亮菌多糖对GES-1细胞发生EMT的影响及机制研究

安徽医科大学学报　ＡｃｔａＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓＭｅｄｉｃｉｎａｌｉｓＡｎｈｕｉ　２０１８Ｊｕｎꎻ５３(６)

网络出版时间:２０１８－５－２３１４:１２　网络出版地址:ｈｔｔｐ://ｋｎｓ.ｃｎｋｉ.ｎｅｔ/ｋｃｍｓ/ｄｅｔａｉｌ/３４.１０６５.Ｒ.２０１８０５２２.１５００.００９.ｈｔｍｌ

亮菌多糖对ＧＥＳ￣１细胞发生ＥＭＴ的影响及机制研究

赵莉莉ꎬ朱耀东ꎬ李　平ꎬ张　梅

摘要　目的　探讨亮菌多糖(ＡＴＰＳ)对人胃黏膜上皮细胞(ＧＥＳ￣１)发生上皮－间质转化(ＥＭＴ)的影响及相关机制ꎮ方法　利用ＩＬ￣８诱导ＧＥＳ￣１细胞建立ＥＭＴ模型ꎬ实验设空白对照组、模型组(ＩＬ￣８诱导组)、实验组[ＡＴＰＳ低剂量组胃癌前病变过程中ꎬ与多种信号通路及基因表达失调有关ꎬ其主要表现为细胞形态学变化及相关蛋白异常表达ꎬ胃黏膜上皮细胞由不规则多边形向梭形转变ꎬ细胞之间黏连减少ꎬ排列紊乱ꎻ其标记上皮细(ＩＬ￣８诱导１诱导ｈ后加入１ｈ后加入ＡＴＰＳＡＴＰＳ６０ｍｇ３０/Ｌ)、ＡＴＰＳｍｇ/Ｌ)、ＡＴＰＳ高剂量组中剂量组(ＩＬ￣８(诱导

ＩＬ￣８１细胞形态学变化ｈ后加入ＡＴＰＳꎬＷｅｓｔｅｒｎ１２０ｍｇ/Ｌ)]ꎮｂｌｏｔ法检测应用光学显微镜观察ＥＭＴ相关蛋白及ＧＥＳ￣１ＰＤ￣ＣＤ４胞存活率影响蛋白表达水平ꎬ细胞划痕实验检测各组ꎬＭＴＴ法检测不同浓度ＧＥＳ￣１ＡＴＰＳ细胞侵袭能力对ＧＥＳ￣１细变化ꎮ结果　光学显微镜观察到ＩＬ￣８作用２４ｈ后ＧＥＳ￣１细胞形态由不规则多边形向梭形转化ꎬ细胞排列紊乱ꎬ侵袭能力增强ꎬ不同剂量亮菌多糖作用后细胞形态可部分恢复ꎬ侵袭能力降低ꎮＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果提示:与模型组相比ꎬ实验组上皮标记物Ｅ￣钙黏蛋白增多(Ｐ<０􀆰０５)ꎬ间质标志物Ｎ￣钙黏蛋白、波形蛋白减少(Ｐ<０􀆰０５)ꎬＰＤＣＤ４表达增多(Ｐ<０􀆰比侵袭扩散能力明显增强０５)ꎮ细胞划痕实验观察到模型组ꎬ实验组与模型组相比侵袭扩散能ＧＥＳ￣１细胞与空白组相力明显减弱ꎮ结论　ＡＴＰＳ可通过抑制ＧＥＳ￣１细胞ＥＭＴ的发生逆转胃癌前病变ꎬ其机制可能与促进抑癌基因ＰＤＣＤ４表达有关ꎮ

关键词　亮菌多糖ꎻ胃黏膜上皮细胞ꎻＥＭＴ中图分类号　Ｒ７３５􀆰２

文献标志码Ａ文章编号１０００－１４９２(２０１８)０６－０８６８－０７ｄｏｉ:１０.１９４０５/ｊ.ｃｎｋｉ.ｉｓｓｎ１０００－１４９２.２０１８.０６.００９

　ｔｉｏｎꎬ　上皮的生物学过程ＥＭＴ)－是指上皮细胞转化为具有间质表型细胞间质转化(ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ￣ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｔｒａｎｓｉ￣

