纳米纤维结构及其使用方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 111479771 A(43)申请公布日 2020.07.31

(21)申请号 201880074882.2(22)申请日 2018.09.19(30)优先权数据

62/560,314 2017.09.19 US(85)PCT国际申请进入国家阶段日

2020.05.19(86)PCT国际申请的申请数据

PCT/US2018/051716 2018.09.19(87)PCT国际申请的公布数据

WO2019/060393 EN 2019.03.28(71)申请人 内布拉斯加大学董事会

地址 美国内布拉斯加州(72)发明人 谢敬伟　

权利要求书1页 说明书16页 附图21页

(74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司

11332

代理人 刘明海　胡彬(51)Int.Cl.

B82Y 30/00(2006.01)C08J 9/00(2006.01)D01F 6/00(2006.01)D06M 11/00(2006.01)

()发明名称

纳米纤维结构及其使用方法(57)摘要

本申请提供了膨胀的纳米纤维结构及其使用方法和制造方法。

CN 111479771 ACN 111479771 A

权　利　要　求　书

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1.一种用于制备具有增加的孔隙率和厚度的纳米纤维结构或微纤维结构的方法，所述方法包括将纳米纤维结构或微纤维结构暴露于亚临界流体并减压，其中所述减压增加纳米纤维结构或微纤维结构的孔隙率和厚度。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述亚临界流体包含CO2、N2、N2O、烃或碳氟化合物。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述亚临界流体是亚临界CO2。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述暴露包括将所述纳米纤维结构或微纤维结构浸入所述亚临界流体中。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述纳米纤维结构或微纤维结构包括电纺纤维。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述纳米纤维结构或微纤维结构包括多个单轴对齐的纳米纤维或微纤维、无规纳米纤维或微纤维和/或缠结的纳米纤维或微纤维。

7.根据权利要求1所述的方法，其还包括在所述暴露于亚临界流体之前制备包括多个纳米纤维或微纤维的所述纳米纤维结构或微纤维结构。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述纳米纤维或微纤维包括亲水性聚合物。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述纳米纤维或微纤维包括疏水性聚合物。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述疏水性聚合物是聚己内酯。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述纳米纤维结构或微纤维结构包括活性剂。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述活性剂选自由治疗剂、生长因子、信号分子、细胞因子、止血剂、抗微生物剂和抗生素组成的组。

13.根据权利要求11所述的方法，其中在所述暴露于亚临界流体之后将所述活性剂加入到纳米纤维结构或微纤维结构中。

14.根据权利要求11所述的方法，其中在所述暴露于亚临界流体之前将所述活性剂加入到纳米纤维结构或微纤维结构中。

15.根据权利要求1所述的方法，其中i)将纳米纤维结构或微纤维结构暴露于亚临界流体和ii)减压的步骤进行多于一次。

16.根据权利要求15所述的方法，其中i)将纳米纤维结构或微纤维结构暴露于亚临界流体和ii)减压的步骤重复1至5次。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述纳米纤维结构或微纤维结构包括孔或洞。18.根据权利要求1所述的方法，其还包括将所述纳米纤维结构或微纤维结构交联。19.通过根据权利要求1-18中任一项所述的方法生产的纳米纤维结构或微纤维结构。

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纳米纤维结构及其使用方法

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[0001]

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2017年9月19日递交的美国临时专利申请号62/

560,314的优先权。上述申请通过引用并入本文。

[0002]本发明是在支持下由美国国家卫生研究院(NIH)授予的授权号R01GM123081做出的。对本发明具有一定的权利。技术领域

[0003]本发明涉及纳米纤维和纳米纤维结构领域。更具体地，本发明提供合成纳米纤维结构的方法及其使用方法。

背景技术

[0004]在整个说明书中引用了若干出版物和专利文献，以便描述本发明所属领域的技术状态。这些引文的每一篇通过引用并入本文，如同完全阐述一样。[0005]电纺纳米纤维的潜在应用包括能量储存、医疗保健、生物技术、环境清洁、防御和安全(Ramakrishna等人(2006)Mater.Today 9:40-50；Sridhar等人(2015)Chem.Soc.Rev.,44:790-814；Xie等人(2008)Macromol.Rapid Commun.,29:1775-1792)。由于能够模拟细胞外基质(ECM)的结构和ECM中胶原原纤维的尺寸，电纺纳米纤维已经广泛用作组织修复和再生的支架材料(Xie等人(2008)Macromol.Rapid Commun.,29:1775-1792；Xie等人(2010)Nanoscale 2:35-44；Xie等人(2010)Nanoscale 2:923-926；Kennedy等人(2017)Acta Biomater.,50:41-55；Liu等人(2012)Adv.Healthc.Mater.,1:10-25)。常规电纺丝的一个因素是所生产的纳米纤维垫完全由致密堆积的纳米纤维组成，仅在片状组装的过程中提供表面多孔结构(Mahjour等人(2016)J.Biomed.Mater.Res.A,104:1479-1488；Wu等人(2016)Bioactive Materials 1:56-；Sun等人(2012)Nanoscale 4:2134-2137)。用这种纳米纤维垫孵育的细胞通常导致在其表面上形成细胞单层，而不是在整个垫中的三维(3D)细胞构建体(Kang等人(2016)Biofabrication 8:025008)。差的细胞渗透归因于纳米纤维垫的孔隙率降低，并且纤维间孔的尺寸通常小于单个细胞的尺寸(Mahjour等人(2016)J.Biomed.Mater.Res.A,104:1479-1488)。此外，降低的孔隙率会氧和养分的运输，进一步阻碍细胞浸润(Kim等人(2007)J.Biomed.Mater.Res.B Appl.Biomater.,81:104-110)。因此，主要由于电纺技术的固有性质而导致的常规电纺纳米纤维垫的不利特性了细胞在整个纳米纤维垫中的浸润和生长。显然，需要改进的电纺垫。发明内容

[0006]根据本发明，提供了纳米纤维/纳米纤维结构。在一个特定的实施方案中，所述纳米纤维/纳米纤维结构包括包含多个纳米纤维的膨胀纳米纤维结构。在一个特定的实施方案中，纳米纤维结构已通过暴露于亚临界流体如亚临界CO2然后减压(例如在容器内)而膨胀。所述纳米纤维结构可以包含多个电纺纳米纤维(例如，单轴对齐的、无规的、缠结的和/或电纺纤维)。所述纳米纤维结构也可包括增强吸水性的材料，例如明胶、壳聚糖或胶原。在

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一个特定的实施方案中，所述纳米纤维结构是交联的。所述纳米纤维结构还可以包含一种或多种药剂或化合物，如治疗剂。在一个特定的实施方案中，所述纳米纤维结构包括多个孔(hole)，特别是孔阵列。在一个特定的实施方案中，所述纳米纤维结构的孔包括细胞和/或组织。还提供了合成本发明的纳米纤维结构的方法。[0007]根据本发明的另一个方面，提供了使用所述纳米纤维结构的方法。例如，所述纳米纤维结构可用于增强伤口愈合、构建组织构建物、促进组织再生、减少、抑制、预防和/或消除感染、局部递送药物和/或抑制出血。附图说明

[0008]图1A-1J显示了对齐的纳米纤维支架的膨胀和表征。图1A:亚临界CO2流体第一次处理后的对齐的PCL纳米纤维垫的照片(左)和原始PCL纳米纤维垫的照片(右)。图1B:第二次处理后的对齐的PCL纳米纤维垫的照片(左)和原始PCL纳米纤维垫的照片(右)。图1C：在一次和两次膨胀之后，对齐的PCL纤维垫的厚度。图1D：在一次和两次膨胀之后，对齐的PCL纤维垫的相应孔隙率。图1E-1H：显示在亚临界CO2流体中膨胀两次之前(图1E、1F)和膨胀之后(图1G、1H)的对齐的PCL纤维垫的横截面形态的SEM图像。比例尺为20μm。

[0009]图2A-2D提供聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)纳米纤维垫在亚临界CO2流体中膨胀之前(图2A、2B)和膨胀之后(图2C、2D)的照片。由于PVP纳米纤维的高亲水性，膨胀的PVP膜被保持在加盖的管中以防止从周围空气冷凝的水溶解(图2C)。在样品温度达到室温后取出膨胀的膜(图2D)。

[0010]图3A-3C显示负载有香豆素6的PCL纳米纤维支架的膨胀。图3A:显示负载有香豆素6的NaBH4膨胀的PCL纤维垫(NaBH4)和负载有香豆素6的CO2膨胀的PCL纤维垫(CO2)的照片图3B:负载有香豆素6的CO2液体膨胀的PCL纤维垫(左上)、负载有香豆素6的NaBH4膨胀的PCL纤维垫(左下)、负载有香豆素6的PCL纤维垫(右上)和原始的PCL纤维垫(右下)的俯视图。插图：每个样品的荧光图像。图3C：通过Image J软件量化的荧光强度。

