LC-MSMS 定量分析优化技巧

Opportunities in the Services and System Solutions Market离子化方法选择：根据样品性质确定离子化方式适合ESI(IS)的样品类型：–高极性化合物、蛋白质、肽类、低聚核苷酸等生物分子；–胺类、季铵盐等；–含杂原子的化合物，如氨基甲酸酯等适合APCI的样品类型：–弱极性/中等极性的小分子，如脂肪酸，邻苯二甲酸等–含杂原子的化合物，如氨基甲酸酯、脲等ESI不适合的化合物：极端非极性化合物如苯等；APCI不适合的化合物：非挥发性样品、热稳定性差的样品3Date |AB CONFIDENTIAL©2006 Applied BiosystemsOpportunities in the Services and System Solutions Market离子化方法选择：一般情况下●碱性化合物宜用正离子方式●酸性化合物宜用负离子方式●不明确的化合物，优先试用正离子方式●如未知，可能正、负都要试●有些化合物正、负模式都出峰，选择灵敏度高的方式，4Date |AB CONFIDENTIAL©2006 Applied Biosystems2

Opportunities in the Services and System Solutions MarketLC条件的选择：●根据化合物类型选择流动相组成，甲醇-水，乙腈-水或甲醇-乙腈-水●某些化合物只有某种流动相体系才出峰●一般正离子方式用甲醇，负离子方式用乙腈好些●通常有机相比例高些，离子化效率高●梯度的设定：梯度变化太快对离子化效率影响很大，相应源参数也应该改变，所以当恒定比例流动相(即等度分离)能满足分离分析要求时，尽量不用梯度，尤其定量分析时●有时，流动相中加入微量的甲酸或乙酸铵等，可提高正离子化效率5Date |AB CONFIDENTIAL©2006 Applied BiosystemsOpportunities in the Services and System Solutions MarketLC条件的选择：●是否加酸不是绝对的，具体应根据LC的分离情况、样品在酸性条件下的稳定性等决定●通常pH值低时，[M+H]+比率高；pH值高时，[M+Na] + 、[M+K]+，或[M+NH4] +比率会比较高●定性分析时，有时加一些NH4+，Li +等，可帮助确定判断母离子，对碎片较少的化合物，可以增加其质谱特征性，但会使生物大分子的质谱复杂化。●水的选择：娃哈哈纯净水比普通蒸馏水好，若在玻璃瓶中已存放时间太长，有可能变质。当本底增大，LC压力增高，应更换水相●在色谱柱和MS允许情况下，LC流量适当提高，可以压缩峰宽，使峰强度提高。6Date |AB CONFIDENTIAL©2006 Applied Biosystems3

Opportunities in the Services and System Solutions MarketLC条件的选择●溶解样品的溶剂：用与流动相相同的溶剂体系做溶剂，一般水含量较高时，峰形好，通常含水量80～90％。如果常用的流动相体系不能很好地溶解样品，可用少量特殊溶剂先将样品溶解后，再用流动相稀释。●当只有粗色谱柱，只能用大流量时可采用三通分流，以适应MS的流量要求。●选细色谱柱，如内径2mm，进样量可以小，提高相对浓度，离子化效率，灵敏度。●换长些的色谱柱，对定性分离效果好，但分析时间延长，如峰形仍不理想，可考虑另选其他型号色谱柱。●柱后补偿：当不得不用高浓度TFA时，可在柱后添加异丙醇，缓解信号抑制问题。柱后衍生化，有时可增加离子化效率。7Date |AB CONFIDENTIAL©2006 Applied BiosystemsOpportunities in the Services and System Solutions Market调机准备●仪器平衡时间：有条件时尽可能长些，对分析有利。平衡时需平衡的因素有真空、温度、LC流动相比例等。●容器污染：塑料离心管很容易混入添加剂，尤其是被有机溶剂浸泡时间较长时，干扰物信号有时会超过待测物。●LC PUMP脱气，先放掉柱前部管路中液体，排净气泡，还要注意储液瓶液面高度。8Date |AB CONFIDENTIAL©2006 Applied Biosystems4

Opportunities in the Services and System Solutions Market仪器参数的优化●CAL先校准，用PPG或一已知化合物检验，如偏差不大，可以不用做质量校准，但偏高偏低要心中有数。●先用浓度大约0.1-1 ppm的标样，通过Syringe Pump，以5-10 ul/min优化Compound项下面的参数，如DP、CE、EP、CXP及CAD等。●顺序：Q1 Scan –Product Ion Scan –MRM。9Date |AB CONFIDENTIAL©2006 Applied BiosystemsOpportunities in the Services and System Solutions Market仪器参数的优化●不同化合物参数有可能差别很大●接通LC用FIA优化其他参数及源位置，或接一个三通，样品仍由注射泵进入离子源，同时LC保持需要的流量，优化温度和Gas1及Gas2，CXP、CAD、EP优化后通常不用再改，在保证样品充分离子化的基础上，DP低些可使母离子丰度提高，总灵敏度相应提高●质量范围不要太宽，涵盖待测离子再增加20-30amu即可●采样时间适当长些可使噪声降低；当同时检测数十对离子时，MRM采样时间可以降至数十毫秒，而检测离子对不多时，每对离子可使用200毫秒左右10Date |AB CONFIDENTIAL©2006 Applied Biosystems5

