SSR引物的筛选步骤

SSR引物的筛选步骤

（1）利用琼脂糖凝胶电泳对引物可扩增性进行筛选

摸索PCR反应体系和扩增条件，确定以下程序进行扩增。

25µl反应体系：30 ng DNA 样品，2.0 mM MgCl2，0.2 mM dNTP，0.1 µM引物，1.0U Taq DNA 聚合酶，1 × PCR缓冲溶液。

扩增条件：94℃预变性2.5min，随后94℃30s，45℃～60℃（依引物的退火温度而定）30s，72℃30s，循环30～40次，最后在72℃延伸20 min。（可根据自己的实验改变反应条件）

利用以上扩增产条件，选取三个居群的三个体，对引物的可扩增性进行筛选，并经1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

（2）利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对引物的多态性进行筛选

试剂配制：

8%非变性聚丙烯酰胺凝胶配制（25ml）：15ml的去离子水H2O，5ml 的5×TBE，5ml 的40%（W/V）聚丙烯酰胺溶液，180ul的10%（W/V）过硫酸铵（APS），16 ul的TEMED。

5×TBE的配制：54g的Tris base，27.5g的硼酸，20ml0.5 mol/L的EDTA，最后定

容至1L。

40%（W/V）聚丙烯酰胺的配制（100ml）：38.5g丙烯酰胺（Acrylamide），1.5g甲叉双丙烯酰胺（Bis-acrylamide），加100ml去离子水搅拌溶解，棕色瓶4℃保存。

10%（W/V）过硫酸铵（APS）的配制（20ml）：2gAPS加20ml去离子水后搅拌溶解，于4℃保存，可保存2周，超过期限会失去催化作用。

实验步骤：顺序安装聚丙烯酰胺凝胶电泳仪各部件，灌胶并凝聚2小时。在电压105V，电流43mA条件下电泳3.5个小时，取下凝胶并进行以下步骤。

（1）固定10分钟，后水洗1次。（固定液：360ml水，40ml乙醇，2ml乙酸）

（2）银染3-10分钟，后水洗1次。（银染液：400ml水，4ml 20%AgNO3）

（3）脱色15-60秒，后水洗2次。（脱色夜：400ml水，80 ul 10%Na2S2O3）

（4）显影10分钟。（显影液：360ml水，40ml 15%NaOH，甲醛1ml）

（3）再对筛选出的多态性引物用软件进行评价。

我用的是GENEPOP V.3.4 (http://genepop.curtin.edu.au/)在线软件对微卫星位点水平、居群水平以及全局水平是否偏离哈迪—温伯格平衡进行检测。

利用FSTAT V.2.9.3软件检测连锁不平衡存在与否。剔除存在连锁不平衡的引物对的其中之一，最终挑出7-10对扩增率高且稳定的引物用于后续试验。