[0011]图4A-4B显示了使用CO2流体的负载有LL37的PCL纳米纤维支架的膨胀。图4A:LL37从膨胀和未膨胀的PCL纤维样品中的体外释放动力学(初始载药量：5μg/mg)。图4B:不同纤维样品的抗菌性能。PCL：未膨胀的原始PCL纳米纤维膜。PCL-LL37：负载有LL37的PCL纳米纤维支架。图4C提供了显示在室温下冲孔的纳米纤维支架的SEM图像。左上：在纳米纤维支架上的冲孔。右上：左上视图的高放大倍数显示了冲孔。左下：左上视图的高放大倍数显示了冲孔的壁。右下：左上视图的高放大倍数显示了冲孔的底部。冲孔周围的区域显示出缺少纳米纤维形态。图4D显示了冲孔的PCL纳米纤维支架的膨胀。左上：膨胀前冲孔的对齐的纳米纤维支架的SEM图像。右上：显示膨胀前冲孔的对齐的纳米纤维支架的横截面形态的SEM图像。插图：膨胀前冲孔的对齐的纳米纤维支架的横截面积的高放大倍数。左下：显示膨胀后冲孔的对齐的纳米纤维支架的横截面形态的SEM图像。右下：膨胀后冲孔的对齐的纳米纤维支架的横截面积的高放大倍数。

[0012]图5A-5F显示具有阵列孔的膨胀纳米纤维支架和传统纳米纤维垫的体内响应。图5A:H&E染色。点表示细胞过滤区域的边界。图5B:Masson三色染色法。箭头指示胶原沉积。图5C：图5A的高度放大图像。图5D：图5A的高度放大图像。箭头指示巨细胞。图5E：每mm2的血管形成的定量。图5F：每个植入物的巨细胞的定量。图5G提供了在皮下植入大鼠后传统纳米纤

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维垫和周围组织的代表性H&E染色和Masson三色染色图像。

[0013]图6A提供了具有阵列孔和周围组织的3D膨胀纳米纤维支架针对泛巨噬细胞的CD68-a表面标记物、M2期巨噬细胞的CD206-a表面标记物和M1期巨噬细胞的CCR7-a表面标记物的免疫组织学染色。将纳米纤维支架皮下植入大鼠中1周、2周和4周。图6B提供了在皮下植入大鼠后传统纳米纤维垫和周围组织的代表性免疫染色图像。

[0014]图7A-7D显示皮下植入后具有阵列孔的3D膨胀纳米纤维支架和传统纳米纤维垫的免疫组织学分析的定量。显示了CD68、CCR7(M1)、CD206(M2)免疫阳性细胞和CD163阳性细胞数(M2)/CCR7阳性细胞数(M1)的比率。通过对每个样品以40×(物镜)放大率测量六个扫描图像获得这些值。

[0015]图8显示了在皮下植入具有冲孔的3D膨胀纳米纤维支架后的多核巨细胞。在手术后第1、2和4周处死大鼠。相对于泛巨噬细胞的CD68-a表面标记物、M2期巨噬细胞的CD206-a表面标记物和M1期巨噬细胞的CCR7-a表面标记物，对多核巨细胞进行染色。箭头指示多核巨细胞。

[0016]图9提供了说明在皮下植入后，在传统纳米纤维垫的表面上和在具有阵列孔的膨胀3D纳米纤维支架内的M1巨噬细胞(浅灰色)、M2巨噬细胞(灰色)(上图)和多核巨细胞(下图)的细胞浸润和时空分布的示意图。细胞浸润区域用深灰色标记。具体实施方式

[0017]已经尝试了许多方法来克服抑制纳米纤维垫在再生医学中使用的障碍。为了增加电纺纳米纤维支架的孔尺寸，一种简单直接的方式是调节纤维直径(Sell等人(2008)J.Biomed.Mater.Res.A,85:115-126；Balguid等人(2009)Tissue Eng.Part A,15:437-444；Fong等人(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.,110:6500-6505；Pham等人(2006)Biomacromolecules 7:2796-2805)。研究表明，大于4μm的纤维直径可导致大于20μm的孔尺寸(Pham等人(2006)Biomacromolecules 7:2796-2805)。该方法的问题是，具有微米级尺寸的纤维缺乏仿生特性，并且微纤维和细胞之间的相互作用可能不同于纳米纤维和细胞之间的相互作用。在电纺丝期间用改进的收集器操纵电场也用于产生3D棉状蓬松纳米纤维支架(Blakeney等人(2011)Biomaterials 32:1583-1590)。这种方法限于产生由缺乏纳米形貌线索的无规纳米纤维制成的支架，并且难以控制孔隙率。替代地，加入到电纺溶液中的离子盐可以操纵基材和沉积的纳米纤维之间的静电排斥，以制造海绵状纳米纤维基质(Jin等人(2015)Angew.Chem.,:7587-7591)。这种方法仅产生有限厚度的纳米纤维基质，并且必须使用可能在组织再生期间引起副作用或安全问题的添加剂(例如离子盐)。增加孔隙率的另一种策略是选择性地去除牺牲纤维(Baker等人(2008)Biomaterials 29:2348-2358；Baker等人(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.,109:14176-14181)。这种方法仅产生孔隙率的有限增加。基于相似的原理，使用冰晶作为牺牲模板来制备具有大的互连孔的3D电纺纳米纤维支架(Leong等人(2009)J.Biomed.Mater.Res.A,91:231-240)。类似地，在电纺丝过程中引入电纺纳米纤维支架的盐颗粒导致在沥滤后形成大孔≈100μm(Nam等人(2007)Tissue Eng.,13:2249-2257)。这种策略需要涉及多个步骤的牺牲模板的去除。如上所述，这些方法与各种问题相关，包括难以控制厚度、局限于某些材料、无规取向的纳米纤维、需要添加剂、加工耗时、需要水溶液、膨胀比不足和/或多个步骤。

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利用由水溶液中的化学反应产生的气泡，电纺纳米纤维垫可以在第三维中膨胀成

具有有序结构(Jiang等人(2015)ACS Biomater.Sci.Eng.,1:991-1001；Jiang等人(2016)Adv.Healthcare Mater.,5:2993-3003；Joshi等人(2015)Chem.Eng.J., 275:79-88)。与先前的方法相比，这种方法克服了上述缺点中的一些，并且显示了在产生3D电纺纳米纤维支架方面的一些改进。尽管纳米纤维垫的膨胀伴随在整个支架中发生细胞浸润和增殖(Jiang等人(2015)ACS Biomater.Sci.Eng.,1:991-1001；Jiang等人(2016)Adv.Healthcare Mater.,5:2993-3003)，但膨胀过程仍存在一些问题：i)它是多步骤、耗时的过程，包括在水溶液中的气体产生过程，随后进行冷冻干燥；ii)存在NaBH4可与聚合物或包封的物质反应的风险；iii)包封在纤维中的生物活性物质可能有损失；iv)对于掺入纤维中的材料，可能存在生物活性的损失；和v)该方法限于水不溶性材料。

[0019]亚临界CO2流体已用于油和香料萃取以及用于聚合物材料的加工，因为它无毒、不易燃、廉价且环境友好(Garland等人(2016)J.Essential Oil Res.,28:55-63；Taraj等人(2013)Asian J.Chem.,25:7361-73；Rout等人(2008)J.Supercritical Fluids 45:200-205；Bhamidipati等人(2013)Mater.Sci.Eng.C Mater.Biol.Appl.,33:42-49；Wang等人(2007)Cellular Polym.,26:11-35；Yang等人(2005)J.Vac.Sci.Tech.B,23:3202)。本文中，一种通过将纤维垫浸入亚临界CO2流体中然后减压而将传统的电纺聚(ε-己内酯)(PCL)纳米纤维垫从2D加工至3D的简单且新颖的方法。用CO2膨胀的3D纳米纤维支架可具有与在水溶液中使用生成气体的化学反应产生的支架类似的结构。与先前的方法相比，由于低温过程，用CO2膨胀的3D纳米纤维支架还可以更好地保持包封的生物活性材料的活性。此外，与传统的2D纳米纤维膜相比，具有阵列孔的CO2膨胀的3D纳米纤维支架促进细胞浸润、新血管形成和阳性宿主应答。[0020]根据本发明，提供了纳米纤维结构(有时在本文中称为支架或纳米纤维)。本发明的纳米纤维可以通过任何方法制造。在一个特定的实施方案中，所述纳米纤维结构包含电纺纳米纤维。在一个特定的实施方案中，纳米纤维结构包括单轴对齐的纤维、无规纤维和/或缠结纤维。虽然本申请一般性地描述了纳米纤维(直径小于约1μm(例如，平均直径)的纤维)结构和三维纳米纤维结构的合成，但本发明还涵盖微纤维(直径大于约1μm(例如，平均直径)的纤维)结构和三维微纤维结构的合成。在一个特定的实施方案中，使用亚临界流体或液体，特别是亚临界CO2，来膨胀所述纳米纤维结构。亚临界流体或液体的实例包括但不限于CO2、N2、N2O、烃和碳氟化合物。例如，可通过暴露于、接触或置于(例如浸没或浸入)亚临界液体/流体(例如亚临界CO2)然后减压而膨胀纳米纤维结构(例如垫)。将所述纳米纤维结构置于亚临界CO2中并减压的循环可以进行一次或多次，例如至少两次或三次。所述纳米纤维结构可以(例如在膨胀之前)进行交联。[0021]可以设想，本发明的纳米纤维支架可以形成和制造成各种形状(例如圆形、正方形、矩形)、尺寸和厚度。例如，所述纳米纤维结构可以在膨胀之前进行切割或成形。在一个实施方案中，所述膨胀的纳米纤维支架为约1至约20mm厚。在另一个实施方案中，所述膨胀的纳米纤维支架为约1至约10mm厚。在另一个实施方案中，所述膨胀的纳米纤维支架为约1至约5mm厚。

