・９４６・ 检验医学与临床２０１３年４月第ｌＯ卷第８期Ｌａｂ Ｍｅｄ Ｃｌｉｎ，Ａｐｒｉｌ ２０１３，Ｖｏ１．１０，Ｎｏ．８ ・论 著・ 人偏肺病毒Ｎ蛋白的原核表达及抗原活性的初步研究 刘爱玲 ，陆学东 ，王 琼。，贾 雪。（１．广东省深圳市宝安区龙华人民医院检验科 ５１８１０９；２．广东 医学院附属深圳福田人民医院检验医学部 ５１８０３３；３．北京协和医院中心实验室 １０００３２） 【摘要】 目的构建人偏肺病毒（ｈＭＰＶ）Ｎ蛋白（ｈＭＰＶ－Ｎ蛋白）的原核表达载体，研究其表达效果，为）临床抗 体检测及预防提供基础资料。方法 根据ｈＭＰＶ－Ｎ基因的全序列设计引物，扩增目的基因片段，连接质粒栽体 ＲＳＥＴ—Ａ，转化大肠埃希茵ＢＬ２１，ＩＰＴＧ诱导以ｈｉｓ为标签的目的蛋白表达，并用人血清进行检测。结果 重组质粒 转化诱导后，出现了与预期分子量相符的蛋白条带；采用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ方法，检测了１０２份呼吸道感染住院患儿血 清标本中的抗ｈＭＰＶ－Ｎ蛋白ＩｇＧ抗体，阳性率为５３．９ 。结论检测奠定基础。 成功获得了ｈＭＰｖ＿Ｎ蛋白的表达，为临床血清学 【关键词】人偏肺病毒； Ｎ蛋白； 原核表达； 免疫印迹 ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－９４５５．２０１３．０８．０１６ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－９４５５（２０１３）０８—０９４６—０３ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｈＭＰＶ Ｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＩＵ Ａｉ—ｌｉｎｇ ，ＬＵ Ｘｕｅ—ｄｏｎｇ。．ＷＡＮＧ Ｑｉｏｎｇ ，Ｊｍ Ｘｕｅ。（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｎｇｈｕａ Ｐｅｏｐｌｅ ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５１８１０９，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｆｕｔｉａｎ Ｐｅｏｐｌｅ＇ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５１８０３３，Ｃｈｉｎａ；３．Ｃｅｎｔｒａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｈｏｓｐｉ— ｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００３２，Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｈＭＰＶ Ｎ ｇｅｎｅ ａｎｄ ａｎｓｌｙｚｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ，ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ｂａｓｉｃ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ Ｎ ｇｅｎｅ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＲＴ—ＰＣＲ ａｎｄ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ＲＳＥＴ—Ａ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓ ｍｉｄｓ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｉｎｔｏ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２ １，ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ＩＰＴＧ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂａｎｄ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｂｙ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ．Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｏｆ １０２ ｓｅｒｕｍ ｓａｍｐｌｅｓ ｗａｓ ５３．９ ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｈＭＰＶ Ｎ ｐｒｏ— ｔｅｉｎ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ，ｗｈｉｃｈ ｗｉｌｌ ｂｅ ｈｅｌｐｆｕｌ ｆｏｒ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａ１ ｔｅｓｔｉｎｇ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ｈＭＰＶ； Ｎ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ； Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ 人偏肺病毒（ｈＭＰＶ）是２００１年荷兰学者ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｏｇｅｎ 等［１ 在长达２０年的研究中从呼吸道感染儿童鼻咽分泌物标本 中分离鉴定出的一种新的呼吸道病原，基因组序列分析和基因 ＰＣＲ酶复合物；Ｔ４ ＤＮＡ连接酶（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司）；ＴＯＰ１０、大 肠埃希菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（天根生物技术有限公司）；ＲＳＥＴＡ载 体（厦门大学惠赠）；性核酸内切酶ＢａｍＨ １和ＥｃｏＲ Ｉ（美 国Ｐｒｏｍｅｇａ公司）；抗Ｈｉｓ标签单抗（北京Ｓｉｎｏｐｃｒ有限公司）； 抗鼠ＩｇＧ—ＨＲＰ（美国Ｓｉｇｍａ公司）；显色试剂盒（北京宜安泰医 疗技术公司）。 结构分析将该病毒归于副黏病毒科肺病毒亚科偏肺病毒属。 其基因组ＲＮＡ长约１３ ０００个核苷酸（ｎｔ），主要含有８个基 因，编码９个蛋白，顺序为３＇－Ｎ—Ｐ—Ｍ－Ｆ－Ｍ２一Ｓ Ｈ— Ｌ一５ 。Ｇ 蛋白变异最大，但它参与病毒与宿主细胞之问的吸附作用，是 主要的中和抗原，可诱导保护性的特异性中和抗体ｌ２］。Ｎ蛋白 １．３引物设计参考ＧｅｎＢａｎｋ中ｈＭＰＶ基因序列及蛋白编 码序列位，用Ｐｒｉｍｅｒ５．０引物设计软件辅助设计扩增编码基因 全长的引物，引物５ 端引入酶切位点，分别以编码的蛋白命名 Ｎ。引物由上海生物工程公司合成。引物序列如下，ＮＦ：５． ＿ＧＣＧ ＧＧＡ ＦＣＣ ＧＣＧ ＡＴＧ ＴＣＴ ＣＴＴ ＣＡＡ ＧＧＧ ＡＴＴ Ｃ一３ ． 也町诱导机体细胞免疫应答，发挥病毒清除作用。因此，对 ｈＭＰＶ这两种蛋白质表达的研究有助于深入了解其致病机制 和进一步血清学诊断。 １材料与方法 ＮＲ：５＇－ＣＣＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＧＧ ＣＡＧ ＧＧＡ ＡＴＧ ＣＡＡ ＴＴＴ ＴＧＡ ＣＴＴ ＧＴ一３ ｌ ２３１ ｂｐ。 １．１ 标本采集 收集２００９年１月至２０１０年１ｏ月深圳市福 田人民医院及汕头大学医学院第二附属医院儿科呼吸道感染 住院患儿鼻咽抽吸物１ １３７例。患儿入院后２ ｈ用一次性吸痰 １．４ ｈＭＰＶ核酸的提取 用Ａｘｙｇｅｎ体液病毒ＤＮＡ／ＲＮＡ小 量提取试剂盒提取病毒核酸，严格按照说明书操作，核酸洗脱 液在６５。Ｃ预热，提高洗脱效率。 １．５ Ｎ全基因片段扩增及纯化选取筛查并确定为阳性的 管吸取鼻咽抽吸物（ＮＰＡ）２～３ ｍＬ于病毒保护液中（ｉ００ ｕ／ ｍＬ青霉素，１００ Ｕ／ｍＬ链霉素，２ ０００Ｕ／ｍＬ两性霉素Ｂ），置 ８０℃冰箱冻存备用。解冻后置螺旋振荡器振荡混匀， ｈＭＰＶ作为扩增模板，反应体系按照试剂盒说明书配置，反应 条件：５Ｏ℃３０ ｍｉｎ；９５℃１５ ｍｉｎ；９４ Ｃ ４５ ｓ，５５ Ｃ ４５ ｓ，７２ Ｃ １３ ４００ ｒ／ｍｉｎ离心２０ ｍｉｎ，取沉淀２００￣Ｉ 提取病毒核酸。另 外，采集患儿血清标本１０２份，健康儿童血清标本５３份。采样 均获患儿家属签字同意。 １ ｍｉｎ，４０个循环；７２℃１０ ｍｉｎ。将上一步反应液稀释１００倍， 取１ Ｉ 作为模板，加入１ｏ×含有镁离子的高保真ＰＣＲ缓冲液 ２．５“Ｉ ，ｌ０ ｍｍｏｌ／Ｉ ｄＮＴＰ ｍｉｘ ０．５“Ｌ，Ｐｒｉｍｅｒ—Ｆ ０．３ Ｉ Ｐｒｉｍ １．２试剂 Ａｘｙｇｅｎ体液病毒ＤＮＡ／ＲＮＡ小量提取试剂盒； ＡｘｙＰｒｅｐ ＤＮＡ凝回收剂盒（美国Ａｘｙｇｅｎ公司）；Ｏｎｅ—ｓｔｅｐ逆 转录一聚合酶链反应（ＲＴ—ＰＣＲ）试剂盒（ＱＩＡＧＥＮ）；高保真 ｅｒ－Ｒ ０．３ Ｉ ，高保真ＰＣＲ酶复合物０．２ Ｉ ，无核酸酶的纯水 ２０．２ Ｌ（冰上操作），总体积２５ Ｌ。反应程序：９４℃３ ｒａｉｎ； ・９４８・ 检验医学与临床２０１３年４月第１Ｏ卷第８期Ｌａｂ Ｍｅｄ Ｃｌｉｎ，Ａｐｒｉｌ ２０１３，Ｖｏ１．１０，Ｎｏ．８ 色后可看到与预期大小一致的条带，见图４。 ２．５人群血清抗体检测 用原核表达的ｈＭＰｖ＿Ｎ蛋白对小 于２岁患儿血清标本及健康儿童血清５３份进行ＩｇＧ检测，结 果见图５；患儿血清阳性率为５３．