Opportunities in the Services and System Solutions Market仪器参数的优化●母、子离子输入的质量数值要选准，要根据Q1 Scan及Product Ion Scan得到的结果输入，准确到0.1amu。当不能确定准确质量数时，可选待测质量数上下各0.1amu，同时数对离子进行优化，最终找出灵敏度最佳的一对离子。例如320.9-152.0、321.0-152.0、321.1-151.9…。●若样品较杂，同一化合物需要选择几对母、子离子，经进样实验找出哪对有干扰，去掉，保留不易受干扰的1～2对离子。●每对离子各参数分别设，如DP，CE，Time等，对较弱离子对，采样时间可适当长些。●手动运行Ramp进行参数优化，各参数分别优化，Step选小些，范围不用太宽，每个参数重复优化两次，以减小偶然误差。●手动优化效果比自动优化(Auto)效果好11Date |AB CONFIDENTIAL©2006 Applied BiosystemsOpportunities in the Services and System Solutions Market仪器参数的优化●根据LC流量和流动相组成确定温度Tem、Gas1及Gas2。当流量大，水相多时，温度及气流要大，但注意Gas2与Tem的关系。离子源喷雾位置是根据LC流量调节的，基本上流量固定，位置就固定。●喷雾电压太高有可能导致放电。●许多参数互相影响，需要耐心地反复细调，使信噪比得以改善。12Date |AB CONFIDENTIAL©2006 Applied Biosystems6

Opportunities in the Services and System Solutions Market清洗●做完含生物体液样品后，LC需多冲些时间，使吸附到色谱柱上的干扰物完全洗脱下来。●若本底高，清洗离子源喷雾针管和Orifice，喷雾针可拆下超声清洗，Orifice要用无尘纸沾溶剂擦。●清洗管路，可从源上拆下Peek管，或将源从仪器上取下，用Syringe Pump洗，换不同溶剂，极性、非极性、酸等轮番冲洗，最后用甲醇/水冲洗。13Date |AB CONFIDENTIAL©2006 Applied BiosystemsOpportunities in the Services and System Solutions Market清洗●清洗进样针、阀等。●用过含酸的流动相后，色谱柱、离子源都要用甲醇/水冲，延长仪器寿命。●做完MRM后，用手动使仪器处于Q1 Scan状态，降温，停大流量LC，最后关气，但管路中最好有些水，不要完全干。14Date |AB CONFIDENTIAL©2006 Applied Biosystems7

Opportunities in the Services and System Solutions Market其他可用方法●做纯标样分辨率可母、子离子都选Low，S/N提高一倍，而噪声并不增高，若复杂混合物，有基质干扰不宜选Low。●适当加大进样量。●浓缩样品，测定后再推算回原始浓度。●谱图平滑后可提高信噪比，可多次平滑。●负离子模式时，使用零级空气，有时比氮气灵敏度提高。●提高检测器电压。●当化合物很稳定不易产生碎片，可考虑采用Ar、Xe等原子量较大的气体，以增加碰撞能量。15Date |AB CONFIDENTIAL©2006 Applied Biosystems提高LC-MS/MS的灵敏度和重复性美国应用生物系统中国公司应用技术服务部8

Opportunities in the Services and System Solutions Market无信号诊断步骤●在需要工程师到达之前，首先说明出现此现象的时机，是正在工作时突然出现，还是一段时间没用仪器，开机后出现的，在此之前，动了仪器哪些部位，是某些扫描方式没有信号还是都没有信号。●例如MRM无信号，先看Q1、Q3有无信号，若Q1、Q3有，则通常是Analyst参数设置问题，若无信号，则继续下一步●看有无本底信号、有无电噪声，如有，则可能是离子源或软件问题。●检查真空，Q1 Scan方式，通常应该0.7-1.2x10-5torr之间，过好可能是Orifice堵塞，过差则可能是漏气或真空泵有问题。●电源电压是否超限，UPS显示正常否？●更换了离子源以后，高压线是否插好到位？喷雾电压设置正确与17否Date ?|AB CONFIDENTIAL©2006 Applied BiosystemsOpportunities in the Services and System Solutions Market无信号诊断步骤●管路有否堵塞，一节一节拆开测试，看通否，喷雾是否均匀，泵压是否过高，通常不接色谱柱，200ul/min流速，压力应不超过数十psi。进样管及Spray Tube堵塞：a. 用Syringe推：直线喷出——没有堵塞b. 若堵，取下用50水/50甲醇超声清洗c. 超声仍无效，更换进样管及Spray TubeOrifice堵塞：现象：灵敏度下降或真空度异常的好处理方法：a. 50水/50甲醇清洗Orifice外部b. 不能解决问题时再清洗Orifice内部18Date |AB CONFIDENTIAL©2006 Applied Biosystems9

