１９８ 实验动物与比较医学Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４—５８１７．２０１７．０３．００５ ＩＣＲ小鼠感染呼肠孤病毒ＩＩＩ型的实验研究 罗银珠，张钰，何丽芳，黄碧洪，吴瑞可，闵凡贵，潘金春，袁文，王静，郭鹏举，黄韧 （广东省实验动物监测所，广东省实验动物重点实验室，广州５１０６６３） ［摘要】 目的 利用呼肠孤病毒ＩＩＩ型（Ｒｅｏ．３）感染ＩＣＲ小鼠，分析小鼠的临床体征、靶器官病毒载 量及血清抗体水平的动态变化。方法通过动物体内适应试验增强病毒毒力，利用尾静脉注射与 腹腔注射途径建立系统性感染ＩＣＲ小鼠模型，观察动物ｉ临床体征，于感染０ ｄ、４ ｄ、７ ｄ、１８ ｄ、 ２５ ｄ、３５ ｄ、７２ ｄ、１２９ ｄ分别采集小鼠（２—３只小鼠）血液并剖检。４７ ｄ、８１ ｄ、１０３ ｄ随机对３ 只小鼠进行血液采集跟踪。采用实时ｑＰＣＲ方法检测靶器官病毒核酸量，ＥＬＩＳＡ方法检测血清抗 体水平。结果 病毒经过４次小鼠体内适应其毒力明显增强。小鼠攻毒后６ ｄ、７ ｄ、９ ｄ、１０ ｄ、 １１ ｄ、１６ ｄ出现死亡，实时ｑＰＣＲ结果显示，肝脏病毒载量最高，其次是心、脾、肺。多数器官 病毒载量峰值出现在６～１１ ｄ，１２９ ｄ后，多数靶器官检测阴性。血清抗体最早在１８ ｄ达到阳性， ２５ ｄ达到峰值，并维持高抗体水平至试验结束。结论 小鼠体内适应方法可以明显增强Ｒｅｏ ３毒 力，该病毒感染可引起小鼠多器官炎症反应，并导致小鼠死亡。本研究为该病毒模型建立及致病 机理研究提供了参考数据。 【关键词】呼肠孤病毒ＩＩＩ型（Ｒｅｏ．３）；感染；临床研究；呼吸道肠道病 ［中图分类号】Ｑ９５．３３［文献标识码］Ａ［文章编号］１６７４．５８１７（２０１７）０３．０１９８—０６ 呼肠孤病毒（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ，Ｒｅｏ）是人兽共患病主【”， 中被列为ＳＰＦ等级实验动物必须排除的病原微生 物。目前对哺乳动物呼肠孤病毒的结构、功能及 分子生物学方面研究较多，而针对小鼠系统性感染 模型的临床及相关报道不多，本实验经尾静脉和腹 腔注射Ｒｅｏ一３感染ＩＣＲ小鼠，并进行长达１８周的 血清学及组织核酸监测，为防控与研究Ｒｅｏ一３及呼 吸道肠道病毒疾病提供数据。 能从人及多种动物如貂、河虾、蟹、禽、鸭、 猪、羊、牛等分离到。该病毒由编码１０个片段的 双股ＲＮＡ组成，属于呼肠病毒科，正呼肠病毒属【２］。 呼肠孤病毒ＩＩＩ型（Ｒｅｏ一３）是该病毒属的代表株。该 病毒可感染所有哺乳动物，包括小鼠、仓鼠、豚 鼠、猫和犬等 。Ｒｅｏ．３感染人，能引起幼年儿 童腹泻、呼吸道感染及脑膜炎等疾病『４＇ 。感染动 物能引起动物急性的呼吸窘迫综合征和肺组织纤维 化，脑炎，也可隐性感染动物并在体内产生抗体， １材料与方法 １．１病毒和细胞株 ＲｅＯ一３购自美国典型菌种保藏中心（ＡＴＣＣ ＶＲ一８２４），ＢＨＫ—ＡＴＣＣ细胞由奉实验室保１竽。 １．２实验动物 给【ｆ【Ｌ液制品、单克隆抗体、细胞培养等外来致病 因子的检定及动物试验带来一定的困难…１。Ｒｅｏ一３ 在实验动物微生物学等级及监测（ＧＢ １４９２２．２—２０１ １） ［收稿日期】２０１６—１２—３０ ［基金项目】广东省科技汁划项目（２Ｏ１４Ｂ０７０７０６００６）、 （２０１３Ｂ０６０４０００２８） ３周龄ＳＰＦ级雄性ＩＣＲ小鼠２４ ，体质量１５～ １８ ｇ，购白北京维通利华［ＳＣＸＫ（京）２０１６—００１ｌ１， 饲养于广东省实验动物监测所负压感染动物实验室 内［ＳＹＸＫ（粤）２０１２—０１２２］，自由饮食，动物实验开 展经广东省实验动物监测所动物使用和管理委员会 批准（ＩＡＣＵＣ２０１５００３）。实验前，随机剖杀２只动 ［作者简介】罗银珠（１９８３一），女，硕士，兽医帅，研究方向：病原学 及实验动物模型研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ａｇｌｕｏ１２２＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ ［通讯作者】黄韧（１９５９一），男，博士，研究员。 