶解于少量蒸馏水，定容至100ml，于褐色试剂瓶内保存，避免阳光直射。
（2）稀碘液：取原碘液1ml稀释100倍。此溶液现配现用。
（3）0.5%淀粉液：称取干燥过的可溶性淀粉0.5克，加5ml缓冲液，搅拌混和，再徐徐倾入70毫升煮沸的缓冲液中。继续煮沸2分钟，冷却至室温，定容至100mL。此溶液需要当天配制。
(4) 磷酸缓冲液（pH 6.0）：0.2 mol/L K2HPO4 (12.3mL)+0.2 mol/L KH2PO4(87.7mL)。 (5) 蒽酮试剂。溶解0.2 g蒽酮于浓硫酸（A. R. 95.5 %）100 ml中，当日配制试用。具体实验过程中，应视样品分数多少来准备蒽酮试剂的配置量。 2.方法：
2.1发酵罐的使用：发酵罐的几大系统，即空气系统、蒸汽系统、补料系统、进出料系统、温度系统、在线控制系统。主要应该注意使用的顺序为： （1）空气系统：
空气除菌设备：空压机 贮气罐 油水分离器 空气流量计 空气过滤器 发酵罐.
（2）进出料系统：进料口（接种口）、出料口（取样口）。
（3）管道：包括水流通管道和气流通管道。水流通：冷却用水：水经过进水管道 发酵罐夹套 出水口
保温用水：关闭进出水管道阀门（水注满后） 加热保温 进入夹套 气流通：蒸汽发生器 蒸汽管道 空气过滤器/发酵罐 进入罐内
空气：空压机 贮气罐 油水分离器 空气流量计 空气过滤器 发酵罐
2.2空消
先开启蒸汽发生器，自有蒸汽产生并排掉管路中冷凝水后，按以下步骤进行： 1．先关闭所有阀门，检查处是否关紧密封，打开罐上方排气口。
2．蒸汽先进空气系统，蒸汽→蒸汽过滤器→分过滤器，无论蒸汽走到哪一路得先放尾阀，放出冷凝水，排掉冷空气，待有蒸汽冲出后调小，打开主阀。
3．再进罐体：由主路进罐，然后通入取料管路，再入补料系统（两边）。 4．罐压升至所需温度（121℃）时开始计时，保温保压30min。
保压方式：（1）调节主汽路进汽阀门控制进汽量；（2）调节排气口排气量大小或尾阀放汽量。
5．结束空消：（1）逆着蒸汽进路关，先关近罐阀。（2）同时准备好压缩空气确保蒸汽一停即充入无菌压缩空气以维持空气系统及罐内的正压。近罐空气阀的尾阀要一直微开启。
注意：空消前应检查夹套中是否残留了冷水，若有，影响罐体升温，须自夹套出水口将水放出。
2.3 种子制备：接种黑曲霉于PDA液体培养基中，液体摇瓶培养。 2.4培养基配制、实消
发酵培养基配方：可溶性淀粉200 g，柠檬酸氢二铵100 g，KH2PO4 15 g，CaCl2 0.5 g，FeSO4.7H2O 0.05 g，MgSO4.7H2O 0.5 g，加水定容至5 L，pH5.0，消泡剂（植物油）5 mL。
关闭气路入罐阀，主汽路进汽→补料口进汽（方法同空消）→罐压升至0.12Mpa（121℃），保压、保温30分钟→实消结束。 2.5冷却接种与发酵
待培养基冷却至28℃左右时，在加料口周围放一圈酒精棉球，点燃，在无菌条件下打开进料口，迅速接种。
将温度、搅拌转速、通气量等参数设定好后，进行发酵。 2.6参数监测
每隔6 h取一次样，检测其pH、生物量、酶活及残糖含量等指标。
3.参数检测的方法：
Ⅰ. pH的测定：标准液校准pH计后，测定样品pH值。
Ⅱ. 生物量的测定：每次取20-30mL的发酵液，先用大离心机(5000 rpm, 3-5 min)离心，收集上清液用来测酶活，沉淀用水清洗几次后再离心，然后将所得沉淀放入100℃烘箱中，烘干（2 h左右），然后测其干重，取平均值。 Ⅲ. 酶活：