[0022]本发明的纳米纤维可以包含任何聚合物。在一个特定的实施方案中，所述聚合物是生物相容性的。所述聚合物可以是可生物降解的或不可生物降解的。在一个特定的实施

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方案中，所述聚合物为生物可降解聚合物。聚合物可以是疏水性的、亲水性的或两亲性的。在一个特定的实施方案中，聚合物是疏水性的。在一个特定的实施方案中，聚合物是亲水性的。聚合物可以是例如均聚物、无规共聚物、共混聚合物、共聚物或嵌段共聚物。嵌段共聚物最简单地定义为至少两种不同聚合物片段或嵌段的共轭物。聚合物可以是例如线性、星状、接枝、支化、基于树枝状的或超支化的(例如至少两个支化点)。本发明的聚合物可具有约2至约10,000、约2至约1000、约2至约500、约2至约250，或约2至约100个重复单元或单体。本发明的聚合物可以包含封端末端。

[0023]疏水性聚合物的实例包括但不限于：聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚乳酸(PLA(或PDLA))、聚(丙交酯-co-乙交酯)(PLG)、聚乳酸-co-乙醇酸)(PLGA)、聚乙交酯或聚乙醇酸(PGA)、聚己内酯(PCL)、聚天冬氨酸、聚噁唑啉(例如丁基、丙基、戊基、壬基或苯基聚(2-噁唑啉))、聚氧丙烯、聚谷氨酸、聚富马酸丙二醇酯(PPF)、聚碳酸三亚甲基酯、聚氰基丙烯酸酯、聚氨酯、聚原酸酯(POE)、聚酐、聚酯、聚环氧丙烷、聚己内酯富马酸酯、聚1,2-环氧丁烷、聚正环氧丁烷、聚乙烯亚胺、聚四氢呋喃、乙基纤维素、聚二吡咯/二咔唑、淀粉、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚二恶烷酮(PDO)、聚醚聚氨酯脲(PEUU)、醋酸纤维素、聚丙烯(PP)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、尼龙(例如尼龙6)、聚己内酰胺、PLA/PCL、聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)(PHBV)、PCL/碳酸钙，和/或聚苯乙烯。[0024]亲水性聚合物的实例包括但不限于：聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇和聚环氧乙烷(PEO)、壳聚糖、胶原、硫酸软骨素、藻酸钠、明胶、弹性蛋白、透明质酸、丝纤蛋白、藻酸钠/PEO、丝/PEO、丝纤蛋白/壳聚糖、透明质酸/明胶、胶原/壳聚糖、硫酸软骨素/胶原，和壳聚糖/PEO。

[0025]两亲性共聚物或聚合物复合材料可包含来自上文列出的那些(例如明胶/聚乙烯醇(PVA)、PCL/胶原、壳聚糖/PVA、明胶/弹性蛋白/PLGA、PDO/弹性蛋白、PHBV/胶原、PLA/透明质酸、PLGA/透明质酸、PCL/透明质酸、PCL/胶原/透明质酸、明胶/硅氧烷、PLLA/MWNT/透明质酸)的亲水性聚合物(例如片段)和疏水性聚合物(例如片段)。

[0026]Xie等人提供了特别用于静电纺丝的聚合物的实例(Macromol.Rapid Commun.(2008)29：1775-1792；通过引用并入本文；参见例如表1)。用于本发明的纤维，特别是用于电纺纳米纤维的化合物或聚合物的实例包括但不限于：天然聚合物(例如壳聚糖、明胶、I型、II型和/或III型胶原、弹性蛋白、透明质酸、纤维素、丝纤蛋白、磷脂(卵磷脂)、纤维蛋白原、血红蛋白、纤维小牛胸腺Na-DNA、病毒M13病毒)、合成聚合物(例如PLGA、PLA、PCL、PHBV、PDO、PGA、PLCL、PLLA-DLA、PEUU、醋酸纤维素、PEG-b-PLA、EVOH、PVA、PEO、PVP)、共混的(例如PLA/PCL、明胶/PVA、PCL/明胶、PCL/胶原、藻酸钠/PEO、壳聚糖/PEO、壳聚糖/PVA、明胶/弹性蛋白/PLGA、丝/PEO、丝纤蛋白/壳聚糖、PDO/弹性蛋白、PHBV/胶原、透明质酸/明胶、胶原/硫酸软骨素、胶原/壳聚糖)和复合材料(例如PDLA/HA、PCL/CaCO3、PCL/HA、PLLA/HA、明胶/HA、PCL/胶原/HA、胶原/HA、明胶/硅氧烷、PLLA/MWNTs/HA、PLGA/HA)。在一个特定的实施方案中，所述纳米纤维包含聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯基苯酚、聚氯乙烯、纤维素、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、PLGA、胶原、聚己内酯、聚氨酯、聚氟乙烯、聚酰胺、丝、尼龙、聚苯并咪唑(polybennzimidazole)、聚碳酸酯、聚丙烯腈、聚乙烯醇、聚乳酸、聚乙烯-co-乙酸乙烯酯、聚环氧乙烷、聚苯胺、聚苯乙烯、聚乙烯咔唑、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚丙烯酸-聚芘甲醇、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚醚酰亚胺、聚乙二醇、聚(乙烯-co-乙烯醇)、聚丙烯腈、聚乙烯

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吡咯烷酮、聚间苯二甲酰间苯二胺、明胶、壳聚糖、淀粉、果胶、纤维素、甲基纤维素、聚丙烯酸钠、淀粉-丙烯腈共聚物，和/或两种或多种聚合物的组合。在一个特定的实施方案中，所述聚合物包括聚已酸内酯(PCL)。在一个特定的实施方案中，所述聚合物包括聚己内酯(PCL)和明胶(例如比率为1:1)。

[0027]在一个特定的实施方案中，所述纳米纤维结构包含增强所述纳米纤维结构吸收流体的能力的材料，所述流体特别是水溶液(例如血液)。在一个特定的实施方案中，所述纳米纤维包括聚合物和增强吸收性能的材料。在一个特定的实施方案中，所述纳米纤维结构涂覆有增强吸收性能的材料。术语“涂层(coat)”是指在结构表面上的物质/材料层。涂层可以但不必也浸渍所述纳米纤维结构。此外，虽然涂层可以覆盖100％的所述纳米纤维结构，但涂层也可以覆盖小于100％的所述纳米纤维结构的表面(例如，可以覆盖至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或更多的表面)。增强所述膨胀的纳米纤维结构的吸收性能的材料包括但不限于：明胶、藻酸盐、壳聚糖、胶原、淀粉、果胶、纤维素、甲基纤维素、聚丙烯酸钠、淀粉-丙烯腈共聚物、其他天然或合成水凝胶，及其衍生物(例如，del Valle等人,Gels(2017)3:27)。在一个特定的实施方案中，所述材料为水凝胶(例如，能够在溶胀状态下保水，特别是大量的水的聚合物基质)。在一个特定的实施方案中，所述材料为明胶。在一个特定的实施方案中，所述膨胀的纳米纤维结构涂覆有约0.05％至约10％的涂层材料(例如，明胶)，特别是约0.1％至约10％的涂层材料(例如，明胶)或约0.1％至约1％的涂层材料(例如，明胶)。在一个特定的实施方案中，所述材料(例如，水凝胶)是交联的。