Ｅ—ｍａｉｌ：ｌａｂｋｉｎｇ＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ 实验动物与比较医学Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｌ９９ 物经酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）￣ＤＱＰＣＲ检测确定为 Ｒｅｏ一３抗原抗体阴性。 １．３主要试剂和仪器 程中的４７ ｄ、８１ ｄ、１０３ ｄ，随机抽取３只小鼠进 行眼眶采血分离血清置一２０℃保存待测血清抗体。 １．８ ＱＰＣＲ检测各组织病毒核酸含量 称量适量组织，加入６００ ｕＬ的ＰＢＳ缓冲液于组 ＥＬＩＳＡ抗体检测试剂盒购白美国Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｂｉｏ公 司，酶标仪购自美国Ｔｈｅｒｍｏ公司。荧光定量ＰＣＲ 织研磨机上研磨３～５ ｍｉｎ，将组织匀浆。研磨后， 仪ＡＢＩ ７５００购自美国ＡＢＩ公司，ＤＭＥＭ培养液购自 美国Ｇｉｂｃｏ公司，ＲＮＡ提取试剂ＴＲｉｚｏｌ购自美国 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，ＤＮＡ聚合酶购自中国大连宝生物公 司，其余试剂均为进口或国产分析纯。 １．４ ＱＰＣＲ引物合成 所用Ｒｅｏ一３引物参照参考文献【６Ｊ。引物由上海 英潍捷基生物技术有限公司合成。 １．５病毒滴度测定 将Ｒｅｏ．３接种ＢＨＫ细胞，吸附作用１ ｈ后加入 含体积分数２％血清的维持液，放入３７℃、体积 分数５％ＣＯｚ细胞培养箱中培养，倒置生物显微镜 表Ｉ Ｒｅｏ．３引物序列 Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｒｅｏ－３ 引物 歹 正向引物 ５’．ＴＧＴＧＡＧＧＴＧＧＡＣＧＣＧＡＡＴＡＧ一３’ 反向引物 ５’一ＣＧＴＴＧＡＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＡＧ一３’ 探针 ５’．Ｊ０Ｅ．ＣＧＧＣＣＧＧＣＴＧＧＴＧＡＴＣＡＧＡＧＴＡＴＧ— ＥＣＬＩＰＳ一３’ 观察细胞形态，７０％细胞产生细胞病变（ＣＰＥ）后收 获病毒液，反复冻融３次，离心取上清液作为感 染病毒，并用ｑＰＣＲ对病毒拷贝数进行定量。 １．６动物回归试验 取浓度约为３．１×１０６拷贝／ｇＬ的Ｒｅｏ．３细胞培 养病毒液尾静脉和腹腔注射病毒液各０．２ ｍＬ／只， 感染后３ ｄ剖杀，取感染鼠的肝和肺进行研磨，离 心后获得病毒液上清，重复感染小鼠，反复４次。 最后一次获得的组织研磨上清液，放一８Ｏ℃，备用。 １．７感染动物试验 取经过体内适应增毒后的Ｒｅｏ．３病毒液，浓度 为１．５×１０ 拷贝／ｇＬ，尾静脉和腹腔注射病毒液各 ０．２ ｍＬ／只。动物接种病毒后，观察１２９ ｄ。每日 记录动物的被毛、行为活动、饮食和精神状态。 并在小鼠感染后４ ｄ、７ ｄ、１ ８ ｄ、２５ ｄ、３５ ｄ、 ７２ ｄ和１２９ ｄ对２—３只小鼠进行眼眶采血后脱颈椎 处死并采集心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、 盲肠内容物置一２０℃保存备用。在感染实验进行过 １０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，取２００ ｇＬ上清抽提核酸， 具体步骤参照核酸提取试剂盒（ＴＩＡＮａｍｐ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｋｉｔ）说明书。最后应用ＡＢＩ ７５００ Ｒｅａｌ—Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｔａｑｍａｎ ＲＴ．ＰＣＲ两步法试剂盒 （Ｔａｋａｒａ）即９５℃３０ Ｓ，９５℃５ Ｓ，６０℃３０ Ｓ，进行 ４Ｏ个循坏，荧光信号采集设于６０℃，溶解曲线设 置为：９５℃５ Ｓ，６５℃１ ｍｉｎ，５０℃３０ Ｓ，进行荧 光定量ＰＣＲ检测鉴定。 １．９小鼠血清抗体检测 根据试剂盒说明进行操作与读数判定：样本稀 释及加样，将血清样本从１：５０稀释，再向ＥＬＩＳＡ微 孔板各加１００ 稀释好的样本；３７℃孵育后洗板，每 孔加１００ ｕＬ酶标二抗，３７℃孵育后洗板，加显色液； 反应完毕，立即用酶标仪读数，测试波长为４０５ ｎｍ。 １．１０统计分析 实验结束，所有数据采用ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０１ 进行数据处理及分析。 ２结果 ２．１病毒动物回归试验 为提高病毒在小鼠体内适应能力，本实验进 行了４次小鼠体内适应试验，结果显示，病毒初 次接毒后体征不明显、不死亡、而适应毒接毒后 小鼠体征加重。初次感染小鼠，病毒在体内增殖 慢并且含量减低（图１Ａ），多次体内适应后，体内 主要脏器肝、脾、肺病毒载量升高（图１Ｂ），表明 病毒适应后感染能力及毒力增强。 ２．２临床观察 采用经过小鼠回归试验后含有Ｒｅｏ．３的组织研 磨上清感染ＩＣＲ小鼠，潜伏期（０～５ ｄ）小鼠出现立 毛、扎堆，个别小鼠精神差，运动减少；发病期 （６～１ ８ ｄ），感染鼠立毛明显，并出现腹式呼吸， 感染后６ ｄ，７ ｄ，９ ｄ，１ ０ ｄ，１ １ ｄ，１６ ｄ，小 鼠出现死亡，剖检见肺有出血，肝有白色坏死 点，胃胀气，脾缩小；恢复期（１９～１２９～ｄ），小鼠 状态逐渐良好，精神好转。 ２００ 实验动物与比较医学Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ａ Ｂ 癞 鳘 、 耋 鳘 豢 艚 蜒 嚣 髅 毋 摘礴在小黻体内遵照敬数 肝 脾 肺 体内适戚试验缎 （２ ｄ媛５ ｄ－胆２） ＃前数值为病毒在动物体内适应次数，０ 为细胞传代培养扩增的病毒液 图１ Ｒｅｏ。３病毒小鼠体内适应结果 Ｆｉｇｕｒｅ １ Ｒｅｏ－３ ｖｉｒｕｓ ａｄａｐｔｉｏｎ ｔｏ ｍｉｃｅ ２．３血清抗体滴度变化 ２．４组织病毒含量变化 感染小鼠体内抗体滴度随着感染时间迁移而升 高，接种后１８ ｄ抗体阳性，之后抗体效价逐渐升 高，在２５ ｄ抗体稀释度达到１２８倍并维持至１２９ ｄ （抗体稀释度达５１２倍）（表２）。 ２．４．１靶器官核酸含量变化 感染早期小鼠以肝病 毒载量最高（图２Ａ），其次是心、脾、肺（图２Ｂ，Ｃ，Ｄ）。 肝以６ ｄ（３．３×１０ 拷贝／ｐＬ）含最最高（图２Ａ），心在 １ １ ｄ（４．５×１０ 拷贝／ＢＬ）（图２Ｂ），肿在ｌ ８ ｄ（２．９× 表２感染小鼠抗Ｒｅｏ．３血清抗体的测定 Ｔａｂｌｅ ２ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｒｅｏ一３ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｍｉｃｅ 注：抗体滴度为能检出阳性结果的最大稀释倍数；ｎ＝２或３ １０ 拷贝／ＢＬ）（图２Ｃ），脑在４ ｄ（４．３×１０ 拷贝／“Ｌ） ７ ｄ，９ ｄ，１０ ｄ，Ｊ １ ｄ，１６ ｄ分别死亡１ （图５）。脏器 （图２Ｄ），脾在６ ｄ（８．７×１０。拷贝／ＢＬ）（图２Ｅ），肾在 １８ ｄ（１．９×１０ 拷贝／ＢＬ）（图２Ｆ），并随着时间推移小 鼠各组织内病毒核酸含量总体呈现下降趋势，到 １２９ ｄ除心和脾外检测到少量核酸外，其他组织均 核酸结果显示早期死亡小鼠（６ ｄ，７ ｄ）肝和脑病毒载 量高于其他组织，暗示两个器官为病毒早期增殖和 损伤的主要器官。肝的核酸含幂在小同时 死亡小 鼠中均呈现高载毒量，显示病毒在小鼠肝脏大黾复 检测不到病毒核酸。 ２．４．２胃肠消化道核酸含量变化 感染后的小鼠取 制，是致死的重要冈素。肝、脾、肺、肾、胃 病毒载量以７ ｄ死亡鼠核酸含量最高，并呈现随着 胃及盲肠内容物进行核酸检测，结果显示病毒可以 在胃中缓慢增殖，但到感染４个月后检测不到（图 时间推移逐步减低。 ３Ａ）。自肠内容核酸检测除１只能检测到外，其余 的均不能检测出来（图３Ｂ），该结果暗示该病毒在本 实验中基本 经粪便排毒和传播。 ２．４＿３死亡鼠主要脏器及组织核酸 感染实验后６ ｄ， ３讨论 呼肠孤病毒具有宿主谱广泛的特点，除人外，从 自然感染的小鼠、禽、人、猫、牛、猪、猕 实验动物与比较医学Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｂ 厝｝ ２０１ Ａ Ｃ 蠹ｃ 甚 警 ３ 辎 精 髅 錾 警 瓣 联 警 袭 蓑 飞唯 、、 移皆 母 母帝－争 按种聪时闻／ｄ ＾岛 接种聪时蝴／ｄ ｜争 按种瞒时蝴／ｄ Ｄ Ｅ 脾 ，１ｌ 酥糖苓 寄 麟ｉ摩孵躲 Ｆ 错 矗 Ｔ一 誉 糍 ｛辩 撰 善 警 鬈 槲｝ ＇‘ 巾孝 接种蕊孵阅／ｄ ｑ 移旁 接种鼢时婀／ｄ ≈飞ｑ 舻 按种麻时闯／ｄ 图２感染小鼠各内脏组织核酸测定 ＝１—３） Ｆｉｇｕｒｅ ２ Ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｒｅｏ－３ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｏｒｇａｎｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｍｉｃｅ ＝１－３） 一葶《 精 Ａ Ｂ ● 瓤 癫 麟 警 罾 《 嘲 警 蔷 ０ 辎 艚 髌 锚 艏 —髅 ｂ飞 接种艏时阕／ｄ 痧孛 Ｉ ≈＾ ｑ 接种爝时闻／ｄ 图３感染小鼠胃肠道核酸含量变化 ＝１～３） Ｆｉｇｕｒｅ ３ Ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｒｅｏ－３ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｇａｓｔｌ ｏｉｎｔｅｓｔｊｎａｌ ｔｒａｃｔ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｍｉｃｅ（ｎ＝ｌ￣３） 猴、黑猩猩、昆虫、鱼，蝙蝠等体内都分离到 呼肠孤病毒【 ＿１１。根据国际病毒分类委员会第七次 ＿＿ｌ据报道［１４】，１９８０年代上海地区普通级鼠群感染率 达３５％，血清阳性率５．８％，屏障小鼠血清阳性率 １．９％，感染呈间发性流行，时隐时现。近年报生【 ］ 显示该病毒在ＳＰＦ级实验鼠中流行率低。本实验室 ２０１５年对野鼠Ｒｅｏ．３抗体阳性率抽检阳性率３０％ （２４／８０）。２００７年英国研究者［１６】曾对野外捕获小鼠 进行病原血清调查表明Ｒｅｏ一３阳性率１０％。目前， 报告，正呼肠孤病毒属分３个亚群。非融合基因哺 乳动物正呼肠孤病毒（ＭＲＶ）属于第一个亚群。该亚 群目前有４个血清型（Ｒｅｏ．１，Ｒｅｏ．２，Ｒｅｏ．３，Ｒ４）ｔ２，１２１。 Ｒｅｏ一３病毒在鼠群中常呈隐性感染，威胁实验动物 的健康，进而影响动物实验的可靠性和准确性［１３－１４】。 ２０２ 实验动物与比较医学Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ０ ６ｄ 口 ７ｄ△ ９ｄ ● 档 ２ ｂｏ ０ ，－－１ 、、 蚓 艚 肝脑 心 脾 肺 ’肾 胃 死亡鼠的不同组织 图４死亡小鼠核酸含量变化（ｎ＝１） Ｆｉｇｕｒｅ ４ Ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｒｅｏ－３ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｄｅａｄ ｍｉｃｅ（ｎ＝１） 该病毒在实验动物病原微生物质量检测中被列为必 须检测项目，要求阴性。 本实验通过人工攻毒方式模拟感染小鼠后， 出现了急性死亡及慢性带毒感染。死亡病例集中于 感染后２剧内，之后垒１８剧小鼠均早现隐性感染。 肺是呼肠孤死亡小鼠的主要靶器官，小鼠死前均表 现出腹式呼吸，呼吸困难，精神筹等的呼吸综合 症候，此与人感染Ｒｅｏ体征＿】７１有相近之处且实验操 作简单，是研究人感染Ｒｅｏ或药效评价的良好模型。 本实验从体内组织肝，肺，心，脑，脾，肾 等多脏器分离到病毒，且病毒携带时问大于４周， 心与脑携带病毒时间长达ｌ８ 仍然能检测到病毒核 酸。这结果与研究报道『ｌ３］病毒污染鼠群的可引起多 种系统性疾病，包括坏死性肝炎、心肌炎、胰腺 炎以及脑膜炎结果一致。奉实验证实了该病毒可穿 透血脑 障，在脑内定殖从而损伤脑组织，需引 起重视。心在本实验中直到实验结束１２９ ｄ仍能检 测到，暗示着该病毒有可长时间存在于血液循环而 引起病毒血症，该结果也显示在一些血制品 生安 全方面需引起重视。 小鼠经人’ 病毒感染后早现全身性多组织多器 官感染，感染早期病毒在各脏器定殖扩增并能引起 动物死亡，随着时间推移小鼠各组织内病毒核酸含 量总体旱现下降趋势，部分脏器内病毒逐渐被机体 清除，此结果显示动物自身免疫系统在抗病毒中发 挥重要作用，在某些脏器内限制了病毒的复制及损 伤，表现在临床上动物死亡率减少，动物状态恢复。 研究报道［１８１Ｒｅｏ ３在动物群体中通过空气和粪一 口途径传播，并且有人认为Ｒｅｏ一３在环境中能稳定 生存是造成病毒污染的主要原冈，主要通过水平传 播和垂直传播两种方式进行传播，其中以呼吸道和 消化道传播为主要传播方式。