人血管内皮细胞生长因子受体Flt-1胞外区cDNA在毕赤酵母中的表达和鉴定

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人血管内皮细胞生长因子受体!\"#$!胞外区%&’(在

毕赤酵母中的表达和鉴定

马骊\"张智清周小明曾革非陈爱君姚立红王小宁\"

（中国预防医学科学院病毒学研究所

北京!）%%%3$

摘

将编码血管内皮细胞生长因子受体4)50!胞外区!02)((!\"个氨基酸残基的78+9插入到含9:;!启62

动子和!分泌信号肽序列的3构建了重组表达质粒6／（），转化酵母宿主菌#0\"#+4+&/(*#&酵母载体中，4)50!!02<=>/?

要

ED表型转化子，，筛选B经摇瓶培养，培养上清中4@A!!3CDF-5!G甲醇诱导表达#H后，A8A0<9@I结果显示，)50!（）表达量达总蛋白的2表达产物具有良好的抗原性和特异性。生物!02%G以上。IJ=A9及KLD5LMNO)(5实验表明，学活性检测证实其具有结合’I@4的能力和抑制’I@4对BP’I>细胞的促增殖功能。

关键词血管内皮生长因子，受体，毕赤巴斯德酵母，表达

文献标识码9

文章编号!（）%%%02%\"!$%%%%#0%##&0%#

中图分类号Q1!$

血管内皮细胞生长因子（’受体4I@4）)50!属酪氨酸蛋白激酶受体家族第三亚型，是分子量约为分为胞外区、跨膜区和胞内区三!1%R8的糖蛋白!，个部分，其中胞外区负责与配体结合，具有&个免疫球蛋白样袢（），配体结合域位于氨基端2=0)CRL)((S6

［］$个)((6内。

由于’I@4具有促血管内皮细胞增殖及促新生血管形成的功能，在肿瘤及糖尿病性视网膜病变等血

［］

限制酶、@IF0U载体、U#连接酶及UV+9聚合6W8

酶购自燕芳博士惠赠。酵母表达载体6<=>/?及宿主菌、@A!!3购自=NYC5M(LN公司。酵母培养基（K／为8其它试剂均为国产Z+[:）C\\7(公司产品，或进口分析纯。

)*+目的基因片段的扩增

引物由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物：3]0U9@99UU>9U@U>U9@UU>9@@UU>990，引入6下游引物：0(T=位点，3]0U9@>@@>02]

，引入7>@>U9UU99U@UUU>9>9@U@9U02](/=位点。以人心肌细胞78+9文库为模板，<>T扩增条件为/，，，共2#^#3D\"1^#3D&$^\"%D%个循环，最后延伸!。%XCN

)*,重组质粒的构建

将<转化宿主菌@IF0U载体，>T产物插入6，提取质粒，以68B3!8+9测序正确后，0(T=及

回收/插入6<=>/?的相7(/=双酶切，#1O6片段，，提取质粒，酶同位点，连接产物转化宿主菌8B3!切鉴定。

)*-质粒转化酵母宿主菌

按文献［#］方法将酵母菌@A!!3制备成感受态，取出1%J与3\"!%,==线性化的重组表达S.1##质粒混合，转入%冰浴3，于[_$7X电转杯，XCNC(0

管生成相关疾病的发病过程中起重要作用，可通过拮抗’I@4的作用来治疗这些疾病。可溶性受体D4)50!通过与血管内皮细胞表面的受体竞争结合’，阻I@4断其生物学活性，抑制肿瘤的生长和转移及视网膜新生血管形成，具有潜在的临床药用开发价值。

甲基营养型酵母表达系统是一种新型外源基因表达系统，兼有原核细胞良好的可操作性和真核系

［］2。我们利用<统的翻译后加工的双重特点>T技

术，从人心肌细胞78+9文库中扩增出/#1O6的并克隆于354)50!胞外!\"2)((+&/(*#&6基因片段，4酵母表达载体6实现了4（）基因的高<=>/?，)50!!02效分泌性表达。

)材料和方法

菌株、细胞株、酶和主要试剂)*)质粒、

大肠杆菌8B3!BP’I>细胞株由本室保存。

收稿日期：，修回日期：。!///0%10%\"$%%%0%20$&基金项目：国家高技术研究发展计划资助项目（）。!%$0%10%!0%2现地址：中国人民解放军第一军医大学分子免疫学研究所，广州3。\"!%3!3

卷

，!\"#$%&%’()*%+电转仪,-../，0-10..\"条件下!