[0028]在一个特定的实施方案中，本发明的纳米纤维结构是交联的。例如，本发明的纳米纤维结构可以用交联剂交联，所述交联剂例如但不限于：甲醛、多聚甲醛、乙醛、戊二醛、光交联剂、京尼平和天然酚类化合物(Mazaki等人,Sci.Rep.(2014)4:4457；Bigi等人,Biomaterials(2002)23:4827-4832；Zhang等人,Biomacromolecules(2010)11:1125-1132；通过引入并入本文)。交联剂可以是双官能、三官能或多官能交联剂。在一个特定的实施方案中，所述交联剂是戊二醛。[0029]如上文所述，本发明的纳米纤维结构是膨胀的。电纺纳米纤维通常沉积在基底上以形成纳米纤维垫。然而，所述纳米纤维垫通常是致密且密实包装的。这些纳米纤维垫可通过使用亚临界流体，尤其是亚临界CO2，进行膨胀。虽然本发明一般地描述为使用亚临界CO2，但也可如所述使用其它亚临界流体。在一个特定的实施方案中，可将所述纳米纤维结构暴露于亚临界CO2、与其接触或置于其中，然后减压。可将所述纳米纤维结构多于一次地与亚临界CO2接触或置于其中，然后减压。通常，使用膨胀方法的次数越多，所述纳米纤维(或微纤维)结构的厚度和孔隙率增加。例如，暴露于亚临界CO2然后减压的循环可以进行1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次，特别是1-10次、1-5次或1-3次。在一个特定的实施方案中，暴露于亚临界CO2然后减压的循环进行至少2次(例如2-5次、2-4次或2-3次)。在一个特定的实施方案中，所述方法包括将纳米纤维结构和干冰(固体CO2)置于密封容器中，允许干冰转变为液体CO2，然后将该容器开封以允许减压。[0030]所述纳米纤维结构和亚临界流体(例如亚临界CO2；或固体形式的亚临界流体(例如干冰))可包含在任何合适的容器(例如可耐高压的容器)中。例如，亚临界流体和纳米纤维结构可包含在不限于：腔室、罐、反应器、腔室和管内。在一个特定的实施方案中，在本发

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明的方法中使用的设备或容器将具有允许控制亚临界流体的减压速率的特征或部件。亚临界流体的减压可使用多种方法来完成，包括但不限于手动打开容器以降低压力或通过使用可调节反应容器的减压速率的某种类型的设备。[0031]所述纳米纤维结构也可在模具(例如，由金属、塑料或具有限定形状和/或可经受亚临界流体(例如亚临界CO2)和减压的其它材料制成)内膨胀，使得膨胀的纳米纤维结构形成所需形状(例如垫、管、圆柱体、矩形盒、珠等)。在一个特定的实施方案中，模具通过3D打印机合成。所述模具可以包含允许在纳米纤维结构中冲压相应孔的孔。本发明的纳米纤维结构也可在膨胀后进行处理以形成所需形状(例如垫、管、珠等)。[0032]如上文所述，本发明的纳米纤维结构也可以包含孔或洞。所述洞/孔可在纳米纤维支架膨胀之前或之后在纳米纤维支架中制成。在一个特定的实施方案中，在膨胀前插入所述纳米纤维结构的孔。在一个特定的实施方案中，在插入或冲孔之前，所述纳米纤维结构被冷冻(例如在液氮中)。所述纳米纤维结构的孔可以是任何形状(例如，正方形、圆形)。所述纳米纤维结构的孔可以是任何尺寸。在一个特定的实施方案中，孔/洞具有约0.1至约5mm，特别是约0.5至约3mm或约1.0mm的长度/维度或直径。所述孔可以以阵列(例如正方形阵列)组织在纳米纤维结构内。在一个特定的实施方案中，所述纳米纤维结构的孔通常彼此等距。所述纳米纤维结构的孔/洞可以全部是相同的尺寸或者可以是不同尺寸。可在纳米纤维支架中制备任何数量的洞。在一个实施方案中，洞的数目在约1和约200之间。可以使用多种方法制备洞。在一个实施方案中，使用具有预设孔的模具作为模板以在纳米纤维支架中冲出洞/孔。所述模板可以使用各种技术来制造，包括但不限于3D打印。[0033]在膨胀之后，纳米纤维结构可以在水和/或期望的载体或缓冲液(例如，药学或生物学可接受的载体)中洗涤或漂洗。可以通过对纳米纤维结构施加真空来去除捕获的气泡。例如，膨胀的纳米纤维结构可以浸没或浸入在液体(例如水和/或期望的载体或缓冲液)中，并且可以施加真空以快速除去气泡。在膨胀之后(例如，在漂洗和去除捕获的气体之后)，所述纳米纤维结构可以储存在冷溶液中、被冻干和/或冷冻干燥。[0034]本发明的纳米纤维结构液还可以是经过灭菌的。例如，可使用各种方法(例如通过用环氧乙烷气体、γ辐射或70％乙醇处理)将所述纳米纤维结构灭菌。[0035]本发明的纳米纤维结构的孔/洞可以包含细胞或组织。在一个特定的实施方案中，所述细胞对于待用纳米纤维结构治疗的受试者是自体的。任何细胞类型可以加入到孔/洞中。在一个特定的实施方案中，所述细胞包括干细胞。在一个特定的实施方案中，所述细胞包括真皮成纤细胞。在一个特定的实施方案中，所述孔/洞含有细胞球体。在一个特定的实施方案中，所述孔/洞包含组织样本(例如组织糜)，诸如皮肤组织样本或骨样本。在一个特定的实施方案中，所述组织样品具有约0.1至约5mm，特别是约0.5至约3mm或约1.0mm的长度/维度或直径。所述细胞或组织可在纳米纤维结构的孔/洞中培养(例如，所述细胞或组织可培养足够的时间以允许浸润到所述纳米纤维结构中)。例如，可将所述细胞或组织在纳米纤维结构中培养1天、2天、3天、4天、5天或更久。

[0036]本发明的纳米纤维结构可包含或包封至少一种药剂，特别是生物活性剂，例如药物或治疗剂(例如，镇痛剂、生长因子、抗炎剂、信号分子、细胞因子、抗微生物剂(例如，抗细菌剂、抗生素、抗病毒剂和/或抗真菌剂)、凝血的药剂、因子或蛋白质等)。在一个特定的实施方案中，所述药剂是亲水性的。所述药剂可以在合成期间和/或合成之后添加到所述纳米

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纤维结构。所述药剂可以与纳米纤维结构和/或涂层材料结合，被纳米纤维结构包封，和/或涂覆在纳米纤维结构上(例如，与增强纳米纤维结构吸收流体的能力的涂层一起、在该涂层下面、和/或在该涂层上面)。在一个特定的实施方案中，所述药剂不直接与所述纳米纤维结构结合(例如包封的)。在一个特定的实施方案中，所述药剂与所述纳米纤维结构结合或连接(例如表面结合或涂层)。在一个特定的实施方案中，所述药剂与所述膨胀纳米纤维结构一起施用但不掺入所述膨胀的纳米纤维结构中。[0037]在一个特定的实施方案中，所述药剂增强组织再生、组织生长和伤口愈合(例如生长因子)。在一个特定的实施方案中，所述药剂治疗/预防感染(例如抗微生物剂，如抗细菌剂、抗病毒剂和/或抗真菌剂)。在一个特定的实施方案中，所述药剂为抗微生物剂，特别是抗细菌剂。在一个特定的实施方案中，所述药剂增强伤口愈合和/或增强组织再生(例如，骨、肌腱、软骨、皮肤、神经和/或血管)。例如，这样的药剂包括生长因子、细胞因子、趋化因子、免疫调节化合物和小分子。生长因子包括但不限于：血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF，多种同种型；例如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF))、胰岛素样生长因子(IGF-1和/或IGF-2)、骨形态发生蛋白(例如BMP-2、BMP-7、BMP-12、BMP-9)、转化生长因子(例如TGFβ、TGFβ3)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子、基质衍生因子-1(SDF-1)、神经胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)和/或角质形成细胞生长因子(KGF)。小分子包括但不限于辛伐他丁、kartogenin、维甲酸、紫杉醇、维生素D3等。