ꎬ在胚胎发育、伤口愈合、组织再生、明ꎬＥＭＴ与胃癌的发生发展息息相关ꎬꎮ广泛存在于

研究器官纤维化和肿瘤进展中起重要作用[１][２]表２０１８基金项目－０３:－国家自然科学基金１４接收

(编号:８１６０３４３９)ꎻ安徽省中医药科技

项目(编号:２０１６ｚｙ８６)

作者单位:安徽医科大学第一附属医院中西医结合肿瘤科ꎬ合肥　作者简介:赵莉莉２３００２２

ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎻ

张　梅ꎬ女ꎬ教授ꎬ主任医师ꎬ硕士生导师ꎬ责任作者ꎬＥ￣ｍａｉｌ:２２３９８２４９４１＠ｑｑ.ｃｏｍ胞的Ｅ￣钙黏蛋白(Ｅ￣Ｃａｄｈｅｒｉｎ)表达减少ꎬ标记间质细胞的ｔｉｎ)Ｎ￣钙黏蛋白(Ｎ￣ｃａｄｈｅｒｉｎ)、波形蛋白ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓꎬＡＴＰＳ)表达增多ꎮ亮菌多糖(Ａｒｍｉｌｌａｒｉｅｌｌａｔａｂｅｓｃｅｎｓ(Ｖｉｍｅｎ￣ｐｏｌ￣产物ꎬ是亮菌口服液的有效成分是亮菌生长代谢过程中的有效ꎬＡＴＰＳ有明显的增强机体免疫力、抗肿瘤及保护胃黏膜的作用[３]菌口服液临床广泛用于治疗慢性浅表性、萎缩性胃ꎮ亮炎ꎬ并取得了较好的疗效ꎬ有效的逆转胃癌前病变ꎬ控制了疾病的进展(ｈｕｍａｎ的影响及相关机制研究ｇａｓｔｒｉｃｅｐｉｔｈｅｌｉａｌꎮ关于亮菌多糖对人胃黏膜细胞ꎬｃｅｌｌ相关研究报道较少ｌｉｎｅꎬＧＥＳ￣１)发生ꎮ该研ＥＭＴ究利用白介素￣８(ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ￣８ꎬＩＬ￣８)诱导ＧＥＳ￣１细胞建立ＥＭＴ模型ꎻ不同剂量亮菌多糖作用后细胞形态可部分恢复ꎬ侵袭力降低ꎮ１　材料与方法

１.１　实验仪器　细胞培养箱购自美国Ｔｈｅｒｍｏ公司ꎻ安全生物柜购自北京Ａｅｒｔａｉ公司ꎻＤＭＥＭ培养基Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、胰酶购自美国制药有限公司ＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓＧｉｂｃｏ(纯度公司公司>９０％ꎻＡＴＰＳꎻ胎牛血清购自以色列)ꎻＩＬ￣８购自合肥诚志生物及ＩＬ￣８溶解套装购自美国Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ公司ꎬ溶解稀释成２５ｍｇ/Ｌꎬ分装后Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ＰＤＣＤ４－２０℃保存ꎻｎｏｌｏｇｙｌｉｆｅ生物公司ꎻ抗体购自美国兔抗人Ｅ￣Ｃａｄｈｅｒｉｎ、鼠抗人ＧＡＰＤＨＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＮ￣ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｔｅｃｈ￣基亚砜ｓｃｉｅｎｃｅｓ(ＤＭＳＯ)公司购自美国ꎻ二抗购自美国ＳｉｇｍａＰｒｏｍｅｇａ抗体购自上海公司ꎻ四甲基偶氮公司ꎻ二甲ＢＢＩ

唑盐(ＭＴＴ)、细胞裂解液购自合肥ｂｉｏｓｈａｒｐ公司ꎮ１.２　实验方法　

１.２.１　细胞培养　人胃黏膜上皮细胞ＧＥＳ￣１株购自南京科佰生物科技有限公司ꎬ在细胞培养室的超净工作台上(箱中含１０％ꎬ将ＧＥＳ￣１细胞置于ＤＭＥＭ培养液中３７℃胎牛血清、５％ＣＯꎬ１％２培养双抗ꎮ当培养皿中细胞生长近

)ꎬ将培养皿置于培养安徽医科大学学报　ＡｃｔａＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓＭｅｄｉｃｉｎａｌｉｓＡｎｈｕｉ　２０１８Ｊｕｎꎻ５３(６)

􀅰８６９􀅰

８０％细胞基本融合时ꎬ用浓度为０􀆰２５％胰蛋白酶察到细胞变圆、散开时ꎬ１∶１加入ＤＭＥＭ培养液终继续培养ꎮ

３７℃、５％ＣＯ２培养箱内消化２~３ｍｉｎꎬ显微镜下观止消化ꎬ８００ｒ/ｍｉｎ离心３ｍｉｎꎬ重悬后分装至３小皿１.２.２　建立ＥＭＴ模型　生长至对数期的ＧＥＳ￣１细胞ꎬ加入含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ完全培养基在３７℃、５％ＣＯ２的条件下培养１２ｈꎬ待细胞完全贴壁ꎬ２５、５０、１００、２００、３００μｇ/Ｌ的ＩＬ￣８作为实验组ꎻ对照更换培养基为１％ＦＢＳ的ＤＭＥＭꎬ分别加入浓度为

ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基１􀆰５ｍｌꎬ模型组加入ＩＬ￣８２００入ＩＬ￣８２００μｇ/Ｌ含１％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基１􀆰５１００倍下观察、划痕两侧细胞的迁移情况ꎬ放入３７

μｇ/Ｌ含１％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基１􀆰５ｍｌꎬ实验组加ｍｌ培养１ｈ后加入ＡＴＰＳ１２０ｍｇ/Ｌꎬ在倒置显微镜℃、５％ＣＯ２培养箱内培养ꎬ分别于０、６、１２、１８、２４ｈ异ꎬ实验重复３次ꎮ

１.２.７　Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测ＥＭＴ相关蛋白及ＰＤ￣ＣＤ４蛋白的表达　将处理后细胞弃上清液ꎬ加入细

镜下拍照测量划痕宽度ꎬ比较各组间划痕愈合的差

组更换正常培养基ꎬ继续培养２４ｈꎮ

１.２.３　ＭＴＴ法检测不同浓度亮菌多糖对ＧＥＳ￣１细胞增殖的影响　取对数生长的ＧＥＳ￣１细胞消化计３７数后接种于９６孔细胞培养板中ꎬ８􀆰０×１０３个每孔ꎬＡＴＰＳ℃、５％别加入各孔中用ＤＭＥＭＣＯ２温室培养ꎬ每孔稀释成０.１１５、３０、６０、１２０、２４０１２ｈ细胞长成单层ｍｌꎬ每一稀释度设置ｍｇ５/个复Ｌꎬ将分孔ＤＭＳＯꎬ同ＭＴＴ(５组时ꎮ设３７立℃空、５％白对照ＣＯ组、ＤＭＳＯ处理组及仅加２温育２４ｈ培养ｍｉｎꎬ液ꎬｇ然/Ｌ)１０后每孔加入后每μｌ孔后继续孵育内加入１５０４ｍｌｈꎬ小心吸净各孔内ＤＭＳＯꎬ震荡值ꎬ计算各组细胞的相对存活率并绘制柱状图酶标仪测其波长４９０ｎｍ吸光度ꎬ各组均取平均１０ꎮ以空白组为零ＤＭＳＯ组ＯＤꎬ抑制率(％)＝１－(给药组ＯＤ值ＯＤ－值)×１００％ꎬ实验重复值)/(空３白遍组ꎮ

ＯＤ值－ＤＭＳＯ组１ＥＭＴ.２.４的影响　亮菌多糖对　ＧＥＳ￣１细胞随机分为ＩＬ￣８诱导的ＧＥＳ￣１５细胞发生３复孔ꎮ分别设空白对照组、模型组、实验组组ꎬ每组至少(外高、中、低剂量)组[ＡＴＰＳＩＬ￣８ꎬ其余各组预先更换为]ꎮ待细胞贴壁后除空白对照组(３０、６０、１２０２００μｇ/ｍｇＬ孵育/Ｌ)的亮菌多糖继续孵育１ｈ后１％ꎬ实验组给予不同浓度ＦＢＳ的ＤＭＥＭ并给予１.２.５　光学显微镜观察细胞形态变化　２４取不同浓ｈꎮ度ＩＬ￣８诱导２４ｈ后的ＧＥＳ￣１细胞显微镜下拍照ꎬ每孔取４个视野ꎻ同样的方法对亮菌多糖处理后的各组细胞在光学显微镜下拍照ꎮ

１.２.６　细胞划痕实验　先用记号笔在６孔板背后用直尺均匀划横线ꎬ每孔至少穿过５条线ꎬ将对数期生长的ＧＥＳ￣１细胞胰蛋白酶消化、１０％ＭＤＥＭ重悬ꎬ每孔内加入约８×１０５个细胞ꎬ以过夜能铺满孔底为最好ꎬ３７℃、５％ＣＯ胞融合达到９０％以上ꎬ用２的条件下培养待细胞至细１００μｌ移液头在孔板内平行划痕ꎬＰＢＳ液洗涤３次后ꎬ空白对照组加入１％胞裂解液(８０~１００μｌ)ꎬ充分搔刮孔底后收集样本ꎬ１０％沸水煮样分离胶１０ꎬｍｉｎꎬ每孔上－２０样℃１０冻存备用μｌꎬ９０Ｖꎮ恒５％压浓缩胶电泳２０ꎬｍｉｎꎬ１５０ｍｉｎꎬ调整电压将蛋白转至１５０Ｖ电泳ＮＣ膜上６０ｍｉｎꎻꎻ用５０恒流ｍｇ３５０/Ｌ的脱脂奶ｍＡ转膜粉封闭３００)、Ｎ￣ｃａｄｈｅｒｉｎ(１１ｈꎬ加入一抗∶５００)、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ(１４℃孵化过夜ꎬＥ￣Ｃａｄｈｅｒｉｎ(１:ＣＤ４(１∶５００)、ＰＤ￣

(化共洗１ｈꎬＴＢＳＴ５∶次５００)、ＧＡＰＤＨ(１ꎬ每次∶１０００)ꎬＴＢＳＴ洗去一抗洗去二抗７ｍｉｎ)ꎬ(共洗加二抗５次(１ꎬ每次∶１０７０００)ｍｉｎ)ꎬＥＣＬ室温孵发光试剂Ａ液:Ｂ液１∶１混合后均匀滴在条带上ꎬ使用ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＬＡＳ４０００系统显影ꎬＩｍａｇｅ￣Ｐｒｏ￣Ｐｌｕｓ软件进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ条带灰度值分析ꎮ

１.３　统计学处理　采用ＳＰＳＳ１６􀆰０软件进行统计

分析ꎬ数据以􀭰ｘ±ｓ表示ꎬ组间比较用单因素方差分０􀆰析０５(ｏｎｅ￣ｗａｙ为差异有统计学意义ＡＮＯＶＡ)ꎬ组内两两比较用ꎮχ２检验ꎬＰ<

２　结果

２.ｈ１　观察ＥＭＴ模型细胞形态变化　ＩＬ￣８诱导２４

向梭形转变后ꎬＧＥＳ￣１ꎬ细胞形态由不规则多边形细胞排列疏松紊乱ꎬ细胞间粘连度减、易聚集成片小ꎬ随ＩＬ￣８浓度越大ꎬ细胞形态变化越明显ꎬ见图１ꎮ

２.２　Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测ＩＬ￣８诱导的ＧＥＳ￣１细胞ＥＭＴ相关蛋白表达变化　结果显示ꎬ其标记上皮细胞的ｈｅｒｉｎ、ＶｉｍｅｎｔｉｎＥ￣Ｃａｄｈｅｒｉｎ情况及结合形态学变化表达增多表达减少ꎬꎬ选择综合ꎬ标记间质细胞的ＩＬ￣８３种蛋白表达量变化Ｎ￣ｃａｄ￣２００μｇ/Ｌ诱导建

立ＥＭＴ模型ꎬ见图２ꎮ

２.３　ＭＴＴ检测ＡＴＰＳ对ＧＥＳ￣１细胞存活率的影响　不同浓度ＡＴＰＳ处理ＧＥＳ￣１细胞２４、４８ｈ后ꎬ相同作用时间不同浓度之间用χ２检验ꎬ相同浓度不同作用时间组间行ｔ检验ꎮＭＴＴ结果提示:同一浓度下ꎬ随着药物作用时间增加ꎬ对细胞的抑制作用增

􀅰８７０􀅰

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图１　ＩＬ￣８诱导ＧＥＳ￣１发生ＥＭＴ转变细胞形态的变化　×１００