Opportunities in the Services and System Solutions Market无信号诊断步骤●若为APCI，检查流速是否过低（如没接LC，只用注射泵），放电尖端对正方向没有，放电电流是否加上?●若为APPI，有没有通甲苯？●若为NanoSpray，针尖碰断了没有? 高压放电烧坏或样品堵塞针尖，外涂金属层被磨掉，加不上高压，需提高喷雾电压才有信号等，都要更换新的喷雾针。●有无气泡，注射针里面，LC流动相管路是否有空气，流速低时多等一会儿，可手推一下注射针，帮助液体快速到达喷雾针。●诊断软件的使用要在工程师指导下进行，一定要Offline●在工程师指导下用万用表测量各点电压值，判断故障点。19Date |AB CONFIDENTIAL©2006 Applied BiosystemsOpportunities in the Services and System Solutions Market灵敏度低●首先按照无信号处理方法检查。●Orifice 脏也可引起真空变差，当Curtain Gas很高才好，说明脏了，清洗。●机械泵油半年以上没换，或颜色加深——换油低于刻度下限——补充，注意要用相同型号的油。●管路漏液，样品没有完全进到离子源里。●管路部分堵塞，喷雾时断时续。20Date |AB CONFIDENTIAL©2006 Applied Biosystems10

Opportunities in the Services and System Solutions Market灵敏度低●先调出安装仪器时的PPG等方法，用注射泵Syringe Pump，进PPG看看，CAL漂移否，若CAL不对，造成质量数无法选准，此时应重新校准仪器后再建方法。●若注射泵采集标准品正常，则再看样品，然后用Reserpine等标准品，接通LC，如果有手动进样阀，可从此处进样，看FIA有无峰，若无，则可能是LC及源参数设置问题。●如果正常，则排除MS，再自动进样，看FIA有无峰，若无，则可能是自动进样器问题。●若FIA正常，则再继续接上色谱柱采样，判断是色谱柱问题还是流动相问题。21Date |AB CONFIDENTIAL©2006 Applied BiosystemsOpportunities in the Services and System Solutions Market灵敏度低●离子化方式是否对路，如非极性物质用ESI效果会很差，而有机酸采用正离子方式也会信号很弱。●样品本身的问题，如样品没有完全溶解，导致实际浓度远低于表观浓度；所用溶剂与流动相不匹配等。●样品存贮时间过长，保存条件不好，被分解或吸附了。●放在自动进样器中的样品小瓶内套管底部有气泡，没取到样品，或针头位置太高，而样品液面太低。●前处理步骤中，标准品、内标样品是否加进，提取过程中有无遗洒。●离子对质量数输入准确否，有无错误？●离子抑制：改变前处理方法或LC梯度，或换成APCI也可以降低部分离子抑制效应。22Date |AB CONFIDENTIAL©2006 Applied Biosystems11

Opportunities in the Services and System Solutions Market重复性差●参考前面各步骤●Curtain Gas太低，有周期性降低现象。●Dwell Time太长，每个色谱峰采样点太少(至少十几点)，但Dwell Time太短会使噪声提高，而导致信噪比下降。●新色谱柱没有充分平衡；旧色谱柱老化，重新清洗活化，或者更换。●离子对的选择有问题，如M+Na做为母离子不稳定，子离子若为脱水峰亦不太好。●源温度太高，导致样品分解。23Date |AB CONFIDENTIAL©2006 Applied BiosystemsOpportunities in the Services and System Solutions Market重复性差●加样前与标液分别平行做处理，观察有无区别，若标准品溶液无问题，而样品重复性差，则问题可能出在基质的干扰或前处理方法不当。●稀释或配制样品用的移液、移液管、容量瓶等有无问题。●某些样品正离子改为负离子，有时会减少干扰，重复性会好些。●样品管中吸附，尤其低浓度，不成线性，如氨基糖甙，-加些甲酸或乙酸，减少吸附。●溶解样品一定要用流动相，如果不同，例如甲醇溶液，流动相是乙腈/水，出峰乱，某些化合物稀释时残存的甲醇都会有影响。●梯度洗脱后平衡时间不够，或脏东西没洗干净，累积使得，-彻底冲洗柱子。24Date |AB CONFIDENTIAL©2006 Applied Biosystems12