[0038]根据本发明的另一个方面，提供了合成所述纳米纤维结构的方法。在一个特定的实施方案中，所述方法包括通过使纳米纤维结构或垫接触(例如浸没或浸入)亚临界CO2(例如在密封容器中)并减压来使纳米纤维结构或垫膨胀。与亚临界CO2接触和减压可以重复一次以上。在一个特定的实施方案中，所述方法还包括在膨胀之前电纺所述纳米纤维结构或垫。在一个特定的实施方案中，所述方法包括使所述纳米纤维结构或垫交联(例如在膨胀之前或之后)。在一个特定的实施方案中，所述方法还包括冷冻(例如用液氮)所述纳米纤维结构或垫(例如在膨胀之前或之后)。在一个特定的实施方案中，所述方法还包括在纳米纤维结构中插入孔或冲孔(例如在膨胀之前或之后)。在一个特定的实施方案中，所述方法还包括将所述膨胀的纳米纤维结构洗涤和/或灭菌。在一个特定的实施方案中，所述方法还包括将细胞和/或组织接种到所述膨胀的纳米纤维结构的孔或洞中。在一个特定的实施方案中，所述方法还包括在膨胀之前对所述纳米纤维垫或结构进行等离子体处理。在一个特定的实施方案中，在气体膨胀后在纳米纤维结构中冲孔。在一个特定的实施方案中，所述方法还包括在纳米纤维结构内培养细胞(例如使细胞从孔/洞浸润纳米纤维结构)。

[0039]本发明的纳米纤维结构可用于产生用于各种应用的复杂组织结构，包括但不限于：伤口愈合、组织工程、组织生长、组织修复、组织再生和工程化3D体外组织模型。所述纳米纤维结构还可以与各种水凝胶或生物基质/线索组合以形成可释放生物功能分子的3D杂化支架。所述组织构建体可以用于许多组织缺陷(例如皮肤、骨)的再生和各种伤口(例如损伤、糖尿病伤口、静脉溃疡、压力性溃疡、烧伤)的愈合。所述纳米纤维结构可以离体地用于产生组织或组织构建体/模型。所述纳米纤维结构也可在患者(例如人或动物)体内用于治疗各种疾病、病症和伤口。在一个特定的实施方案中，当体内应用时，所述纳米纤维结构刺激现有组织的生长和/或伤口或缺陷的修复。所述纳米纤维支架可用于各种组织的工程化、

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生长和/或再生，包括但不限于皮肤、骨、软骨、肌肉、神经组织和器官(或其部分)。[0040]根据本发明，纳米纤维结构可用于诱导和/或改善/增强伤口愈合，以及诱导和/或改善/增强组织再生。本发明的纳米纤维结构可用于治疗、抑制和/或预防任何损伤或伤口。例如，所述纳米纤维结构可用于诱导、改善或增强与手术相关的伤口愈合(包括非选择性(例如，紧急)外科手术或选择性外科手术)。选择性外科手术包括但不限于：肝切除术、肾部分切除术、胆囊切除术、血管缝合线加固和神经外科手术。非选择性外科手术包括但不限于：严重的鼻出血、脾损伤、肝破裂、空腔伤口、轻微切口、刺伤、伤和弹片伤口。本发明的纳米纤维结构还可以结合到输送装置(例如，注射器)中，所述输送装置使得其直接注射/输送到所需部位(例如伤口，如伤)。所述纳米纤维结构也可使用加压插管直接递送到腔室(例如腹膜腔)中。

[0041]根据本发明，还提供了用于诱导和/或改善/增强受试者的伤口愈合的方法。本发明还包括诱导和/或改善/增强受试者的组织再生(例如，血管生长、神经组织再生和骨再生)的方法。本发明的方法包括向受试者施用或应用本发明的纳米纤维结构(例如在伤口处或伤口内)。在一个特定的实施方案中，该方法包括施用包含如上所述的药剂的纳米纤维结构。在一个特定的实施方案中，该方法包括向受试者施用纳米纤维结构和如上文所述的药剂(即，该药剂不包含在纳米纤维结构内)。当单独施用时，纳米纤维结构可以与药剂同时和/或依序施用。该方法可包括施用一种或更多种纳米纤维结构。当施用多于一种纳米纤维结构时，纳米纤维结构可以同时和/或依序施用。[0042]定义

[0043]单数形式“一(a或an)”和“所述(the)”包括复数的所指对象，除非上下文中另外有明确说明。

[0044]如本文所使用的，术语“电纺丝”是指使用流体动力学和带电表面之间的相互作用从溶液或熔造纤维(即电纺纤维)，特别是微米或纳米尺寸的纤维(例如，通过响应于电场使溶液或熔体流动通过孔)。电纺纳米纤维的形式包括但不限于支化纳米纤维、管、带和纳米纤维、纳米纤维纱、表面涂覆的纳米纤维(例如，用碳、金属等涂覆)、在真空中产生的纳米纤维等。电纺纤维的生产描述于例如Gibson等人(1999)AlChE J.，45:190-195中。[0045]“药学上可接受的”表示由联邦或州的管理机构批准或在美国药典或其它公认的药典中列出的用于动物，更特别是用于人。[0046]“载体”是指与本发明的活性剂一起施用的例如稀释剂、佐剂、防腐剂(例如，Thimersol、苄醇)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、增溶剂(例如聚山梨酯80)、乳化剂、缓冲剂(例如，TrisHCl、乙酸盐、磷酸盐)、水、水溶液、油、膨胀物质(例如乳糖、甘露醇)、赋形剂、助剂或媒介物。合适的药物载体描述在E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”(Mack Publishing Co.,Easton,PA)；Gennaro,A.R.,Remington:The Science and Practice of Pharmacy,(Lippincott,Williams and Wilkins)；Liberman等人,编辑,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,New York,N.Y.；and Kibbe等人,编辑,Handbook of Pharmaceutical Excipients(第3版),American Pharmaceutical Association,Washington。[0047]如本文所用，术语“聚合物”表示由两个或更多个重复单元或单体化学连接形成的分子。术语“嵌段共聚物”最简单地是指至少两种不同聚合物片段的共轭物，其中每个聚合

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物片段包含两个或更多个相同类型的相邻单元。[0048]“疏水性”表示优选非极性环境(例如，相对于水，疏水性物质或结构部分更容易溶解在非极性溶剂例如烃中，或被其润湿)。在一个特定的实施方案中，疏水性聚合物可具有在37℃下小于约1重量％的水溶解度。在一个特定的实施方案中，在双蒸水中的1％溶液中具有低于约37℃，特别是低于约34℃的浊点的聚合物可以被认为是疏水性的。[0049]如本文所用，术语“亲水性”是指溶于水的能力。在一个特定的实施方案中，在双蒸水中的1％溶液中具有高于约37℃，特别是高于约40℃的浊点的聚合物可以被认为是亲水性的。

[0050]如本文所用，术语“两亲性”是指既溶于水又溶于脂质/非极性环境中的能力。通常，两亲性化合物包含亲水性部分和疏水性部分。[0051]如本文所用的术语“抗微生物剂”表示杀死或抑制微生物如细菌、真菌、病毒或原生动物生长的物质。[0052]如本文所用，术语“抗病毒剂”是指破坏病毒和/或抑制病毒复制(繁殖)的物质。例如，抗病毒剂可以抑制和/或预防：病毒颗粒的产生、病毒颗粒的成熟、病毒附着、病毒摄入细胞、病毒组装、病毒释放/出芽、病毒整合等。[0053]如本文所用，术语“抗生素”是指用于哺乳动物，特别是人类的治疗的抗细菌剂。抗生素包括但不限于β-内酰胺类(例如青霉素、氨苄青霉素、苯唑西林、氯唑西林、甲氧西林和头孢菌素)、碳头孢烯、头霉素、碳青霉烯、单酰胺菌素、氨基糖苷类(例如庆大霉素、妥布霉素)、糖肽类(例如万古霉素)、喹诺酮类(例如环丙沙星)、默诺霉素、四环素类、大环内酯类(例如红霉素)、氟喹诺酮类、噁唑烷酮类(例如利奈唑胺)、脂肽类(例如达托霉素)、氨基香豆素(例如新生霉素)、复方新诺明(例如甲氧苄氨嘧啶和磺胺甲恶唑)、林可酰胺类(例如，克林霉素和林可霉素)、多肽类(例如，粘菌素)，及其衍生物。[00]如本文所用，“抗炎剂”是指用于治疗或抑制炎症的化合物。抗炎剂包括但不限于非甾体抗炎药(NSAID；例如阿司匹林、布洛芬、萘普生、水杨酸甲酯、二氟尼柳、吲哚美辛、舒林酸、双氯芬酸、酮洛芬、酮咯酸、卡洛芬、非诺洛芬、甲芬那酸、吡罗昔康、美洛昔康、甲氨蝶呤、塞来昔布、伐地考昔、帕瑞考昔、依托考昔和尼美舒利)、皮质类固醇(例如泼尼松、倍他米松、布地奈德、可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基泼尼松龙、泼尼松龙、曲安西龙和氟替卡松)、雷帕霉素、对乙酰氨基酚、糖皮质激素、类固醇、β-激动剂、抗胆碱药、甲基黄嘌呤、金注射剂(例如金硫苹果酸钠)、柳氮磺胺吡啶和氨苯砜。[0055]如本文所用，术语“受试者”是指动物，特别是哺乳动物，特别是人。[0056]如本文所用，术语“预防”是指对处于患病风险的受试者进行预防性治疗，导致受试者患病的可能性降低。[0057]本文所用的术语“治疗”是指对患有疾病的患者有益的任何类型的治疗，包括改善患者的病情(例如，有一种或多种症状)、延缓病情的进展等。[0058]如本文所用，术语“镇痛剂”是指减少、缓和、减轻、缓解或消除受试者的身体局部疼痛的药剂(即，具有减轻或消除疼痛和/或疼痛知觉的能力的镇痛剂)。[0059]如本文所用，术语“小分子”是指具有相对低分子量(例如小于2,000)的物质或化合物。通常，小分子是有机的，但不是蛋白质、多肽或核酸。[0060]术语“水凝胶”是指遇水可溶胀的不溶性聚合物基质(例如亲水性聚合物)，其包含