本实验针对呼吸道 （肺）及胃肠进行临床跟踪及核酸检测，结果发现感 染早期肺病变明显，出血，允山，动物出现呼吸 困难综合征，食欲下降，胃的核酸检测结果显示 病毒呈低滴度复制。而自肠内容检测结果除一 死 亡鼠检测阳性外其余均为阴性。作者推测该毒株在 经过多次动物全身性适应试验后可能改变了排毒途 径，消化道传播方式减弱或消失，以呼吸道水半 传播为主。 综上所述，小鼠感染Ｒｅｏ一３可作为研究Ｒｅｏ ３ 的良好模犁。呼吸道传播方式埘该病的防控提供有 效指导方向。通过抗体来监测该病毒有效期可为 １８ 或更长。以上埘研究呼肠孤病毒及相关呼吸 道肠道病提供了良好实验数 。 参考文献： ［１］郎书惠，贺争鸣，＿灭ｕ忠英．呼肠孤 毒感染 免疫功能 状态小鼠的病理组织学研究…．实验动物科学 ｊ管理， １９９８，１ ５（３）：５４． 【２］…克 ．实验动物病毒 疾病［Ｍ］．北京：中田农业…版礼， ｌ９９２：４ｌ一４５． ［３］殷震，刘景华．动物病毒学［Ｍ］．第２版．北京：科学…版礼． １９９７：３２９—３３０． 【４］Ｔｙｌｅｒ ＫＬ，Ｂａｒｔｏｎ ＥＳ，Ｉｂａｃｈ ＭＬ，ｅｔ ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｎａｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｙｐｅ ３ ｒｅｏｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ａ ｃｈｉｌｄ ｗｉｔｈ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ［Ｊ］．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２００４．１８９：１６６４—１６７５． 【５】Ｏｕａｔｔａｒａ ＬＡ，Ｂａｒｉｎ Ｆ，Ｂａｒｔｈｅｚ ＭＡ，ｅｔ ａ１．Ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｒｅｏｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｎｅｃｒｏｔｉｚｉｎｇ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ ＩＪ】．Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２０１１，１７：１４３６—１４４４． 【６】Ｂｏｏｔｚ Ｆ，Ｓｉｅｂｅｒ Ｉ，Ｐｏｐｏｖｉｃ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｅｓｔｓ ｗｉｔｈ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＣＲ—ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ［Ｊ］．Ｌａｂ Ａｎｉｍ，２００３，３７（４）：３４１—３５１． 【７］Ｚｈａｎｇ Ｙ Ｗ，Ｌｉｕ Ｙ，Ｌｉａｎ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ａ ｎａｔｕｒａｌ ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ ａｎｄ ｍｕｔａｎｔ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ３ ｒｅｏｖｉｍｓ ｆｒｏｍ ｍｉｎｋ ｉｎ Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ， ２０１６，１６１（２）：４９５—４９８． 【８】Ｚｈａｎｇ Ｓ，Ｓｈｕ Ｘ，Ｚｈｏｕ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｒｅｏｖｉｒｕｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｏｒｔａｌｉｔｉｅｓ ｉｎ ｆａｒｍｅｄ ｏｒｉｅｎｔａｌ ｉｆｖｅｒ ｐｒａｗｎ，Ｍａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍ ｎｉｐｐｏｎｅｎｓｅ（ｄｅ Ｈａａｎ，１ ８４９），ｉｎ Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ｊ Ｆｉｓｈ Ｄｉｓ，２０１６，３９（３）：３７１－３７５． 