９ （５５／１０２），健康儿童的阳 性率为２３．８ 。 ３讨 论 参考文献 ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｏｇｅｎ ＢＧ，ｄｅ Ｊｏｎｇ ｊｃ，Ｇｒｏｅｎ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ａ ｎｅｗｌｙ ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｙｏｕｎｇ ｃｈｉｌ— ｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｄｉｓｅａｓｅ －ＩＪ］．Ｎａｔ Ｍｅｄ，２００ １，７ （６）：７１９－７２４． Ｇｒａｙ ＧＣ，Ｃａｐｕａｎｏ ＡＷ，Ｓｅｔｔｅｒｑｕｉｓｔ ＳＦ，ｅｔ ａ１．Ｈｕｍａｎ ｈＭＰＶ生长缓慢，在宿主细胞复制十分困难，因此，要得到 大量的目的蛋白，必须利用基因工程方法对目的蛋白进行表 ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ，Ｐｅｒｕｌ，Ｊ］．Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２００６，１２ （２）：３４７—３５０． Ｉｔｏ Ｗ，Ｋｕｒｏｓａｗａ Ｙ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓ 达。目前，大肠埃希菌的遗传背景及基因表达规律的研究较为 清楚，并且有大量可供选择利用的克隆和高效表达的载体和宿 主菌，因此大肠埃希菌表达系统是目前最常用的原核表达系 统 ］。外源基因在大肠埃希菌中的正确表达受多种因素的影 ｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｔｈａｔ ｅｘｐｌｏｉｔｓ ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｇｅｎｅ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉ０ｎＬＪ］． Ｇｅｎｅ，１９９２，１１８（１）：８７—９１． ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｏｇｅｎ ＢＧ，Ｈｅｒｆｓｔ Ｓ，Ｓｐｒｏｎｇ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ 响，载体的选择至关重要。本研究根据目的基因和候选载体的 酶切位点及序列，将目的基因克隆入含有Ｔ７启动子带有Ｈｉｓ 标签的融合表达载体ＲＳＥＴＡ中，并用ＩＰＴＧ诱导其表达。 ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓｅｓ Ｆ－Ｊ］． Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２００４，１Ｏ（４）：６５８—６６６． Ｂａｓｔｉｅｎ Ｎ，Ｌｉｕ Ｌ，Ｗａｒｄ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ 基因变异对病毒在人群中的传播很重要，又给疫苗的研发 带来了困难。ｈＭＰＶ的Ｎ基因相对保守，而Ｇ蛋白基因变异 较大，其结果是致核苷酸替换、插入和转录终止密码的改 变 。因此，作者选用Ｎ蛋白为靶基因，发现Ｎ蛋白的表达 ］ ］ ］ ］ ］ ］ Ｇ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１，２００４，４２（８）：３５３２—３５３７． Ｐｅｒｅｔ ＴＣ，Ａｂｅｄ Ｙ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＬＪ，ｅｔ ａ１．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｏｌｙｍｏｒ— ｝二Ｉ ｏｔ检测比较稳定，及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌ为下一步实验改进打下基础。 ［ ［ ［ ｐｈｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ Ｇ ｇｌｙｃｏ— ］ ］ 文献报道儿童５岁时多数已经感染过ｈＭＰＶ，大于５岁儿 童的抗ｈＭＰＶ ＩｇＧ抗体水平大于９Ｏ 。多数ｈＭＰＶ的感染 发生在小于５岁的儿童，严重感染则发生在２岁以下儿童［７伽。 利用本研究表达的Ｎ蛋白检测２岁以下儿童血清抗ｈＭＰＶ ｐｒｏｔｅｉｎ１－Ｊ］．