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可吸收水以形成凝胶的任选交联的大分子网络。[0061]术语“交联”是指连接在两个不同分子之间并连接两个不同分子(例如聚合物链)的键或原子链。术语“交联剂”是指能够在化合物之间形成共价键的分子。“光交联剂”是指在光诱导(例如暴露于可见和近可见范围内的电磁辐射)之后能够在化合物之间形成共价键的分子。交联剂在本领域中是公知的(例如甲醛、多聚甲醛、乙醛、戊二醛等)。交联剂可以是双官能、三官能或多官能交联剂。

[0062]以下实施例是为了举例说明本发明的某些实施方案。其并非意在以任何方式本发明。

[0063]实施例[00]材料和方法

[0065]2D纳米纤维膜的制造[0066]利用标准电纺丝(Jiang等人(2015)ACS Biomater.Sci.Eng.,1:991-1001；Jiang等人(2016)Adv.Healthcare Mater.,5:2993-3003)生产PCL纳米纤维垫。简言之，将PCL(Mw＝80kDa)以10％(w/v)的浓度溶解在由具有4:1(v/v)比率的二氯甲烷(DCM)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)组成的溶剂混合物中。使用注射泵以0.8mL/h的流速泵送PCL溶液。用在PCL溶液中的50μg/mL香豆素6制备负载有香豆素6的PCL纤维。通过同轴电纺丝将LL37负载到PCL纤维中(Xie,J.等人(2012)Acta Biomater.,8:811-819)。芯部溶液由100mg/mL普朗尼克F-127和5mg/mL LL37的水溶液组成。流速设定为0.08mL/h。鞘部溶液是与上述相同的PCL溶液。在喷丝头(22号针)和位于离喷丝头20cm处的接地收集器之间施加15kV的电势。在转速为2000rpm的鼓上收集对齐的纳米纤维垫。制成的PCL纳米纤维垫和负载有香豆素6的PCL纳米纤维垫为约1mm厚。负载有LL37的PCL纳米纤维垫为约100μm厚。在液氮中通过0.5mm直径的冲孔机对原始PCL纤维垫进行冲孔以产生阵列孔。[0067]3D电纺纳米纤维支架的制造[0068]首先，在液氮中将PCL纳米纤维垫、负载有香豆素6的PCL纳米纤维垫、负载有LL37的PCL纳米纤维垫和具有阵列孔的PCL纳米纤维垫切割成1cm×1cm的正方形，以避免边缘上变形。接着，将～1g干冰和一片纳米纤维垫放入30mL Oak Ridge离心管中。在干冰变成CO2流体之后，迅速松开盖，并从管中移出膨化的纳米纤维支架。重复该膨胀过程，直到达到所需厚度。在与细菌孵育之前，通过环氧乙烷对纳米纤维支架进行灭菌。[0069]3D纳米纤维支架的表征

[0070]基于纳米纤维支架的体积变化，使用以下等式估计孔隙率：ε＝(V-V0)/V×100％，其中ε是孔隙率，V＝L(长度)×W(宽度)×T(厚度)是PCL纳米纤维支架的体积，V0＝m0/ρ0是散装PCL材料的计算体积，m0是散装PCL材料的质量，ρ0是散装PCL材料的密度(Jiang等人(2015)ACS Biomater.Sci.Eng，1:991-1001)。将膨胀前后的PCL纳米纤维垫嵌入去离子水中并在-20℃冷冻。通过低温恒温器获得纳米纤维支架的横截面并接着冷冻干燥。使用扫描电子显微镜(SEM)(FEI，Quanta200，Oregon)来表征纳米纤维支架的横截面形态。为了避免带电，将纳米纤维样品固定在具有双面导电带的金属柱上并在10mA的电流强度下在真空下使用溅射涂覆机用铂涂覆4分钟。在30kV的加速电压下获取SEM图像。使用Image J软件基于SEM图像测量在膨胀一次和两次之后纳米纤维支架的间隙距离和层厚度。分析了至少250个间隙或层。

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负载有香豆素6的3D纳米纤维支架

[0072]为了比较，将负载有香豆素6的PCL纳米纤维垫在1M NaBH4中膨胀1小时。如所述那样实施所述程序(Jiang等人(2015)ACS Biomater.Sci.Eng.,1:991-1001；Jiang等人(2016)Adv.Healthcare Mater.,5:2993-3003)。通过荧光显微镜，在488nm激发波长和530±20nm发射波长下观察CO2膨胀的负载有香豆素6的纳米纤维支架、NaBH4膨胀的负载有香豆素6的纳米纤维支架、原始的负载有香豆素6的纳米纤维垫和原始PCL纤维垫的上表面，并通过CCD照相机以相同的曝光时间拍摄图像。实验进行至少三次。使用Image J软件定量所述荧光强度。

[0073]负载有LL-37的3D纳米纤维支架

[0074]通过在37℃下将5mg纤维样品浸入5mL PBS中来评价LL37在膨胀前后从纳米纤维膜的体外释放动力学。在每个时间点收集上清液，并用新鲜的PBS溶液替换。通过LL37 ELISA试剂盒根据制造商的说明书测定所有收集的样品的LL37浓度。

[0075]使用铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)评价在膨胀前后负载有LL37的纤维膜的抗菌活性。简要地说，铜绿假单胞菌在液体Luria-Bertani(LB)培养基中在37℃下以220rpm在振荡孵育器中培养过夜。然后，将20μL悬浮细菌转移到4mL新鲜LB培养基中，并在37℃以220rpm再孵育2小时。将细菌悬浮液以12000rpm离心10分钟。除去上清液后，将细胞丸粒重新悬浮于1mL PBS中。该程序重复一次。用NanoDrop(Thermo Scientific，Wilmington，DE)测定细菌悬浮液的OD660值。OD660值约等于1.0×108CFU细菌。用PBS将细胞稀释到1.0×105、1.0×106和1.0×107CFU细菌中，并将5mg PCL纤维、未膨胀的负载有LL37的PCL纤维和膨胀的负载有LL37的PCL纤维加入到5mL含有细菌的培养基中，然后将培养物置于摇床上，在37℃和220rpm培养1小时。然后，将培养物铺展在LB琼脂平板上。在37℃下孵育12小时后，计数菌落的数目。用三个LB琼脂平板重复计数并取平均值。[0076]具有阵列孔的3D纳米纤维支架的制造和皮下植入

[0077]电纺纳米纤维膜首先在低于玻璃化转变温度的温度下冷冻(例如浸入液氮中)以使它们变脆，并且通过微冲头产生穿过纳米纤维膜的正方形阵列的孔。在环氧乙烷气体灭菌后，用0.5％明胶涂覆具有阵列孔(10mm×10mm×10mm)的膨胀PCL纳米纤维支架并交联以防止塌陷，然后切成1mm厚并浸泡在盐水中，接着皮下植入9周龄的Sprague Dawley(SD)大鼠(250-300g)中。简言之，使用4％异氟烷在氧气中麻醉大鼠约2分钟。将大鼠置于加热垫上以维持其体温。将每只动物背部上8×4cm2的面积剃毛，并将聚维酮碘溶液在暴露的皮肤上施用三次。每只大鼠接受4个植入物；通过在背部4个脊柱上部位的1.5cm切口制造皮下袋。将每个植入物轻轻地插入皮肤下的皮下袋中以避免压缩，然后用缝合器闭合皮肤切口。在植入后1、2和4周，用CO2对大鼠实施安乐死。将每个具有周围组织的外植体轻轻地从其皮下袋中切开，然后在组织学分析前浸入中至少3天。[0078]组织学和免疫组织化学分析