Ａ:空白对照组ꎻＢ:ＩＬ￣８２５μｇ/ＬꎻＣ:ＩＬ￣８５０μｇ/ＬꎻＤ:ＩＬ￣８１００μｇ/ＬꎻＥ:ＩＬ￣８２００μｇ/ＬꎻＦ:ＩＬ￣８３００μｇ/Ｌ

图２　Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测各组细胞中Ｅ￣Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ￣Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ的表达

　　１:空白对照组ꎻ２:ＩＬ￣８２５μｇ/Ｌꎻ３:ＩＬ￣８５０μｇ/Ｌꎻ４:ＩＬ￣８１００μｇ/Ｌꎻ５:ＩＬ￣８２００μｇ/Ｌꎻ６:ＩＬ￣８３００μｇ/Ｌꎻ与空白对照组比较:∗Ｐ<０􀆰０５ꎬ

∗∗∗

Ｐ<０􀆰００１

强ꎬ差别有统计学意义ꎻ同一时间点ꎬＡＴＰＳ浓度的增加对ＧＥＳ￣１细胞增殖的抑制作用的差异无统计学意义(Ｐ>０􀆰０５)ꎮ见图３ꎮ

２.４　观察ＡＴＰＳ逆转ＧＥＳ￣１细胞ＥＭＴ后细胞形态的变化　和空白对照组相比ꎬ模型组ＧＥＳ￣１细胞形态明显由多边形向梭形转表ꎬ细胞排列疏松紊乱ꎬ细胞间粘附力降低ꎬ实验组和模型组比较ꎬ细胞形态向多边形转变ꎬ细胞之间出现片状粘连ꎬ生长状态好转ꎬ见图４ꎮ

２.５　ＡＴＰＳ逆转ＧＥＳ￣１细胞发生ＥＭＴ相关蛋白表达变化　Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示实验组与模型组相比上皮细胞的Ｅ￣Ｃａｄｈｅｒｉｎ表达增加ꎬ标记间质细胞的Ｎ￣ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ表达减少ꎬ见图５ꎮ

　　与处理４８ｈ组比较:∗Ｐ<０􀆰０５ꎬ∗∗Ｐ<０􀆰０１

􀭰图３　不同浓度ＡＴＰＳ用于ＧＥＳ￣１细胞的存活率(ｘ±ｓꎬｎ＝３)

２.６　ＡＴＰＳ逆转ＧＥＳ￣１细胞发生ＥＭＴ的机制探讨

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图４　不同浓度ＡＴＰＳ逆转ＩＬ￣８诱导的ＧＥＳ￣１细胞发生ＥＭＴ的细胞形态变化　×１００

Ａ:空白对照组ꎻＢ:ＩＬ￣８２００μｇ/ＬꎻＣ:ＩＬ￣８２００μｇ/Ｌ＋ＡＴＰＳ３０ｍｇ/ＬꎻＤ:ＩＬ￣８２００μｇ/Ｌ＋ＡＴＰＳ６０ｍｇ/ＬꎻＥ:ＩＬ￣８２００μｇ/Ｌ＋ＡＴＰＳ１２０ｍｇ/Ｌ

图５　Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测ＡＴＰＳ作用前后ＥＭＴ相关蛋白变化

　　１:空白对照组ꎻ２:ＩＬ￣８２００μｇ/Ｌꎻ３:ＩＬ￣８２００μｇ/Ｌ＋ＡＴＰＳ３０ｍｇ/Ｌꎻ４:ＩＬ￣８２００μｇ/Ｌ＋ＡＴＰＳ６０ｍｇ/Ｌꎻ５:ＩＬ￣８２００μｇ/Ｌ＋ＡＴＰＳ１２０ｍｇ/Ｌꎻ与ＩＬ￣８２００μｇ/Ｌ比较:∗Ｐ<０􀆰０５

为进一步探讨可能机制ꎬＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测程序性细胞死亡因子ＰＤＣＤ４蛋白表达量ꎬ结果显示ꎬ模型组ＰＤＣＤ４表达明显减少ꎬ加入亮菌多糖后ꎬＰＤＣＤ４表达量增高ꎬ说明亮菌多糖逆转ＥＭＴ可能与调节ＰＤ￣２.７　细胞划痕实验结果　细胞划痕实验显示ＩＬ￣８使ＧＥＳ￣１细胞侵袭扩散能力增强ꎬ而ＡＴＰＳ可以显著抑制ＧＥＳ￣１细胞向周围扩散ꎬ抑制其侵袭和转移能力ꎬ见图７ꎮ３　讨论