取5ml 0.5% 的可溶性淀粉溶液，在40℃水浴中预热10 min，然后加入适当稀释(6.0的磷酸盐稀释缓冲液)的酶液0.5ml，反应5min后，用5ml 0.1mol/L H2SO4 终止反应。取0.5 ml 反应液与5 ml 碘液显色，在620 nm处测光密度。以0.5 ml水代替0.5 ml反应液为空白，以不加酶液（加同样体积的缓冲液）的管为对照（即取5ml 0.5% 的可溶性淀粉溶液，在40℃水浴中预热10 min，然后加入6.0的磷酸盐稀释缓冲液0.5ml，反应5min后，用5ml 0.1mol/L H2SO4 终止反应。取0.5 ml 反应液与5 ml 碘液显色）。酶活力根据下式计算：
酶活力（u/ml）＝(R0-R)/R0×50×D，式中R0，R分别表示对照和反应液的光密度，D为酶的稀释倍数。调整D使(R0-R)/R0在0.2-0.7之间。确定在40℃、5 min 内水解1 mg淀粉的酶量为一个活力单位。
Ⅳ. 残糖量的测定：硫酸-蒽酮法测残糖含量 原理
糖类与浓硫酸脱水生成糖醛或其衍生物，可与蒽酮试剂缩合产生颜色物质，反应后溶液呈蓝绿色，于620 nm处有最大吸收，显色与多糖含量有线性关系。 操作及其注意事项
分别取0.1 g/l的葡萄糖溶液0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.60，0.80 ml，用蒸馏水补到1.00 ml，分别加入4.00 ml蒽酮试剂，迅速进入冰水浴中冷却，各管加完后一起浸入沸水浴中，管口加盖玻璃球，以防蒸发。自水浴重新煮沸开始计时，准确煮沸10 min，冷却后进行比色。以光密度为纵坐标，糖的含量微克数为横坐标，制作标准曲线。或使用计算器进行一元回归得出计算式，以便于计算使用。 （4）样品含量测定
取糖浓度为50μg/ml左右的样品溶液1.00ml，一式3份分别置于不同试管中，对照加入1.0ml蒸馏水，然后给各管加入蒽酮试剂，以标准曲线方法进行比色测定。根据标准曲线和样品浓度计算含量。
色氨酸含量较高的蛋白质对显色反应有一定的干扰。此外，试管在加入蒽酮试剂过程中，移液管尖端在试管中所停留的高度对于加入蒽酮试剂的速度影响较大，而且对反应产生颜色的深浅都会产生一定的影响。因此，实验操作应该注意。
二.结果分析与讨论:
1.数据处理: 发酵液PH的变化： 时间（h） PH 5.13 5.24 5.43 5.25 4.99 4.8 4.36 3.98 3.38 3.77 3.39 3.36 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66
pH65.4355.135.245.254.994.84.3643.983.773.383.393.36pH3pH2100102030时间h40506070
生物量的变化： 时间(h) 0 生物量2.5 （mg） 6 5.4 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 13.9 35.9 36.1 38.4 34.1 69.5 50.24 50.24 50.24 95.5 生物量mg12010080生物量mg95.5969.56050.244020002.55.4102030时间h4050607035.913.936.138.434.150.2450.24生物量mg
残糖量的变化： 时间（ h） 残糖含量（ g/l）
残糖量g/l32.521.510.5002.80252.2181.1562.3511.8980.82682.7360 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 1.115 2.218 2.8025 1.898 0.8268 2.351 2.454 2.568 2.736 2.406 2.344 2.198 残糖量g/l2.4542.5682.4062.3442.198残糖量g/l102030时间h40506070
酶活： 时间0 6 12 261.3 18 348.7 24 535.2 30 968.5 36 1437.9 42 2960.7 48 4678.4 54 6337.2 60 8654.7 66 9550.6 （h） 酶活0 128.u/ml