Opportunities in the Services and System Solutions Market重复性差●手动阀如果没问题了，再看自动进样器有无问题。●空调波动，与仪器在同一供电线路上，启动/停止会影响仪器真空，进而影响实验结果。●当液氮所剩不多时，及使用钢瓶时，尤其应关注气压的变化。●流动相虽有在线脱气，但装入前超声脱气还是必要的。●Peek吸附，FIA时明显，例：四环素，甲醇溶液，乙腈/水：（0.1%乙酸）30/70，由开始时一个峰最后变为两个峰。另外保留时间也会改变，-充分冲洗管路。25Date |AB CONFIDENTIAL©2006 Applied Biosystems串联质谱的日常维护美国应用生物系统中国公司应用技术服务部13

Opportunities in the Services and System Solutions Market死机时处理方法：由于鼠标操作太快，打开窗口太多造成的死机，重启Analyst软件，正在采集的数据不会丢失，用CTRL-ALT-DEL，Windows任务管理器结束任务。尤其当采集数据时，实时查看谱图不要用箭头翻看前后一次的数据，可重新打开一个新的谱图。注意不要在一张谱图上过多次计算信噪比，本底范围也不要选择太宽。当Syringe Pump到头时（API2000，QTRAP，QSTAR），右下角图标变黄，须先点击Standby，再点击Ready。当由于HPLC的原因，如漏夜等引起图标变红，首先排除HPLC故障，并重新开关所有HPLC设备一次，待自检通过后，先Deactivate，再重新激活。ANalyst Services Stop，中断计算机与仪器通讯，本次采集的数据丢失。重启Windows-正在采集的数据会丢失。由于Exhaust排气管不通畅，引起图标变红，首先清理排气管，如果图标仍燃3是红色，有可能是阀憋住了，要打开Exhaust进气口，放气，然后再重新接好。27Date |AB CONFIDENTIAL©2006 Applied BiosystemsOpportunities in the Services and System Solutions Market以上步骤都失灵时，在C盘的Program Files—Analyst--Frimware中双击SCU21，按F4，Reset System Controller，等仪器主机上指示灯不再闪硕，重新进入Analyst。重装Analyst软件前，先将API Instrument中Instrument Data和Parameter Setting两个文件Copy出来，然后卸载Analyst软件，再重装，不要修复。还要用SCU21查看Frimware版本号，如不对要Download，参见软件安装说明。注意计算机用户名，不能有符号，只能是字母和数字，还要以管理员身份登陆。28Date |AB CONFIDENTIAL©2006 Applied Biosystems14

Opportunities in the Services and System Solutions Market当软件运行速度很慢，经常死机，可考虑增加计算机内存，但要DELL专用的。如果出现不能控制附加设备情况，检查是否需要加补丁程序，具体看Hotfix的说明。有时由于计算机的问题，引起软件工作异常，如提交后不采集数据等，试试重新编Method，Batch，Configuration。经常清理计算机磁盘碎片，定期查杀病毒，如果中毒太深，可能需要格式化硬盘。Analyst 1.4每次启动出现如图页面，点X即可。29Date |AB CONFIDENTIAL©2006 Applied BiosystemsOpportunities in the Services and System Solutions Market离子源和管路清洗及维护方法a. 每次做完样后用甲醇或流动相冲洗进样管直到样品信号回到基线b. 把离子源取下，用注射器推甲醇冲洗进样管，如果进过非极性样，可用丙酮，氯仿等其他有机溶剂冲洗，最后还要用甲醇再冲一遍。c. 把进样管放到甲醇中用超声波清洗d. 定期清洁Curtain Plate 及Orifice，不要用砂纸擦和针捅e. 基线不能靠冲洗下降时清洁离子源f. 禁止直接向Orifice喷雾g. 避免使用无机盐或其它难挥发的缓冲液h.当仪器过脏时，停机清洗Q030Date |AB CONFIDENTIAL©2006 Applied Biosystems15

Opportunities in the Services and System Solutions Market仪器日常维护方法a. 操作顺序是先开气，再加热，然后通液体进样，停止实验时要相反的顺序退出。b.退出软件及Standby前把仪器设定到Q1正离子模式c. 注射泵不要让它推到头d. 随时检查气压Curtain gas 压力0.35 –0.4 MpaExhaust gas压力0.35 –0.4 Mpa不能超限e. 定期更换或清洁空气过滤网f. 定期校正仪器g. 注意仪器后面的排气出口必须保持通畅。机械泵维护方法a.注意机械泵油的颜色，变深后换油，至少半年换一次b. 经常检查机械泵油液面正常位置，机械泵油的更换方法：首先关机，要在油处于温热状态下排出，加新油不要过多，刻度一半即可。31Date |AB CONFIDENTIAL©2006 Applied Biosystems16