　　亮菌又叫假蜜环菌ꎬ是一种兼食用与药用价值于一体的名贵真菌ꎬ从２００２年开始亮菌口服液应用

图６　Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测程序性细胞死亡因子ＰＤＣＤ４蛋白表达量　　１:空白对照组ꎻ２:ＩＬ￣８２００μｇ/Ｌꎻ３:ＩＬ￣８２００μｇ/Ｌ＋ＡＴＰＳ３０１２０ｍｇ/Ｌꎻ与ＩＬ￣８２００μｇ/Ｌ比较:∗∗∗Ｐ<０􀆰００１

ｍｇ/Ｌꎻ４:ＩＬ￣８２００μｇ/Ｌ＋ＡＴＰＳ６０ｍｇ/Ｌꎻ５:ＩＬ￣８２００μｇ/Ｌ＋ＡＴＰＳ

ＣＤ４表达量有关ꎬ见图６ꎮ

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图７　细胞划痕实验不同时间各组细胞向周围扩散的程度

Ａ:空白对照组ꎻＢ:ＩＬ￣８２００μｇ/Ｌ诱导组ꎻＣ:ＩＬ￣８２００μｇ/Ｌ＋ＡＴＰＳ１２０ｍｇ/Ｌꎻ１:０ｈꎻ２:６ｈꎻ３:１２ｈꎻ４:１８ｈꎻ５:２４ｈ

于临床ꎬ主要用于慢性肝炎、迁延性肝炎、慢性胆管炎和胆囊炎以及慢性、浅表性、萎缩性胃炎及放疗、化疗引起的白细胞减少的辅助治疗ꎬ取得显著的疗效ꎮ亮菌可降低化疗后大鼠胃肠道组织５￣ＨＴ的释放ꎬ可有效抑制顺铂化疗所诱发的胃节律性运动紊乱[４]ꎮ以亮菌发酵产物为主要成分的亮菌口服液临床上长期应用于慢性胃炎的治疗ꎬ取得显著的疗效ꎬ可以有效逆转慢性萎缩性胃炎ꎬ研究[５]表明ꎬ亮

菌口服液对反流液造成的胃黏膜损失有保护作用ꎬ其机制可能与降低了胃黏膜ＣＯＸ￣２含量相关ꎬ并且亮菌口服液可以通过修复受损胃黏膜的超微结构来起到保护作用[６]ꎮ大量临床案例及实验室研究表明慢性萎缩性胃炎属胃癌前病变ꎬ亮菌口服液可有效逆转胃癌前病变ꎬ降低胃癌的发生ꎮ其中亮菌口服液的主要有效成分ＡＴＰＳ起到重要的作用ꎬ亮菌多糖是由亮菌发酵产生的分子量１４５０００的杂多糖ꎬ

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由Ｌ￣木糖、Ｌ￣岩藻糖、Ｄ￣半乳糖、Ｄ￣葡萄糖和Ｄ￣甘露糖５种单糖组成ꎮ研究[７]表明ꎬ亮菌多糖可通过提高小鼠肠黏膜组织中表皮生长因子ＥＧＦ含量降低前列腺素２含量ꎬ从而对顺铂所致小鼠小肠黏膜损伤起到保护作用ꎮ亮菌多糖作为一种天然药物对人类的多种疾病疗效明显ꎬ多年以来ꎬ由于其分离纯化困难ꎬ分子结构不明确等各种因素了其发展和应用ꎬ本课题组与合肥诚志生物制药有限公司合作ꎬ提取了纯度较为可观的亮菌多糖ꎬ用于亮菌多糖在逆转胃癌前病变的过程作用的研究ꎮ

