蛋⽩质下游纯化⼯艺简介
Downstream（下游）与上游相对的概念，⼀般⽽⾔，上游指基因克隆、细胞培养等⽬的产物表达⼯序，下游指从表达有⽬的产物的复杂的混合液中分离纯化得到符合要求的⽬的产物的⼀系列步骤。美、⽇、欧等发达国家⽣物技术产品⼯业化的实践证明：⽣物技术产品的产业化⾼度依赖于基因⼯程下游⼯序技术及设备的进步。⼀、纯化⼯艺常⽤衔接技术：
1、盐析。常采⽤硫酸铵、硫酸钠盐析，获得的盐析沉淀物在低温冰箱(<-20℃)中可以长期保存。2、等电点沉淀。根据蛋⽩质、多肽在等电点时溶解度最⼩的特点进⾏。
3、有机溶剂沉淀。采⽤冷的丙酮、⼄醇沉淀蛋⽩质。例如⼈⾎浆蛋⽩的⼄醇分级沉淀。
4、透析。根据⽬的蛋⽩质、多肽的分⼦量，选取适宜的透析袋进⾏透析，可以起到更换缓冲液以及去除⼀些低分⼦杂质的⽬的。
5、超滤。根据⽬的蛋⽩质、多肽的分⼦量，选取适宜截留分⼦量(MWcutoff)的超滤膜进⾏超滤。
6、真空冷冻⼲燥。利⽤在低温和⾼真空条件下，冰不经融化为液态⽔⽽直接升华为⽔蒸⽓的原理。可以很好地浓缩样品和保存蛋⽩质、多肽的⽣物活性。
7、变性沉淀。根据⽬的蛋⽩质、多肽对于温度或者酸碱性的耐受性，在较⾼的温度或者较极端的pH条件下处理样品，使杂质去除的⽅法。例如胸腺肽制备中使⽤的热变性(~80℃)去除杂蛋⽩。如果⽬的蛋⽩、多肽本⾝热稳定性、酸碱稳定性不⾼则不宜采⽤。
8、离⼼沉淀。利⽤离⼼沉降⼒将不溶性颗粒物与溶液分离的技术，常采⽤⾼速冷冻离⼼机进⾏。9、脱盐。透析、超滤可⽤于进⾏脱盐，SephadexG25、G50常⽤于蛋⽩质脱盐。10、过滤
澄清过滤、除菌过滤（微⽶膜过滤）、超滤（1000~300000道尔顿）⼆、蛋⽩质、多肽液相⾊谱纯化⽅法简介chromatography，⾊谱，层析表1常⽤的液相⾊谱纯化⽅法及其原理
1、纯化的⼀般⽬标和⽅法
⾸先，⾃然来源或者重组表达的蛋⽩质经过⼀些粗提的步骤（例如：匀浆、离⼼、硫酸铵沉淀等）成为稳定的可以⽤于⾊谱分离的样品。
然后进⾏捕获⾊谱（capturechromatography），主要⽬标是浓缩和去除⼤量的容易去除的杂质，此步最关⼼的是流速和载量，常采⽤⾼载量、快流速凝胶。
经过浓缩的部分纯化的样品进⾏中级⾊谱（intermediatechromatography），⽬的是去除较难去除的杂质，此步最关⼼的是分辨率，常采⽤⾼分辨率的细颗粒凝胶。
最后为了得到符合要求的最终产品，去除残存的杂质以及⽬的蛋⽩的多聚物或者降解⽚断，进⾏精制⾊谱（polishingchromatography），常采⽤具有⾼分辨率的凝胶过滤凝胶进⾏凝胶过滤⾊谱。2、纯化前的准备⼯作（1）样品稳定性试验
a、测定样品在pH2-9的稳定性；
b、测定样品在0-4mol/LNaCl及0-2mol/L硫酸铵中的稳定性；c、测定样品在0-50%⼄醇、甲醇中的稳定性；
d、测定样品在4-40℃的稳定性；
e、室温下静置过夜，测定对蛋⽩⽔解酶的稳定性。（2）样品预处理
a、去除样品中颗粒物（微⽶膜过滤或者10000g离⼼15分钟）b、去除样品中脂类（10000g离⼼15分钟或有机溶剂抽提）c、去除样品中核酸（加⼊核酸酶消化或者使核酸沉淀）