[0079]将固定的样品在梯度乙醇系列(70％-100％)中脱水，包埋在石蜡中，然后切片(4μm)。样品用苏木精和曙红(H&E)或马森三色染色法进行。进行免疫组织化学染色以表征响应于具有阵列孔的膨胀的纳米纤维支架的巨噬细胞表型。将载玻片脱蜡，随后在加热的柠檬酸盐缓冲液中抗原修复10分钟(10mM柠檬酸盐，95-100℃下pH6.0)。通过在3％H2O2中孵育切片5分钟封闭过氧化物酶。用封闭溶液(2％正常山羊血清，0.1％Triton X-100的PBS溶液；

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室温下1小时)防止非特异性抗体结合。将切片轻轻倒出，并与在封闭溶液中1:200稀释的第一抗体一起在4℃下孵育过夜。使用针对泛巨噬细胞标记物CD68、M1巨噬细胞标记物CCR7和M2巨噬细胞标记物CD206的第一抗体。[0080]组织形态和巨噬细胞表型定量[0081]H&E染色、Masson三色染色和CD68、CCR7和CD206的免疫组织化学染色的显微图像都是用Ventana公司的Coreo AuTM幻灯片扫描仪获得的，并用Ventana图像观察器v3.1.3编辑。将放大率设定为4×、10×和40×，然后在各样品上的三个随机位置处拍摄快照。使用Ventaina图像观察器测量血管的数量。将血管的数量转换成每mm2的计数。通过Masson三色染色图像定量每个样本中的所有异物巨细胞。从三个实验获得体内实验数据。图像用Ventana的Coreo AuTM载玻片扫描仪捕获。对每个植入物评价三个切片。在每个组织切片上随机收集40×放大率的CD68、CCR7和CD163阳性免疫组织化学染色图像的总共6个快照。定量每个快照中阳性细胞的数量。[0082]统计分析

[0083]每个数据点代表三次重复的平均值。对从至少三个实验获得的数据的平均值进行统计分析。所有结果作为平均值给出，并使用方差分析(ANOVA)进行比较，然后进行LSD事后评估，以评价统计学个体内和个体间差异，显著性设置为p＜0.05。[0084]结果

[0085]3D电纺纳米纤维支架的制造和表征[0086]对于制造方法，产生电纺PCL纳米纤维垫，并将该垫切成所需尺寸(例如1cm×1cm)(Jiang等人(2015)ACS Biomater.Sci.Eng.,1:991-1001；Jiang等人(2016)Adv.Healthcare Mater.,5:2993-3003)。然后，在室温下将纳米纤维膜置于干冰存在下的离心管中，并将盖子拧紧。在干冰变成液体之后，将CO2流体快速减压，导致3D纳米纤维支架的形成(图1A)。基于计算(Redlich-Kwong方程)，CO2液体处于亚临界状态。可以通过增加CO2流体处理次数来定制3D纳米纤维支架的厚度(图1B)。在用亚临界CO2流体进行第一次处理和第二次处理之后，纳米纤维垫的厚度从1mm增加到2.5mm，并进一步增加到10mm。[0087]对齐的PCL纳米纤维支架的孔隙率随着加工次数的增加而增加，这与厚度的增加相对应(图1C)。在用亚临界CO2流体进行第一次处理和第二次处理之后，纳米纤维支架的孔隙率从原始纳米纤维垫的78.5％增加到92.1％和99.0％(图1D)。为了在膨胀后保持纳米纤维支架的完整性，将支架包埋在冰水中的冰中，并通过切片机切片以暴露X-Y、Y-Z平面，然后使用冻干机冷冻干燥。为了揭示详细的结构，通过扫描电子显微镜(SEM)检测切片的样品。在膨胀之前，对齐的电纺PCL纳米纤维垫由致密填充的原纤维结构构成(图1E和1F)(Jiang等人(2015)ACS Biomater.Sci.Eng.,1:991-1001)。相比之下，通过亚临界CO2流体膨胀的纳米纤维支架显示具有由对齐的纳米纤维提供的保留的纳米形貌线索的层状结构(图1G和1H)，其对于腱、肌肉和神经组织的再生是关键的，并且类似于在NaBH4溶液中膨胀的纳米纤维支架(Jiang等人(2015)ACS Biomater.Sci.Eng.,1:991-1001；Jiang等人(2016)Adv.Healthcare Mater.,5:2993-3003)。证实了通过亚临界CO2流体膨胀的3D纳米纤维支架具有与在水溶液中使用生成气体的化学反应产生的那些类似的结构(Jiang等人(2015)ACS Biomater.Sci.Eng.,1:991-1001；Jiang等人(2016)Adv.Healthcare Mater.,5:2993-3003)。此外，似乎层厚度随着处理时间的增加而降低，而在膨胀一次和两次后，对

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于支架的间隙距离分布没有观察到显著差异。此外，证明了由水溶性聚合物(例如聚乙烯基吡咯烷酮(PVP))制成的纳米纤维膜的膨胀(图2)，这使用以前的方法(Jiang等人(2015)ACS Biomater.Sci.Eng.,1:991-1001；Jiang等人(2016)Adv.Healthcare Mater.,5:2993-3003；Joshi,et al.(2015)Chem.Eng.J.,275:79-88；Sheikh等人(2015)Nanomedicine:NBM,11:681-691；Lee等人(2011)Tissue Eng.Part A,17:2695-2702)不能实现。[0088]亚临界CO2处理对包封分子的影响

[00]3D支架不仅提供了用于细胞附着和生长的基底，而且提供了用于在植入后递送治疗剂以调节细胞应答或宿主免疫应答的局部装置。为了证明当前制造方法的优点，将疏水性和亲水性分子包封在纳米纤维支架中。选择疏水性荧光染料小分子香豆素6作为模型药物，其中已检验了许多小分子用于组织再生(Ding等人(2005)Curr.Top.Med.Chem.,5:383-395；Lu等人(2014)Drug Discovery Today 19:801-808).将香豆素6包封到PCL纳米纤维垫中(Xie等人(2006)Pharm.Res.,23:1817-1826)。使用1M的NaBH4溶液或亚临界CO2流体将纳米纤维垫从2D膨胀成3D。由于NaBH4的高还原性，香豆素6的绿色在1M的NaBH4溶液处理后褪色(图3)。对比之下，通过亚临界CO2流体膨胀的支架仍然是绿色的(图3)。每个样品的俯视图也通过荧光显微镜成像(图3)。原始PCL纤维样品在488nm没有显示出荧光(图3，右下)。然而，负载有香豆素6的PCL纤维垫显示最强的荧光(图3，右上)。NaBH4溶液膨胀的样品的荧光强度远低于亚临界CO2流体膨胀的样品。使用Image J软件对荧光强度进行的定量分析显示PCL纳米纤维显示出非常低的荧光强度(图3)。亚临界CO2流体膨胀的样品的荧光强度显著高于NaBH4溶液膨胀的样品的荧光强度。负载有香豆素6的PCL纳米纤维垫与亚临界CO2流体膨胀的纳米纤维垫之间的荧光强度的略微差异可能是由于结构差异(例如不同的纤维密度)。

[0090]至于另一种模型药物，选择称为LL-37的抗微生物肽。它是一种亲水性分子，已用于治疗感染、促进伤口愈合、增强血管生成和调节免疫应答(Fumakia等人(2016)Mol.Pharm.,13:2318-2331；Chereddy等人(2014)J.Controlled Rel.,194:138-147；Durr等人(2006)Biochim.Biophys.Acta,1758:1408-1425)。使用同轴电纺丝将LL37和Pluronic F127(表面活性剂)包封在LL37/普朗尼克F127-PCL芯-鞘纤维的芯中(Xie等人(2012)Acta Biomater.，8:811-819)。使用亚临界CO2流体膨胀所得的负载有LL37的纳米纤维垫。初始载药量为5μg LL37/1mg PCL纳米纤维。使用LL37 ELISA试剂盒测定LL37在亚临界CO2流体中膨胀前后从两种纳米纤维垫的体外释放动力学(图4A)。在第1周内，分别从原始的和膨胀的纤维样品中释放约75％和80％的LL37。膨胀的纤维支架的释放速率略高于未膨胀的样品，这可能是由于较高的孔隙率。

[0091]为了测试包封的LL-37在膨胀后的生物活性的保留，测量膨胀前后负载有LL-37的纳米纤维垫的抗菌性能(图4B)。使用原始PCL纤维垫作为对照，将1mg未膨胀的负载有LL37的PCL纤维垫和膨胀的3D的负载有LL37的PCL纤维支架与1.0×105、1.0×106和1.0×107CFU铜绿假单胞菌在1ml PBS同孵育1小时。如所预期的，原始PCL纤维垫没有显示出杀菌效果。膨胀和未膨胀的负载有LL37的PCL纤维膜都显示出相似水平的杀菌效果(图4B)，这表明亚临界CO2处理对包封的抗微生物肽的生物活性没有影响。因此，证实了通过亚临界CO2流体膨胀的3D纳米纤维支架与以前的方法(Jiang等人(2015)ACS Biomater.Sci.Eng.,1:991-1001；Jiang等人(2016)Adv.Healthcare Mater.,5:2993-3003)相比更好地保持了包封的