白的表达变化ꎬ结果显示ＩＬ￣８诱导的模型组较空白对照组明显降低ꎬ而亮菌多糖处理后ＰＤＣＤ４基本恢复到处理前水平ꎬ说明亮菌多糖逆转ＥＭＴ可能与使ＰＤＣＤ４高表达有关ꎬＰＤＣＤ４的表达受各种因素的调节ꎮＤＮＡ甲基化可明显抑制ＰＤＣＤ４的表达ꎬＧａｏｅｔａｌ[１０]使用ＤＮＡ甲基转移酶抑制剂５￣氮杂￣２￣脱氧胞苷阻断神经胶质瘤细胞中的甲基化ꎬＰＤＣＤ４基因表达明显提高ꎮ研究[１１]表明ꎬ多种微小ＲＮＡ(ｍｉＲ￣ＮＡ)与ＰＤＣＤ４的表达相关ꎬ其中ｍｉＲ￣２１与ＰＤＣＤ４表达呈明显负相关ꎬＷｅｎｅｔａｌ[１２]在食管鳞状细胞癌　习惯　既往研究认为胃癌的发病与家族史、Ｈ.ｐｙｌｏｒｉ感染、相关药物使用不当以及人体免、不良生活疫功能下降等因素密切相关ꎮ且胃癌的发生是一个慢性演变的过程ꎬ胃黏膜在各种因素的刺激下ꎬ从正常胃黏膜－浅表性胃炎－慢性萎缩性胃炎－肠上皮化生－异性增生逐步发展成胃癌ꎬ因此如何将胃癌抑制在发展阶段ꎬ如何有效逆转胃癌前病变成为亟待解决且意义重大的事情ꎮ随着分子生物学的不断发展ꎬ研究者开始从分子水平上进一步探寻胃癌前病变的发病及癌变机制ꎮ研究表明ꎬ在胃癌前病变的形成过程中ꎬＤＮＡ甲基化ꎬ微卫星不稳定性ꎬ端粒酶激活ＥＭＴꎬＥＭＴ的发生等占有重要的地位[８]ꎬ其生　、　发展过程中发挥关键性作用与胃癌前病变的形成过程密切相关[２]本研究表明ꎬ亮菌多糖可逆转ꎮ

ꎬ在胃癌发中１ＩＬ￣８诱导的ＧＥＳ￣

细胞的不规则多边形细胞ＥＭＴ的发生ꎬ不仅从形态学上使其恢复上皮ｉｎ、Ｎ￣ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎꎬ其实验证明ꎬ亮菌多糖可有效抑制表达均得到逆转ＥＭＴ相关蛋白Ｅ￣Ｃａｄｈｅｒ￣ＧＥＳ￣１细胞的扩散ꎬ细胞划痕侵袭能力ꎬ这可能与上皮细胞因子Ｅ￣Ｃａｄｈｅｒｉｎ表达增多有关ꎬＥ￣Ｃａｄｈｅｒｉｎ使细胞间相互粘附聚集ꎬ不易向远处扩散ꎬ连续观察２４ｈꎬ实验组较模型组细胞扩散程度明显减低ＥＭＴ细胞的扩散侵袭对胃癌前病变起治疗作用ꎬ本研究表明亮菌多糖可通过逆转ꎬ阻止癌变进程ꎬꎮ且可以抑制ＰＤＣＤ４作为一种ＧＥＳ￣１

新近发现的抑癌基因在多种肿瘤的发生发展中发挥重要的作用[９]

ＢＧＣ￣８２３中转染入过表达ꎬＹｕｅｔａｌ

在胃癌细胞株ＰＤＣＤ４的质粒ＧＳＣ￣７９０１ꎬ使ＰＤＣＤ４

和

ｍＲＮＡ物ＴＷＩＳＴ１、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、Ｅ￣Ｃａｄｈｅｒｉｎꎬ及蛋白均高表达ꎬ然后检测结果显示间质细ＥＭＴ特异性标志胞标志物ＴＷＩＳＴ１、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ蛋白及相应ｍＲＮＡ均降低ＰＤＣＤ４ꎬ而上皮细胞标志物Ｅ￣Ｃａｄｈｅｒｉｎ明显升高ꎬ表明糖逆转可逆转ＥＭＴ可能机制ＥＭＴꎬ本研究为了进一步研究亮菌多ꎬＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＰＤＣＤ４蛋