【９］Ｍｏｒ ＳＫ，Ｖｅｒｍａ Ｈ，Ｓｈａｒａｆｅｌｄｉｎ ＴＡ，ｅｔ ａ１．Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｔｕｒｋｅｙ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｒｅｏｖｉｒｕｓ ｉｎ ｐｏｕｌｔｒｙ ｌｉｔｔｅｒ ａｎｄ ｄｒｉｎｋｉｎｇ ｗａｔｅｒ［Ｊ］． Ｊｕｎ．２０１７．３７（３） 实验动物与比较医学Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ＩＬＡＲ Ｊ．１９９８，３９（４）：２６６—２７１． ２０３ Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉ，２０１５，９４（４）：６３９—６４２． 【１０】Ｋｕｍａｒ Ｓ，Ｄｉｃｋ ＥＪ，Ｂｏｍｍｉｎｅｎｉ Ｙ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｏｖｉｍｓ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｅｎｉｎｇｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｉｎ ｂａｂｏｏｎｓ［Ｊ］．Ｖｅｔ Ｐａｔｈｏｌ，２０１４， ５１（３）：６４１—６５０． ［１ １】Ｂａｉ Ｂ，Ｓｈｅｎ Ｈ，Ｈｕ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｔｙｐｅ ｏｆｒｅｏｖｉｒｕｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ，２０１４，１４２ （１０）：２１５５—２１５８． ［１ ２］Ｓｔａｎｌｅｙ Ｎ Ｆ，Ｄｏｒｍａｎ Ｄ Ｃ，Ｐｏｎｓｆｏｒｄ Ｊ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ 【ｌ４］徐倍，李建平，屈霞琴，等．上海地区实验小鼠病毒性传染 病的血清学调查【Ｊ１．上海实验动物科学，１９８９，９（１）：３４—３６． ［１５］王翠娥，陈立超，周倩，等．实验大鼠和小鼠多种病毒的血 清学检测结果分析ｆＪ］．实验动物科学，２０１４，３１（２）：２０—２４． ｆ１６１ＭａｒｔｙＧＤ，Ｍｏｎ＇ｉｓｏｎＤＢ，Ｂｉｄｕｌｋａ Ｊ，ｅｔａ１．Ｐｉｓｃｉｎｅ ｒｅｏｖｉｒｕｓ ｉｎ ｗｉｌｄ ａｎｄ ｆａｒｍｅｄ ｓａｌｍｏｎｉｄｓ ｉｎ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｃａｎａｄａ： １９７４—２０ｌ３［Ｊ】．Ｊ Ｆｉｓｈ Ｄｉｓ，２０１５，３８（８）：７１３—７２８． 『１７１ Ｃｈｅｎｇ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ａ ｎｏｖｅｌ ｒｅｏｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａ ｈｉｔｈｅｒｔｏ ｕｎｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｈｅｐａｔｏ— ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｕｎｕｓｕａｌ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｉｎ ｓｕｃｋｌｉｎｇ ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ａｕｓｔ Ｊ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ Ｓｃｉ，１９５３，３１（２）：１４７—１５９． ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｖｉｒｏ１．２００９．４５：７９—８Ｏ． ［１ ８】Ｗａｇｇｉｅ Ｋ，Ｋａｇｉｙａｍａ Ｎ，Ａｌｌｅｎ ＡＭ．Ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ— 【１３１ Ｊａｃｏｂｙ ＲＯ，Ｌｉｎｄｓｅｙ ＪＲ．Ｒｉｓｋｓ ｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｇｉｃｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌｓ【ＭＩ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ：ＭＤ： ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ．１９９４：９９．１００． ｒａｔｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ ａｔ ｍａｊｏｒ ｂｉｏｍｅｄｉｃａ１ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ［Ｊ］． Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｒｅｏｖｉｒｕｓ ＩＩＩ（Ｒｅｏ－３）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ＩＣＲ Ｍｉｃｅ ＬＵＯ Ｙｉｎ—ｚｈｕ，ＺＨＡＮＧ Ｙｕ，ＨＥ Ｌｉ—ｆａｎｇ，ＨＵＡＮＧ Ｂｉ—ｈｏｎｇ，ＷＵ Ｒｕｉ—ｋｅ， Ｍｉｎ Ｆａｎ—ｇｕｉ，ＰＡＮ Ｊｉｎ－ｃｈｕｎ，ＹＵＡＮ Ｗｅｎ，ＷＡＮＧ Ｊｉｎｇ，Ｇｕｏ Ｐｅｎｇ－ｊｕ，ＨＵＡＮＧ Ｒｅｎ （Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６６３，ＣｈｉｎａＪ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｒｅｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ３（Ｒｅｏ一３）ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＩＣＲ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｏｂｓｅｒｖｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｖｉｅｓ ｌｏａｄ ｉｎ ｒｔａｒｇｅｔ ｏｒｇａｎｓ ａｎｄ ｓｅｒｏｌｏｇｙ ｄｙｎａｍｉｃ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｍｉｃｅ． Ｍｅｔｈｏｄ Ａｎｉｍａｌ ａｄａｐｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ’ｓ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｗｉｔｈ ｔａｉ１ ｖｅｉｎ ａｎｄ ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｔｏ ＩＣＲ．Ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ． Ｔｈｅ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｓｅｒｕｍｓ ｗｅｒｅ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ ｏｎ ０ ｄ ｂｅｆｏｒｅ ａｎｄ ４ ｄ、７ ｄ、１８ ｄ、２５ ｄ、３５ ｄ、７２ ｄ、 １２９ ｄ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｏｎ ４７ ｄ、８１ ｄ、１０３ ｄ． ｑＰＣＲ ａｎｄ ＥＬＩＳＡ ｗｅｒｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｖｉｕｓ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｔ ｔａｒｒｇｅｔ ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｅｖｅ１．