d、抑制样品中蛋⽩⽔解酶（加⼊蛋⽩酶抑制剂、低温下快速第⼀步分离或在蛋⽩酶缺陷宿主中表达重组蛋⽩）表2样品中有害杂质及去除办法
由于不同的⾊谱⽅法的原理不同，其对样品的要求也不相同，所以必须在进⾏⾊谱之前，根据特定⾊谱⽅法的要求对样品进⾏进⼀步的处理。如下表所⽰：表3不同⾊谱⽅法对于样品的要求
（3）样品的保存条件：短期储存（⼩于24⼩时）
a、避免接近或超过样品的稳定极限防⽌蛋⽩质变性或沉淀b、在密闭容器中冰箱冷藏较长期储存（数天）a、b、同上
c、加⼊适当的抑菌剂长期储存a、同上
b、冰冻或者最好冻⼲（真空冷冻⼲燥）保存。3、对每⼀纯化步骤的评价相关⽅法的建⽴a、⽬的蛋⽩含量测定
酶活性测定、⽣物活性测定、放射免疫、酶联免疫、免疫电泳、荧光。b、总蛋⽩含量测定
紫外吸收法、Lowry法、Bradford染料结合法（考马斯亮兰G-250）等。c、样品复杂度检测
HPLC（离⼦交换、凝胶过滤、反相）、SDS-PAGE、等电聚焦、⽑细管电泳（CE）。4、蛋⽩质的来源
（1）天然蛋⽩：天然产物中的⽬的蛋⽩⼀般含量很少⽽且组分极复杂，在分离过程中须采⽤多个步骤才能去除各种杂质，并应在整个过程中降低蛋⽩⽔解酶的活性。
（2）重组蛋⽩：重组蛋⽩则⽬标蛋⽩的丰度较⾼。重组蛋⽩主要有三种表达定位：
a、细胞质：在这种情况下，必须破坏细胞结构才能得到⽬的蛋⽩质，同时伴随着⼤量核酸和其它上千种宿主蛋⽩质的释放；在表达量较⾼的条件下，⼀般形成包涵体，包涵体含有过表达⽬的蛋⽩，且容易通过⾼速离⼼分离，但是包涵体的溶解与复性是较复杂的。
b、外周质：表达的蛋⽩质存在于细菌内膜与外膜之间，这样⽬的蛋⽩可以较少地受到蛋⽩酶的作⽤并减少了宿主蛋⽩的污染。
c、分泌到培养基：这种表达⼀般蛋⽩质浓度较低，主要受到培养基中的污染。表4不同来源的蛋⽩质样品概述
三、常⽤液相⾊谱纯化⽅法1、凝胶过滤（gelfiltration ，
molecularsieechromatography 分⼦筛、sizeexclusionchromatography ⼤⼩排阻⾊谱，gelpermeationchromatography 凝胶渗⼊⾊谱）。
根据分⼦⼤⼩和形状进⾏分离的⼀种⽅法，分⼦量（Stroke 半径）较⼤的先出峰，分⼦量⼩的后出峰。最常⽤的经典凝胶为SephadexG 系列，此外还有Sephacryl 、Sepharose 、Superose 、Superdex 等凝胶系列。凝胶过滤法⽅法简单、重现性强，⽬前⼴泛应⽤。
凝胶过滤具有很多不同分离范围的凝胶系列供选择。
要点:采⽤细长（L/D~20）的柱、选择合适的凝胶、上样体积较⼩、流速较慢。 表5常⽤凝胶过滤⽤凝胶及其基本参数
2、离⼦交换⾊谱（ionexchangechromatography）
蛋⽩质、多肽均属于两性电解质，在缓冲液pH⼩于其等电点时，带净正电荷，⽽在缓冲液pH⼤于其等电点时，带净负电荷。阴离⼦交换凝胶本⾝带有正电荷基团，阳离⼦交换凝胶本⾝带负电荷基团。由于静电相互作⽤⽽使样品结合到凝胶上，再采⽤盐浓度梯度或者更换缓冲液的pH值进⾏洗脱
对于等电点⼩于的酸性蛋⽩质，推荐使⽤阴离⼦交换，对于等电点⼤于的碱性蛋⽩质，推荐使⽤阳离⼦交换。
两种模式：⼀种使⽬的蛋⽩结合凝胶，通过梯度洗脱；⼀种使⽬的蛋⽩不结合凝胶，⽽⼤部分杂质结合凝胶，则穿过液中含有⽬的蛋⽩。
columnchromatography（柱⾊谱）batchchromatography（批⾊谱）c、疏⽔作⽤⾊谱
利⽤蛋⽩质、多肽在⾼盐存在下，可以结合疏⽔凝胶，⽽在盐浓度降低时⼜可以解脱的原理实现分离。d、亲和⾊谱
利⽤蛋⽩质、多肽与某些配基的特异性相互作⽤⽽进⾏分离。例如：酶-底物，酶-抑制剂，糖蛋⽩-凝集素，抗原-抗体等。近来发展了⾦属螯合亲和⾊谱，⽤于纯化表⾯含⾊氨酸、酪氨酸、组氨酸等的蛋⽩质以及(His)6-tagged重组蛋⽩。
亲和⾊谱分为特异性亲和⾊谱和组别亲和⾊谱两类。肝素、凝集素、染料、⾦属螯合亲和⾊谱均为组别亲和⾊谱（同⼀配基可以结合许多种蛋⽩质）。
e、反相⾊谱
常⽤于蛋⽩质、多肽的HPLC分析，以及多肽的精细制备分离，分辨率极⾼，可以分离两种仅相差⼀个氨基酸的多肽。如⾎管紧张素（angiotensin）的⼏个亚型通过反相⾊谱可以很好地分离。
同⼀个样品在同⼀Source30RPC柱上进⾏分离，由于⾊谱条件进⾏了改变，⾊谱图截然不同，说明反相⾊谱具有⾼度的选择性。
四、应⽤举例
例⼀、⼀种抗HIgp120单克隆抗体的Fab⽚断（中表达）分⼦量：50kD等电点：11
表达定位：周质（periplasmic）
纯化策略：渗透压休克提取周质，阳离⼦交换去除⼤部分杂质，疏⽔作⽤⾊谱进⼀步去除杂质，最后⽤凝胶过滤分离。例⼆、重组表达的α-淀粉酶分⼦量：；等电点：~6
先采⽤阴离⼦交换，再进⾏疏⽔作⽤⾊谱，最后进⾏凝胶过滤。例三、重组表达的⼄型肝炎表⾯抗原的分离1、史克公司：（酵母细胞表达）
破碎细胞，表⾯活性剂抽提，离⼼沉淀、超滤，再经凝胶过滤、阴离⼦交换，超速离⼼纯化，脱盐，除菌过滤，吸附，分装。2、Merck公司：（酵母细胞表达）
破碎细胞，去碎⽚，抗原⽤多孔硅玻璃吸附，洗脱，凝胶过滤，甲醛处理，明矾吸附，疫苗。3、巴斯德研究所：（CHO细胞表达）
培养上清液，离⼼去碎⽚，50%硫酸铵沉淀，离⼼，50%KBr处理，脱盐、超滤浓缩、SepharoseCL-4B凝胶柱分离。4、Below，⼯艺
破细胞，去碎⽚，加硫酸铵⾄⼀定浓度后，直接上Butyl-Sepharose4FF疏⽔柱，脱盐后上DEAE-SepharoseFF，超滤浓缩后上Sepharose4FF凝胶过滤柱。例四、尖吻蝮蛇毒凝⾎酶样酶的分离（注射⽤降纤酶）分⼦量：38kD；等电点：~
原⼯艺：阴离⼦交换，凝胶过滤，第⼆次阴离⼦交换，凝胶过滤达到95%以上纯度，产量6000-10000单位/克蛇毒。(两周)新⼯艺：亲和⾊谱，阴离⼦交换，凝胶过滤，亲和⾊谱（⼀周）纯度达到%以上，产量达20000-25000单位/克蛇毒。
尖吻蝮蛇毒经过五个步骤的分离纯化后，获得了单成分降纤酶组分，电泳为⼀条带，HPLC为单峰。
如上图所⽰，由于每⼀个步骤均会带来⼀定的损失，故在可能的情况下应尽量减少下游纯化的步骤（在保证达到所需纯度的前提下）。
重组蛋⽩纯化的基本策略⼀、融合表达蛋⽩的纯化：
融合表达蛋⽩可以在原⽬标分⼦之外带有GST肽段或（His）6肽段，从⽽使得可以分别⽤GlutathioneSepharose凝胶或
ChelatingSepharose凝胶进⾏亲和⾊谱分⼦，⼀步可以达到~90%的纯度，经过特异蛋⽩酶切后，再进⾏离⼦交换及⾼分辨凝胶过滤⼀般便可以达到所需的纯度（95~99%）。⼆、包含体表达蛋⽩的纯化：
在系统表达重组蛋⽩，表达量⾼时，常形成包含体，包含体易于与细胞其他组分分离，但需要注意的是蛋⽩复性的步骤。⼀般采⽤盐酸胍溶解包含体蛋⽩后，⽤稀释的办法进⾏复性，也可以利⽤凝胶过滤⾊谱进⾏复性（已有多种凝胶可以促进蛋⽩质的复性的报道）。以下以rhGM-CSF（重组⼈粒细胞-巨噬细胞集落刺激因⼦）的下游纯化⼯艺为例：
细胞，超声破碎，离⼼收集包含体，⽤7mol/L盐酸胍溶解包含体蛋⽩，作1：70稀释使蛋⽩复性，加硫酸铵⾄⼀定浓度后，上样于Phenyl-Sepharose6FF （highsub）⾊谱柱，活性组分再上Q-SepharoseFF进⾏离⼦交换，最后上
Superdex75prepgrade凝胶进⾏凝胶过滤⾊谱，最终获得了纯度较⾼的rhGM-CSF，同时，DNA及内毒素去除率均很⾼。如下表所⽰：
三、周质表达的蛋⽩的纯化：
可⽤渗透压休克⽅法，使周质释放，然后利⽤扩张床技术将含有菌体的悬液直接上柱（STREAMLINE系列凝胶），菌体穿过⽽表达的蛋⽩上柱。各种⾊谱的主要影响因素⼀、凝胶过滤⾊谱：
⼀般来说，凝胶过滤⾊谱的结果好坏直接取决于凝胶柱的柱效（每⽶多少理论塔板数），⽽影响柱效的因素主要有：1、凝胶本⾝性质：
每⼀种凝胶均有其合适的分离范围，应选择合适的凝胶进⾏分离。同样分离范围的凝胶颗粒越细的，柱效越⾼。2、⾊谱柱装填的好坏：
凝胶过滤⾊谱柱装填完后，⼀般可以⽤丙酮（或NaCl）测定柱效和峰对称性，⼀般对于平均颗粒直径在30~34微⽶的
SuperosePG、SuperdexPG系列凝胶，柱效应在9000以上，⽽颗粒平均直径在90微⽶的SepharoseFF凝胶柱效应在3000以上。通常，越是分辨率⾼的细颗粒凝胶对于装柱的技术要求越⾼。除了柱效以外，影响分离的因素主要有：
a、⾊谱柱的长短，⼀般较长的柱分离较好，L/D>20。但⼀般商⽤⾊谱空柱长100cm 左右，最多可以装到90~95cm⾼左右，如果仍不能取得满意的分辨率，可以⽤两根相同的凝胶柱，⽤SRTC-2接头连接后，可以提⾼分辨率40%。分离度正⽐于柱长的平⽅根。
b、样品浓度，在蛋⽩浓度⼩于50mg/ml并且粘度⼩于5cP（厘泊）的条件下，样品浓度对于分辨率影响较⼩。c、上样体积：
上样体积越⼩分辨越好，不同的凝胶具有不同的推荐上样体积，如下表：
对于利⽤SephadexG25进⾏蛋⽩质脱盐的特殊情形，样品量达到柱体积的25%仍可以保证蛋⽩与盐分开。d、洗脱流速：