细胞株(ＴＥ￣１３)中转染反义ｍｉＲ￣２１使其表达明显减少ＴＥ￣１３ꎬ结果显示与对照组相比转染染反义细胞中ＰＤＣＤ４表达明显升高ꎬ且ｍｉＲ￣２１ｍｉＲ￣２１、

的ｍｉＲ￣２３ａ因２(ＢＴＧ２)和ｍｉＲ￣２７ａ等抑癌基因的表达来促进胰腺导管腺可协同抑制ＰＤＣＤ４、抗增殖基癌进展ꎬ增强其侵袭力ꎬ可作为生存期较短的可靠标志[１３－１４]降低ꎬ促进细胞增殖和转移ꎮｍｉＲ￣１８３过表达亦可使ꎬ在食管癌细胞中可通过ＰＤＣＤ４蛋白表达抑制磷脂酰肌醇３￣激酶(ＰＩ３Ｋ)￣蛋白激酶Ｂ(Ａｋｔ)通路来降低ｍｉＲ￣１８３表达ꎬ进而上调ＰＤＣＤ４[１５]研究表明ＡＴＰＳ逆转ＥＭＴ可能与调高ＰＤＣＤ４ꎮ表达本有关ꎬ但ＡＴＰＳ到底是通过何种机制上调ＰＤＣＤ４表达仍未清楚ꎬ下一步拟在基因水平进一步探讨相关机制及可能的信号表达通路ꎮ

参考文献

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ｗｉｔｈＷｕｐｒｅｃａｎｃｅｒｏｕｓＹꎬＦａｎＹꎬＪｉａｎｇｌｅｓｉｏｎＹꎬｅｔｏｆｇａｓｔｒｉｃａｌ.Ａｎａｌｙｓｉｓｃａｎｃｅｒｏｆｉｎｒｉｓｋｐａｔｉｅｎｔｓｆａｃｔｏｒｓｆｒｏｍａｓｓｏｃｉａｔｅｄ

Ｃｈｉｎａ:ａｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｓｔｕｄｙ[Ｊ].ＪＣａｎｃｅｒＲｅｓＴｈｅｒꎬ２０１３ꎬ９(２):

ｅａｓｔｅｒｎ

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２０５－９.

安徽医科大学学报　ＡｃｔａＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓＭｅｄｉｃｉｎａｌｉｓＡｎｈｕｉ　２０１８Ｊｕｎꎻ５３(６)

[１３]ＦｒａｍｐｔｏｎＡＥꎬＣａｓｔｅｌｌａｎｏＬꎬＣｏｌｏｍｂｏＴꎬｅｔａｌ.Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒ

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[９]　ＹｕＨꎬＺｅｎｇＪꎬＬｉａｎｇＸꎬｅｔａｌ.Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉｐｒｏｍｏｔｅｓｅｐｉｔｈｅｌｉ￣

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[１０]ＧａｏＦꎬＷａｎｇＸꎬＺｈｕＦꎬｅｔａｌ.ＰＤＣＤ４ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｉｎｇｌｉｏｍａｓｉｓ

ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈ５'ＣｐＧｉｓｌａｎｄｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎａｎｄｕｎｆａｖｏｕｒａｂｌｅｐｒｏｇｎｏ￣ｓｉｓ[Ｊ].ＪＣｅｌｌＭｏｌＭｅｄꎬ２００９ꎬ１３(１０):４２５７－６７.

[１４]ＦｒａｍｐｔｏｎＡＥꎬＣａｓｔｅｌｌａｎｏＬꎬＣｏｌｏｍｂｏＴꎬｅｔａｌ.ＭｉｃｒｏＲＮＡｓｃｏｏｐｅｒａ￣

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[１１]赵莉莉ꎬ张　梅ꎬ朱耀东.程序性细胞死亡因子４在肿瘤中的

研究进展[Ｊ].国际肿瘤学杂志ꎬ２０１７ꎬ４４(７):５１２－５.[１２]ＷｅｎＳＷꎬＺｈａｎｇＹＦꎬＬｉＹꎬｅｔａｌ.Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｅｆｆｅｃｔｓｏｆ

[１５]ＲｅｎＬＨꎬＣｈｅｎＷＸꎬＬｉＳꎬｅｔａｌ.ＭｉｃｒｏＲＮＡ￣１８３ｐｒｏｍｏｔｅｓｐｒｏｌｉｆｅｒａ￣

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ｍｉＲ￣２１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｅｓｏｐｈａｇｅａｌｃａｎｃｅｒ[Ｊ].ＧｅｎｅｔＭｏｌＲｅｓꎬ２００３－１３.

ＡｒｍｉｌｌａｒｉｅｌｌａｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｅｆｆｅｃｔｏｎＥＭＴｉｎ

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