4 酶活u/ml1200010000酶活u/ml8000600040002000000128.410261.3348.720535.230时间h968.51437.94050606337.24678.42960.78654.79550.6酶活u/ml70
2.结果分析：
（1）对PH值得变化的分析：从图像上看来，0~12h由于黑曲霉的发酵处于其生长曲线中的潜伏期，由于刚开始发酵他的代谢缓慢，消耗和合成都很少，所以PH值变化不大，维持在一个稳定的范围内。而后逐渐进入对数期，其代谢旺盛，自身消耗大，合成产物如CO2等变多，所以PH逐渐下降，这段区域反映在图像上是在12~48h。而后发酵进入了稳定期和衰退期，PH变化稳定。
（2）对生物量变化的分析：在理论上来看生物量应该随着时间的推移而逐渐上升的。但从我们所做的图像上可以看出，一直呈波浪起伏型的增长。在18~30和48~54h是出现了不增长现象，在30~48和54~60h甚至出现了下降的趋势，这有可能是在离心过程中离心不彻底导致产物损失造成的，也有可能是操作者的操作不规范引起的。而在42和66h段的突然增高也可能是产物中含有杂质或烘干不彻底造成的。总体来说还是呈产量增加的趋势。
（3）对残糖量变化的分析：从理论上来讲残糖的含量应该呈下降的趋势。而，从我们所做的图像来的看的话其含量一直呈很大的波动状。究其原因可能有：1，实验要求淀粉溶液和蒽酮必须是现配现用的，而我们使用的不是现配溶液，导致测量出现误差。2.操作开始时发酵罐的温度的设置不是最适温度。3.我们组的发酵装备本来就与问题，通气措施不好。4.由于操作者自身的操作不够规范，稀释倍数不合理。5.由于我们是分组操作，各个时期的操作者不同，所以由于操作习性不同，所以误差比较大。
（4）对酶活性变化的分析：从图中可以看出酶活性随着时间的推移而上升。究其原因，是因为刚开始时发酵处于潜伏期，菌种的代谢缓慢，总量少。所以在0~38h酶活上升缓慢。而后来，黑曲霉的发酵进入对数期和稳定期，其生长、代谢旺盛，产酶量高，酶的活性也随之增强。所以一直呈上升趋势。
3.实验误差分析：
在做实验的过程中难免实验的误差，而导致实验结果出现偏差。我们不能完全阻止误差，但要尽量避免误差。现在我们就来总结分析实验过程中可现出现的误差，从而来避免它。 （1）不同批次的操作人员其测量方式和测量顺序会导致结果的不同。 （2）试剂自身的质量和含量的不同也会是实验结果产生不同。
（3）我们在测生物量是会使用到移液枪，而由于实验的需要对其枪头做了改变。若使用未经变动的枪头会导致测量时菌体含量变少，导致实验误差。
（4）在测量各个数据时都会用到离心机，而每个实验的离心转速都不同。在实验操作时要注意调节。
（5）正确使用各个实验器具。
（6）同一个实验会有很多不同的方法，所以不同的方法会带来不同的实验结果。 （7）实验最后的数据处理也会带来误差。
（8）发酵仪器的问题，例如我们组的仪器有问题，这就使的发酵时就带来了误差。还有不同的仪器间也存在着误差。
三.实验总结：
经历了很长时间的切身实验操作，我了解了实验的一般步骤和实验的操作程序，也知道了实验的严谨和辛苦。在实验室中我认识了以前只在书本和图片上才能看到的那些发酵罐和相应的仪器，也了解了以前觉得很神秘的发酵过程。虽然发酵仪器的使用很复杂，但我们还是认真听老师讲解，并记下了步骤，在实验过程中不断地进行自我摸索，现在已经可以知晓操作的流程了。实验的过程虽然很辛苦，需要我们早进晚退。但经过这次的锻炼，我学到了很多东西。我觉得很值。面对未来面对科学，我们还有太多的东西需要去学习，所以要努力学习理论知识并与使其应用到实践上去。
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