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，２００４，８５（Ｐｔ ３）：６７９—６８６． Ｅｓｐｅｒ Ｆ，Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｏ ＲＡ，Ｂｏｕｃｈｅｒ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ａ １一ｙｅａｒ ｅｘｐｅ— ｒｉｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ａｇｅｄ＜５ ｙｅａｒｓｌ＇Ｊ］．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２００４，１８９（８）：１３８８—１３９６． Ａｂｅｒｌｅ ＪＨ，Ａｂｅｒｌｅ ＳＷ，ＲｅｄｌｂｅｒｇｅｒＦｒｉｔｚ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ ｓｕｂｇｒｏｕｐ ｃｈａｎｇｅｓ ａｎｄ ｓｅａｓｏｎａｌｉｔｙ ｄｕｒ— ＩｇＧ抗体，结果显示阳性率为５３．９ ，低于文献［７—８］所测值， 提示２岁以下儿童是易感人群，亦不排除抗体间交叉反应的存 在。健康对照组为２３．８ ，说明有部分感染者可能无临床症 状或症状较轻。 ｉｎｇ ｅｐｉｄｅｍｉｃｓｌ，Ｊ］．Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｊ，２０１０，２９（１１）：１０１６一 】０】８． 综上所述，本研究利用原核表达系统成功获得了目的蛋白 的表达，并初步应用于人群血清抗体检测，为今后的相关研究 奠定了基础。 （收稿日期：２０１２—１１－１８修回日期：２０１２ １２ ２８） （上接第９４５页） 舒仪经，阚秀．癌症早期诊断现代技术细针吸取细胞病理 学［Ｍ］．北京：人民卫生出版社，２０００：１４６—２２０． 马正中，阚秀，刘树范，等．诊断细胞病理学［Ｍ］．郑州：河 南科学技术出版社，２０００：４７１． 轻度增多，有可能误认为分化好的癌；部分乳腺增生症和导管 内乳头状瘤伴上皮不典型增生的病例细胞具有一定的异形性， 容易导致误诊。（３）诊断仅仅局限于细胞学表现，没有结合肿 块大体特点、穿刺表现和临床病史。 ３．３ ＦＮＡＣ的诊断体会 （１）严格执行ＦＮＡｃ“一体化”工作 程序，针吸、制片、诊断均由专人完成 ｊ。（２）详细询问病 史，仔细触摸乳腺肿块及腋下，对高危患者要高度重视；观察乳 王永才，钟寸荻，王寰，等．乳腺针吸细胞病理学对乳腺癌 早期诊断研究应用ＥＪ］．医学研究杂志，２００７，３６（２）：８５— ８７． 高志奇，刘锦程，付小伟，等．乳腺实质性肿块针吸细胞学 的诊断价值ＥＪ］．现代肿瘤医学，２００６，１４（７）：８３９—８４０． 孙新平，孙华，温鸿清．细针吸取细胞学检查乳腺肿块９１ 房皮肤及乳头状况，认真触诊。（３）针吸时要注意体会针吸感 觉，观察针吸物的性状，肿块大时可多方向穿刺，以获取不同部 位足量的材料。（４）采集最佳针吸材料均匀涂片，避开坏死部 位，血液或黏液多时应取灰白色颗粒状物涂片，弹击出针头内 例临床分析ｌ－Ｊ］．现代肿瘤医学，２００６，１４（４）：４１５－４１６． Ｄｕｔｔａ ＳＡ，Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ Ａ，Ｒｏｙ Ｓ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｎｅ ｎｅｅｄｌｅ ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｐｒｉｎｔ ｃｙｔｏｌｏｇｙ ｉｎ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｄｉａｇ ｎｏｓｉｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｌｅｓｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ１ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ 积存的抽吸材料尤其重要。（５）涂片厚薄应适当而均匀，减少 人为的细胞变形，尽量要多涂片，以免遗漏掉有意义的细胞。 （６）阅片要仔细观察和比较，严格掌握诊断标准，避免单纯依照 上皮细胞分化进行诊断分级的片面性＿９］。（７）所有细胞学检查 及时与组织活检对照、随访患者、与临床医生沟通，及时分析漏 误诊原因，复阅细胞学涂片，总结经验，做好质量控制。 参考文献 ｒＪ］．Ｊ Ｉｎｄｉａｎ Ｍｅｄ ＡＳＳＯＣ，２００１，９９（８）：４２１ ４２３． 张春雨，闫云珍，赵鹏飞．７８例乳腺肿块细针吸取细胞学 检查分析ｌ－Ｊ］．中国实验诊断学，２０１１，１５（１２）：２１０１—２１０２． 余小蒙，王卫东，张长淮，等．对乳腺肿物针吸细胞学诊断 标准的探讨［Ｊ］．中华病理学杂志，２００２，３１（１）：２６—２８． １－１１任美英，王翠峰，徐军．细针穿刺细胞学在乳腺肿块诊断 中的应用Ｉ－Ｊ３．检验医学与临床，２０１１，０８（７）：８４９—８５０． （收稿日期：２０１２一１０—０９修回日期：２ｏ１２—１２ ２８）