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生物活性材料的活性。

[0092]具有阵列孔的膨胀3D纳米纤维支架的制造

[0093]电纺纳米纤维膜从2D到3D的转变增加了纳米纤维支架的厚度和孔隙率；然而，细胞浸润只能从侧面发生，而不能从膨胀支架的顶面和底面发生(Jiang等人(2016)Adv.Healthcare Mater.,5:2993-3003)。尽管跨层血管化对于组织再生不是必需的(Mahjour等人(2016)J.Biomed.Mater.Res.A,104:1479-1488)，穿过不同层的细胞浸润可以有利于新组织形成及其整合到周围组织中。为了克服这种，将PCL纳米纤维膜浸入液氮中使它们变脆，并在低温条件下使用微冲头产生通过膜的阵列孔。这种方法显示，与激光烧结或室温冲孔(Walthers等人(2014)Biomaterials 35:5129-5137；Bonvallet等人(2014)Tissue Eng.Part A,20:2434-2445)不同，在冲孔表面的纳米纤维形态没有损伤或变形(图4C)。使用亚临界CO2流体将冲孔的纳米纤维膜膨胀成3D支架(图4D)。保持了层状结构，并且孔的表面表明纤维形态保持完整(图4D)。该方法进一步增加了膨胀的3D纳米纤维支架的孔隙率。

[0094]具有阵列孔的膨胀3D纳米纤维支架的体内应答[0095]为了进一步测试膨胀和冲孔对体内应答的影响，将具有阵列孔的3D膨胀的纳米纤维支架分别皮下植入大鼠中1周、2周和4周。似乎细胞生长到冲孔中，然后渗透到膨胀的纳米纤维支架内的薄纳米纤维层之间的空间中(图5)。Masson三色染色显示，绿色箭头指示胶原从浸润的细胞沉积在冲孔中和薄纳米纤维层之间的间隙中(图5B)。在薄纳米纤维层之间的孔或间隙中新形成的组织内也形成许多血管(图5C)。还存在多核巨细胞(图5D)。在第1、2和4周，每mm2的血管数分别为39、66和17左右(图5E)。在第2周形成的更多血管可归因于早期炎症反应。相反，在传统纳米纤维垫内未观察到新形成的血管(Jiang等人(2016)Adv.Healthcare Mater.,5:2993-3003)。对于具有阵列孔的膨胀的3D纳米纤维支架，每个植入物的多核巨细胞数目在第1、2和4周时分别为16、60和129(图5F)。为了比较，对于传统纳米纤维垫，每个植入物的多核巨细胞的数目接近16，但在第2周和第4周减少到9和6(Jiang等人(2016)Adv.Healthcare Mater.,5:2993-3003)。

[0096]对具有阵列孔的3D纳米纤维支架和周围组织进行免疫组织染色，以便用不同的表面标记鉴定浸润的巨噬细胞(图6)。结果表明，CCR7阳性细胞(M1期巨噬细胞，其促进炎症)的数量减少，而CD206(M2期巨噬细胞，其减少炎症并促进组织修复)和CD68(泛巨噬细胞)阳性细胞的数量随植入时间的增加而增加。具有不同表面标记的巨噬细胞的定量的数据示于图7，表明在植入后第4周M2/M1比率显著增加。对比之下，对于传统纳米纤维垫，M2/M1比率从第1周至第4周保持恒定(Jiang等人(2016)Adv.Healthcare Mater.,5:2993-3003)。为了揭示多核巨细胞的表达标记和时空分布，用不同的表面标记分析高度放大的免疫染色图像(图8)，表明多核巨细胞不均匀地表达CCR7、CD206和/或CD68标记，这对于新血管形成和组织再生可能是重要的(Barbeck等人(2016)J.Biomed.Mater.Res.Part A,104:413-418)。因此，证实了具有阵列孔的亚临界CO2流体膨胀的3D纳米纤维支架促进细胞浸润、新血管形成和阳性宿主应答。

[0097]由于仿生特性，电纺纳米纤维已经被广泛地用作再生医学的支架(Xie等人(2008)Macromol.Rapid Commun.,29:1775-1792)。然而，传统的电纺丝通常产生具有较小孔径和紧密结构的纳米纤维膜/垫，由于其固有性质而了细胞浸润(Jiang等人(2015)ACS 

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Biomater.Sci.Eng.,1:991-1001)。已经开发了3D电纺纳米纤维支架，其利用牺牲模板(例如亲水性纤维、冰和盐)、电场操作(例如定制的收集剂和离子盐的添加剂)、套索/编织、熔喷书写/印刷和改进的气体发泡(Xie等人(2012)Adv.Healthcare Mater.,1:674-678；Hochleitner等人(2015)Biofabrication 7:035002)。这些方法与各种问题有关(例如耗时、厚度有限，并且必须使用水溶液)。在该研究中，证实了通过亚临界CO2流体的减压产生3D纳米纤维支架的简单且新颖的方法。基于CO2相图(Mazzoldi等人(2008)Int.J.Greenh.Gas Con.,2:210-218)，当压力快速降低时，CO2液相变为气相。渗透纤维基质的CO2液体变成CO2气泡，使纤维基质大大膨胀。在排出CO2气体之后，可以容易地形成所述膨胀的纳米纤维支架而无需冷冻干燥。对于该膨胀过程，还免除了等离子体处理程序，因为CO2流体容易渗透PCL纳米纤维膜，这可能是由于其非极性性质。重要的是，该方法允许纳米纤维膜在数分钟内膨胀。与先前的方法相比，本文所述的方法节省时间，免除了水溶液和冷冻干燥过程的使用，是环境友好的，使用低温处理，并且保持了对齐的纳米形貌。重要的是，由水溶性聚合物(例如PVP)制成的纳米纤维膜可使用亚临界CO2流体膨胀成3D支架(图2)，这在之前的研究中是不可能的。此外，该CO2膨胀过程可保持包封分子的生物活性，这是很关键的，因为3D纳米纤维支架经常与生长因子或其它生物活性分子组合用于再生医学。[0098]使用改进的气体发泡技术，在水溶液中膨胀电纺纳米纤维膜。所得3D支架可促进细胞浸润通过纳米纤维层之间的间隙。在本工作中，由亚临界CO2流体产生的3D纳米纤维支架显示出与在NaBH4水溶液中膨胀的支架相似的结构。在冷冻条件下在整个支架上产生阵列孔以增强细胞浸润。实际上，细胞不仅从侧面而且从孔渗透支架(图5A)。基于免疫染色结果，确定了植入1、2和4周后支架内的M1巨噬细胞、M2巨噬细胞和多核巨细胞的细胞浸润和时空分布，其示意性地示于图9中。对于传统的纳米纤维垫，细胞通常留在边缘渗透的纳米纤维垫的表面上并形成胶原被膜(图9A)。对于CO2膨胀的具有阵列孔的3D纳米纤维支架，细胞在1周内浸润到冲孔中，并通过纳米纤维层之间的间隙继续渗透到支架中。巨噬细胞的浸润显示类似的趋势。在第1周和第2周有更多的M1巨噬细胞，但在第4周有更多的M2巨噬细胞。在第1周，多核巨细胞大部分位于冲孔的表面上。在第2周，在冲孔的表面上或在浸润的纤维层内形成一些巨细胞。在第4周，多核巨细胞相对均匀地分布在整个浸润的区域。此外，多核巨细胞显示出异质表型，具有包括CCR7、CD208和CD68的不同标记物阳性染色(图6)，表明其对于组织再生的重要性。本文所述的CO2膨胀的纳米纤维支架可用于特定组织的再生，特别是具有各向异性性质的那些组织，例如神经、肌肉和肌腱。[0099]总之，使用亚临界CO2流体已经证明了电纺纳米纤维膜从2D到3D的转变。该方法提供了优于先前方法的若干优点，例如缩短了加工时间，免除了水溶液和冷冻干燥程序的使用，并且避免了包封的生物制品的损失。最重要的是，这种方法在更大程度上保持了包封分子的生物活性。此外，在冷冻条件下，可通过微冲孔产生穿过纳米纤维膜的孔，以进一步促进细胞渗透和新血管形成。这些转化的3D纳米纤维支架可用于组织修复/再生、工程化3D组织模型、伤口敷料、止血和局部药物递送。

[0100]虽然上面已经描述和具体例示了本发明的某些优选实施方案，但是并不意味着本发明限于这样的实施方案。在不脱离如所附权利要求中阐述的本发明的范围和精神的情况下，可以对其进行各种修改。

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