⼀般较低的流速下（5~10cm/h）分辨率较⾼，但SuperdexPG，SepharoseFF等新型凝胶可以在较⾼的流速下分离⽽不致损失分离度。
⼆、离⼦交换⾊谱：a、凝胶本⾝的性质：分辨⼒SepharoseFF
DEAE：弱阴离⼦Q：强阴离⼦选择性有差异
CM：弱阳离⼦S：强阳离⼦选择性有差异b、⼯作缓冲液的pH值：
离⼦交换依赖于分⼦所带的电荷，故pH对其影响较⼤，往往~的改变就⾜以改变⾊谱结果，具体对于分离某⼀种蛋⽩，那⼀个pH最合适，需要进⾏⼤量的实验摸索。c、上样量：
⼀般保持在结合最⼤容量的20%以下可以获得较好的分辨率。但对于样品体积⽆限制。d、梯度形状：
梯度越平缓，分辨率越⾼，但同时样品越稀。c、流速：影响不⼤。三、疏⽔作⽤⾊谱：a、疏⽔凝胶本⾝的性质：基架：SepharoseFF
取代基疏⽔性：Phenyl苯基、Octyl正⾟烷基、Butyl正丁基、Ethyl⼄基、Iso 异丙基均不相同，选择性也不同。
相同的取代基，不同的取代程度：如PhenylSepharose6FF（Lowsub）与PhenylSepharose6FF（Highsub）疏⽔性不同，选择性也不同。b、盐类：
⼀般常使⽤硫酸铵、硫酸铵，其他盐类也可使⽤，具体应根据实验情况决定。c、温度：温度升⾼，疏⽔作⽤增强。d、pH值：在接近中性的范围内，影响不⼤。e、样品体积：⽆影响。
f：流速：在压⼒许可下，⽆明显影响。g、样品浓度：在粘度不超过5cP下，⽆影响。h、梯度：较缓的梯度分辨较好。四、⼀些蛋⽩质的分⼦量与Stokes半径：
凝胶过滤⾊谱柱装填完后，⼀般可以⽤丙酮（或NaCl）测定柱效和峰对称性，⼀般对于平均颗粒直径在30~34微⽶的SuperosePG、SuperdexPG系列凝胶，柱效应在9000以上......应该这样test⼏点补充：
1、凝胶柱，假如进⾏的仅是“组别分离”，则不测柱效也没关系，⽐如采⽤SephadexG-25对蛋⽩样品脱盐，或者⽬的蛋⽩与杂质分⼦量相差10倍以上。
2、需要⾼分辨的分离，杂质和⽬的蛋⽩相差2倍以下，则柱效⾼才有分离很好的把握。
3、测量柱效的⽅法，⼀般采⽤1%丙酮或1mol/LNaCl作为样品，进⾏分离（上样体积与所⽤凝胶种类相关），AKTA系列液相⾊谱仪可以⾃动在积分后得出每⽶的塔板数。
我在做⼀个包含体复性的蛋⽩纯化，⽤的是GSTpurificationGlutathionesepharose4B.可是发现：在蛋⽩和凝胶哺育半⼩时装柱后，我的蛋⽩还是很多在没来及⽤elutionbuffer，只⽤pbs洗柱⼦的时候就脱下来了，不知道是怎么回事啊，是不是盐浓度太低？
⼏点补充：
1、凝胶柱，假如进⾏的仅是“组别分离”，则不测柱效也没关系，⽐如采⽤SephadexG-25对蛋⽩样品脱盐，或者⽬的蛋⽩与杂质分⼦量相差10倍以上。
2、需要⾼分辨的分离，杂质和⽬的蛋⽩相差2倍以下，则柱效⾼才有分离很好的把握。
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容