转化，然后将菌液涂布于23／（,，456*789:;<=9

?-，，）选择平板>,.:=6@A6&0:3%BA+@*%,7-:C\"+D上，，观察转化子的生长。8.E孵育0#8#

重组质粒的构建如图,。’（O!扩增的1)A4,,4）基因片段长度为X，与预计的大小相符，插入89\\VP

转化宿主菌3，提取质粒，$R24[载体，5-$3序列分析证实与国外文献报道一致。重组质粒／（）经#得’SOX]1)A4,,48$%!SF&%’S双酶切鉴定，P

）。到相应片段（图0+\"+重组蛋白的表达

转化子经22和23选择平板两次筛选，获得

!\"#转化子表型的筛选

F*表型转化子。将转化菌落分别筛选56*2(A

?-）对应地点在22［，（，,789:;<=9>,.:=6@A6&

，］和23选择平板上，筛.7-:2%AG\"&@),7-:C\"+D

选在22平板上生长缓慢而在23平板上生长良好的菌株作为表达株。

!\"$转化子的%&’检测

接种单菌落于,加入-.H无菌水中，HHA64I!!（／），，再置液氮中,，室J\"*%-(8.E孵育,.K6&K6&H!

温下解冻后用作模板，以$41\"JA@+和8LCMN,引物作’O!检测。

!\"(表达菌株的诱导表达

接种单菌落于,［,..KH=2$;培养基:，，／;%\"*A%BA+\"JA0:’%A@&,..KK@)H’@A\"**6(KP

?-），，，（，G@*G\"A%5Q7.,789:;<=9>,.:=6@A6&PPP］于8，离心收集,:$)J%+@).E培养至!\"Q97.I..!

菌体，用0［=.KH=22;培养基2$;中的,:$)I］重悬培养，每日取样,J%+@)换为,:2%AG\"&@)KH，并补加甲醇于培养基至终浓度为,诱导表达Q:，，离心收集上清，#?0.E保存。!\")表达产物的免疫学鉴定

［-］。兔RHSTC及U%*A%+&V)@A方法参见文献抗人1（）多抗是本室以原核表达纯化的1)A4,,48)A4,（）免疫家兔制备的。,48!\"*生物学活性检测

!\"*\"!1)A4,对/R$1的固相结合实验：将1)A4,表达上清用包被液在酶标板上倍比稀释，9E包被过夜，每孔加+（浓度约为,／，G/R$1,..H-.KH）D!!然后依次加,W-..鼠抗人G/R$1单抗,W0..5!’标记的羊抗鼠S最后加,避光显色$，..H底物液，D!

用R／0.K6&后，HSTC检测仪读取!\"9’<\"X.值，07,为阳性。

!\"*\"+1)A4,对/R$1生物学活性的影响：将1)A4

每孔加入,表达上清在XQ孔板上倍比稀释，（9／G/R$1.&KH）-.H，然后加入5Y/R$OD!

于8，然后用,..H，ZE、-:OMQG0条件下培养8!2[[法测定结果。

+实验结果

+\"!重组质粒的构建和鉴定

在毕赤酵母中的表达和鉴定

$#表型转化子，正确整合的!约占总菌落的\"#%&’

提取菌体+用!()*，,-，./01’23和(4-567引物

作8得到7表明转9:检测，;<=>?大小的特异片段，化子基因组中确实整合有/（7基因。A@’.7.(）+A.甲8-BC分析甲醇诱导时间对表达量的影响发现，

即有表达产物出现，但表达量较低，醇诱导第7天，

随着表达时间的延长，表达量也逐步增高，到第D天达到高峰，经双波长薄层扫描，表达量最高可达上清总蛋白的(（图(）。)*以上

,%2

生物工程学报

$(卷

与宿主染色体的同源区发生双交换，取代宿主染色

［］%体!编码区。另一种是载体线性化后不产生\"#$

由此推测本研究获得的表达株可能仅含单拷贝外源基因。至于各个阳性克隆之间表达水平存在差异的确切原因还不清楚，可能是基因整合时，宿主非同源区基因结构发生改变所致。

本文成功地利用酵母表达载体在$%&’%()(*+,-.%*高效表达了可溶性人血管内皮生长因子受体

并证实其具有93456$胞外$6’477:;3结合8片段，活性和抑制9这对:;3对)<9:=的促增殖功能，进一步研究其在肿瘤、糖尿病性视网膜病变等血管生成相关疾病的治疗应用奠定了基础。

游离的!端和’端，与宿主染色体发生单交\"#&&$%

［］(，或整合入!位点，或整合入)换整合\"#*+,位$

点。一般来讲，整合的拷贝数越多，表达量越

［，］-.高，但不是绝对的，有时单拷贝和多拷贝对表达［］/量没有影响，甚至多拷贝引起表达量下降。本研

究采用!表达框架#00单酶切使表达载体线性化，\"与宿主基因组发生双交换而整合于染色体中。文献报道单交换转化效率比双交换高，且易得到多拷贝

［2］

整合，多拷贝整合发生的机率约为$，1!$21$

参考文献

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