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｖｉｒｕｓ ｖｉｕｌｒｅｎｃｅ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｆｔｅｒ ｆｏｕｒ ｔｉｍｅｓ ａｄａｐｔｉｏｎ ｔｒｉａ１．Ｍｉｃｅ ｄｅａｔｈ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ａｔ ｄ７，ｄ９，ｄｌ０，ｄｌ １，ｄ１６ ｐｏｓｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｌｏａｄ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ｔｈｒｏｕｇｈ ｑＰＣＲ， ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｈｅａｒｔ，ｓｐｌｅｅｎ，ａｎｄ ｌｕｎｇ．Ｔｌ１ｅ ｐｅａｋｓ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ ｅｍｅｒｇｅｄ ｆｒｏｍ ６ ｔｏ １ １ ｄ ｉｎ ａｌｌ ｏｒｇａｎｓ，ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｐｐｅａｒｅｄ ａｔ ｌ ２９ ｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｏｒｇａｎｓ．Ｔｈｅ ｅａｒｌｉｅｓｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｔｅｃｔ ｔｉｍｅ ｗａｓ ｏｎ １ ８ ｄ．Ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ｎｔｉｂｏｄｙ ａｈｉｔ ｔｈｅ ｐｅａｋ ｏｎ ２５ ｄ．ｔｈｅｎ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ａ ｉｇｈ １ｈｅｖｅｌ ｔｉｌｌ ｔｏ １２９ ｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ｖｉｒｕｓ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｃａｎ ｂｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｏｕｓｅ ｉｎ—ｖｉｖｏ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ，ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｏｒｇａｎｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｍｉｃｅ ｃａｎ ｂｅ ｉｄｅｎｔｉｉｅｄ ｆｂｙ ｔｈｅ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗａｙ ｏｆ Ｒｅｏ一３．Ｔｈｉｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ Ｒｅｏ．３ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｍｉｃｅ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｇｏｏｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄａｔａ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｒｅｏ．３ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｒｅｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ３（Ｒｅｏ一３）；Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｒｅｓｐ￣ａｔｏｒｙ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅ
